贵州省两个结核病监测点RFP和INH耐药基因检测与分析

目的应用分子生物学技术对贵州省威宁县和仁怀市2个结核病省级耐药监测点2018年确诊结核病患者感染结核分枝杆菌(MTB)RFP和INH耐药基因进行检测与分析,为结核病的防治提供参考数据。方法采用半巢式全自动实时荧光定量PCR结合PCR-线性杂交酶显色法对威宁县和仁怀市97例确诊结核病患者的痰培养物进行MTB核酸及利福平(RFP)和异烟肼(INH)耐药基因检测,分析结核病患者性别年龄构成。结果威宁县52份痰培养物样品经半巢式全自动实时荧光定量PCR检测出MTB核酸阳性49份,阳性率94.23%,RFP耐药基因阳性3份,RFP耐药率为6.12%。对RFP耐药基因阳性标本进行菌株分离培养和PCR-线性杂交酶显色检测,结果显示其中1株为RFP和INH双重耐药,双重耐药率为2.04%;仁怀市45份样品经半巢式全自动实时荧光定量PCR检测出MTB核酸阳性33份,阳性率73.33%。对RFP耐药基因阳性的2份标本进行菌株分离培养和PCR-线性杂交酶显色检测,结果显示RFP和INH耐药基因均阳性,双重耐药率为6.06%。患者性别构成分析结果显示,威宁县结核病患者男女比例为1.9∶1,仁怀市为1.6∶1,均为男多于女。患者年龄段分析显示,以青年及中年(18-65岁)多见,威宁县占86.53%(45/52),仁怀市占75.56%(34/45)。结论威宁县结核病患者感染MTB RFP耐药率6.12%,RFP和INH双重耐药率为2.04%;仁怀市结核病患者感染MTB RFP耐药率为6.06%,RFP和INH双重耐药率为6.06%。两地患者中均呈现男多于女,且以青年及中年占多数,结果可为当地结核病的防治提供参考依据。     

荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性的价值北大核心CSCD

目的分析南京市结核分枝杆菌(MTB)感染患者的耐药情况,评价荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌对利福平(RFP)和异烟肼(INH)耐药性的临床价值,探究RFP和INH耐药相关基因突变的特征。方法对鉴定为MTB的780株菌株同时进行绝对浓度法药物敏感性试验和荧光PCR熔解曲线法检测对RFP和INH的耐药性。以绝对浓度法药物敏感性试验结果为标准,分析熔解曲线法检测RFP和INH的灵敏度、特异度、符合率和一致性(Kappa检验)。结果780株MTB中,22株(2.82%)为RFP单耐药,62株(7.95%)为INH单耐药,143株(18.33%)为耐多药。以绝对浓度法药敏试验结果为标准,荧光PCR熔解曲线法检测MTB对RFP和INH耐药性的灵敏度分别为98.18%和85.85%,特异度分别为95.28%和97.39%,符合率分别为95.90%和94.36%,Kappa值分别为0.88和0.85。RFP分子耐药菌株中全部检测出rpoB基因位点突变,其中以rpoB 529~533位点为最常见的突变(63.87%,122/191),突变位点为rpoB 507~512的20株菌株中只有7株表型耐药,rpoB基因双位点突变的18株菌株全部表型耐药;INH分子耐药菌株中最常见的突变为katG 315位点(66.49%,127/191),其次是inhA启动子区(17.80%,34/191),90%以上的INH分子耐药菌株为表型耐药。结论南京市结核耐药情况严重,以耐多药结核病为主。荧光PCR熔解曲线法与药敏试验结果高度一致,且弥补了药敏试验对于低度耐药突变株菌检测的局限性。耐药相关基因突变位点的检测有利于结核病的及时诊断和个体化治疗的实施。     

新乡地区结核分枝杆菌利福平耐药株基因型研究北大核心CSCD

目的分析新乡地区结核分枝杆菌利福平耐药株基因型,为控制耐药性发展与耐药株传播奠定基础。方法收集患者痰液样本370例,鉴定结核分枝杆菌。对菌株进行耐药性分析及rpoB基因扩增及测序,分析耐药株基因型。结果370例新乡地区患者中分离174株结核分枝杆菌,分离率为47.03%。其中,2016-2018年各分离结核分枝杆菌29、63和82株,分离率为36.25%、45.32%和54.30%。2016年29株结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、链霉素、氧氟沙星的耐药率分别为48.28%、44.83%、34.48%和27.59%;2017年63株结核分枝杆菌耐药率分别为61.90%、47.62%、38.10%、26.98%;2018年82株结核分枝杆菌耐药率分别为70.73%、57.32%、39.02%和35.37%。111株利福平耐药的结核分枝杆菌中,87株发生rpoB基因变异,基因突变率为78.38%。其中Ser→Leu在521位点突变58株(52.25%)和His→Leu在526位点突变22株(19.82%)是主要基因突变类型。此外,有24株(21.62%)未发生变异。结论2016-2018年新乡地区患者结核分枝杆菌分离率逐年增高。结核分枝杆菌对利福平耐药率最高,且逐年增高。利福平耐药株的耐药性产生的主要机制是rpoB基因发生位点突变。     

耐药结核病的诊断:检测的可靠性和即时性

随着耐多药结核病(MDR-TB)的出现,全球都迫切需要快速药敏试验方法。国家结核病防治规划(NTPs)可能发现很难从各种变化多样的快速检测方法中选择合适的方法。我们对最重要的方法进行综述,讨论他们的优点和缺点,侧重那些可以替代商品化系统的方法,以及基因检测技术。表型和基因型药敏试验之间的关系的仍然存在问题,原因是除了对以前已研究标准化的表型的药物敏感试验外,我们关于耐药性突变的认识仍不充分。由于某些耐药菌株生长延迟,以快速生长为基础的药敏试验准确性较差。为了实现理想的耐药监测和耐多药结核病的管理,同时使实验室的工作不超负荷,需要慎重考虑检测的适应症和可疑者的界定,同时良好的显微镜依旧非常重要并且是个挑战。迄今研究较少的醋酸荧光素活性染色技术可能提供解决办法,协调早期检测和对快速药敏试验的合理的预选择。关于方法的选择,从覆盖所有人群的前景出发,应该考虑方法的适用性和敏感性。只有推广简单、低要求的方法,或者中心化的基因型药敏试验替代,但要确保标本运输程序简单才是可行的。由于不需要原代分离培养物,药敏试验结果报告时间的轻微差别相对不重要。没有任何一种检测是绝对准确的,合理的预选择可能允许使用准确度稍差但是简单的筛查...     

耐药结核病的流行和监测

20世纪抗结核病药物相继问世，使结核病的治愈成为可能，但随之出现了结核分枝杆菌的耐药性。染色体自发突变导致对某种抗结核病药物耐药的发生频率为10^-6～10^18，由于不同药物耐药的突变位点不同，同时使用3种抗结核药的同时耐药频率为10^-18-10^20。因此，联用3种有效的抗结核药物时，发生抗结核药物耐药的概率极少。从这一点出发，可以认为耐药的发生是结核分枝杆菌基因突变被人为放大的结果。不合理的用药、治疗管理不善、药物供应不足和质量不佳以及间断用药等，刺激结核分枝杆菌发生耐药性，即获得性耐药（acquired drug resistance）；随后，耐药结核分枝杆菌在人群中传播，发生耐药结核分枝杆菌感染，即原发耐药（primary drug resistance）；耐多药结核病（MDR-TB）是指至少同时对异烟肼和利福平耐药的结核病。     

31株结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因检测及序列分析

目的了解贵阳地区分离的结核分枝杆菌katG基因、inhA启动子和oxyR-aphc间隔区基因突变特征。方法对31株结核分枝杆菌临床分离株（异烟肼耐药株17株,异烟肼敏感株14株）的katG基因、inhA启动子和oxyRaphc间隔区进行DNA片段的PCR扩增,并进行测序分析。结果 17株异烟肼耐药菌株中有16株检出katG基因突变,其中70.5%（12/17）为315位密码子变异,且变异类型均为AGC→ACC,敏感株未发现315位点突变。11株敏感菌和4株耐药菌在463位密码子发生变异,变异类型均为CGG→TGG,变异率分别为78.6%（11/14）和23.5%（4/17）,差异无统计学意义。有12株耐药株的变异类型为katG基因双重位点突变,其中10株为katG315（AGC→ACC）和463（CGG→TGG）位变异,463（CGG→TGG）和299（GGC→AGC）变异及463（CGG→TGG）和419（GAC→CAC）位变异各1株。2株异烟肼耐药菌检出oxyR-aphC启动区G32A突变,其中1株为联合katG463和299位突变。结论贵阳株结核杆菌菌株异烟肼耐药基因突变具有多态性,主要的变异类型为katG315位点突变。     

耐多药结核病快速诊断试剂盒检测耐药结核分枝杆菌的评价

目的 评价用耐多药结核病快速诊断(GenoType MTBDRplus)试剂盒检测耐利福平、异炳肼MTB的效果.方法 选取75株MTB临床分离株,采用耐多药结核病快速诊断试剂盒检测其中的耐药MTB,评价其敏感度和特异度及可重复性,并与常规的药物敏感性试验方法相比较.结果 耐多药结核病快速诊断试剂盒对上海地区的MTB临床分离株中耐利福平和耐异烟肼菌株的敏感度分别为98.0%和86.5%,对敏感菌株的特异度为100%.而在重复性试验中,耐多药结核病快速诊断试剂盒多次结果完全一致,重复性达到100%.结论 耐多药结核病快速诊断作为快速检测耐药MTB的试剂盒,对耐利福平和耐异烟肼菌株具有较高的敏感度和特异度,在上海地区有较好的应用前景.     

结核分枝杆菌基因组变异及其耐药调查北大核心CSCD

目的调查结核分枝杆菌基因组变异及耐药情况,分析其耐药机制,以指导临床治疗。方法收集511例结核病患者痰液标本,进行结核分枝杆菌检查及鉴定。采用比例法进行药物敏感性试验;采用PCR扩增gyrA、katG、rpoB、rpsL基因,分析基因变异情况。结果共分离144株结核分枝杆菌,其对氧氟沙星、异烟肼、利福平、链霉素的耐药率分别为60.42%、52.78%、43.75%、36.81%。其中对氧氟沙星、异烟肼、利福平、链霉素低耐和高耐药率分别为36.11%和24.31%、33.33%和19.44%、13.19%和30.56%、4.86%和31.94%,药物低耐率与高耐率之间差异无统计学意义(P>0.05)。72株发生gyrA基因变异,基因突变率为82.76%。其中Asp→Gly在94位点突变39株(44.83%),Ala→Val在90位点突变21株(24.14%),Asp→Ala在94位点突变12株(13.79%)。另15株(17.24%)未发生基因变异。53株发生katG基因变异,基因突变率为69.74%。其中Ser→Thr在315位点突变43株(56.58%),Gly→Ser在299位点突变8株(10.53%),Ser→Gly在315位点突变2株(2.63%)。另23株(30.26%)未发生变异。49株发生rpoB基因变异,基因突变率为77.78%。其中Ser→Leu在521位点突变34株(53.97%),His→Leu在526位点突变13株(20.63%),Leu→Pro在533位点突变2株(3.17%)。另14株(22.22%)未发生变异。41株发生rpsL基因变异,基因突变率为77.36%。其中Lys→Arg在43位点突变37株(69.81%),Lys→Arg在88位点突变4株(7.55%)。另12株(22.64%)未发生变异。结论 gyrA、katG、rpoB、rpsL基因变异可能是导致结核分枝杆菌耐药性逐年增高的主要原因,应给予重视。     

对氨基水杨酸异烟肼对耐INH及PAS结核菌株的耐药实验观察

目的　了解对氨基水杨酸异烟肼 (PSNZ)对耐异烟肼 (INH)及对氨基水杨酸钠 (PAS)的结核菌株耐药情况。方法 用改良罗氏培养基观察36株同时耐INH和PAS及149株对INH和PAS敏感的结核菌株对PSNZ药敏结果。结果 36株耐INH和PAS的结核菌株在1μg/ml浓度下有44.4%的菌株对PSNZ有效,149株对INH和PAS均敏感的结核菌株在1μg/ml浓度下有96%的结核菌株对PSNZ敏感。结论 PSNZ对耐INH和/或PAS的结核菌株仍显示一定程度的敏感,是一种独立的抗结核药物,可作为治疗耐多药结核病的有效药物之一。     

基因芯片技术检测贵州省结核分枝杆菌耐药基因KatG和inhA

目的 了解本地区结核分枝杆菌(MTB)异烟肼(INH)相关耐药基因katG和inhA的突变特征,评价基因芯片法对MTB INH耐药性检测的临床应用价值。方法 应用基因芯片法对经PCR-荧光探针法鉴定为MTB阳性的2 738例病人标本进行INH耐药性检测,分析其相关耐药基因katG和inhA的突变特征,同时应用比例法检测上述同期送检的相同病人的同类型标本经罗氏培养MTB阳性菌株的INH耐药性,比较两种方法的检测结果。结果 2 738例MTB核酸阳性标本经基因芯片法检测,INH耐药465例,耐药率16.98%,其中以katG 315(AGC→ACC)突变为主,基因突变率为78.06%,其次为inhA -15(C→T),katG 315(AGC→AAC),突变率分别为16.13%和5.59%。上述病人同期送检的同类型标本有1 493例经罗氏培养MTB阳性,比例法检测,INH耐药255例,耐药率17.08%,对应的基因芯片法检测结果为INH耐药249例,耐药率16.68%。以比例法结果为判断标准,基因芯片法测定INH耐药性的敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)及准确性分别为85.49%、97.50%、87.55%、97.03%和95.45%。结论 本地区INH耐药以katG 315(AGC→ACC)和inhA -15(C→T)突变类型为主;基因芯片对MTB INH耐药性检测具有高敏感性、特异性、准确性和快速性,可用于本地区MTB INH耐药性的快速检测。     

结核分枝杆菌异烟肼耐药基因katG的检测

目的探讨结核分枝杆菌异烟肼(INH)耐药的分子机制,建立快速检测结核分枝杆菌INH耐药性的方法。方法应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测105株结核分枝杆菌临床分离株的katG基因,运用DNA测序和生物信息分析比对进行验证。结果以H37Rv标准株为对照,34株敏感株中5株(14.7%)存在KatG基因异常,105株耐药株中55株(52.4%)存在KatG基因异常。结论结核分枝杆菌对INH耐药与KatG基因突变有关,PCR-RFLP技术可快速、准确地检测结核分枝杆菌对INH的耐药性。     

结核分枝杆菌异烟肼耐药基因与耐药机制研究进展

因耐药甚至耐多药的结核分枝杆菌（Mycobac-terium tuberculosis,MTB）的感染,使原来可治愈的结核病变成难以治疗的致死性疾病。据WHO估计全球有5000万人感染耐药结核杆菌,其中中国最多,占到11％^[1-2],耐药性结核病的暴发流行已成为世界范围内的严重的公共卫生问题。最新研究发现,     

结核病黏膜疫苗的研究进展北大核心CSCD

呼吸道黏膜免疫是机体抵御结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染的第一道防线,是重要的抗MTB感染的保护性免疫,如何通过黏膜免疫,诱导黏膜免疫系统产生抗MTB感染的特异性免疫,是目前结核病疫苗研究的新方向。本文基于近年来结核病黏膜疫苗的研究,总结了不同类型疫苗的特点、黏膜免疫后的免疫学特性和免疫保护效果,展望了未来结核病黏膜疫苗的研究方向,希望能够对研发更加高效的结核病黏膜疫苗有所启示。     

利福喷汀治疗对利福平耐药结核病的探讨

结核分枝杆菌的耐药性是当前我国乃至全球结核病控制的主要难题之一，耐多药结核病(MDR-TB)是指至少同时对异烟肼和利福平耐药的结核分枝杆菌引起的疾病，利福平作为主要的抗结核药物，其耐药性的发生直接影响化疗方案的疗效。1994～1997年，     

噬菌体生物扩增法与改良罗氏比例法在结核杆菌药敏检测中的比较

目的 采用噬菌体生物扩增法(PhaB法)与传统比例法对结核分枝杆菌临床株进行利福平、异烟肼药物敏感试验，建立一种快速、敏感、特异、价廉的结核杆菌药敏试验方法。方法 分别采用噬菌体生物扩增法和改良罗氏比例法检测52株结核分枝杆菌临床株对利福平、异烟肼的敏感性，将二者结果进行比较。结果 比例法检测结果为利福平耐药株的34株中，噬菌体生物扩增法检测结果为32株耐药，2株敏感；18株敏感株中噬菌体方法检测结果为17株敏感，1株耐药。噬菌体方法检测结核菌对利福平的灵敏度为94．1％(32／34)，特异度为94．4％(17／18)，符合率为94．2％(49／52)。比例法检测为异烟肼耐药的38株菌中，噬菌体方法检测35株耐药，3株敏感；14株异烟肼敏感株中，噬菌体方法检测11株敏感，3株耐药。噬菌体方法检测异烟肼敏感性的灵敏度为92．1％(35／38)，特异度为78．6％(11／14)，符合率为88．5％(46／52)。结论 用噬菌体生物扩增法可快速、准确地检测结核分枝杆菌对利福平的敏感性，灵敏度高，与WHO推荐使用的比例法符合率高，可在48h得到结果。异烟肼耐药性检测用噬菌体方法的特异度不如利福平，有待进一步探讨其原因。     

线性探针技术快速检测肺结核耐药性临床研究

目的评价线性探针技术快速检测涂阳肺结核耐药性的可靠性和及时性。方法随机抽取我院收治的120例涂阳肺结核患者痰标本,同时采用线性探针技术和传统培养药敏试验两种方法检测异烟肼和利福平耐药性,以传统培养药敏试验结果为金标准,分析线性探针技术诊断耐药结核病的灵敏性、特异性和及时性。结果线性探针技术检测异烟肼的灵敏性和特异性分别为100%、98.98%;检测利福平分别为96.15%、98.94%;对耐多药的检出率18.33%。24小时内可得到报告。结论线性探针技术能快速检测异烟肼、利福平的耐药性,有利于耐药肺结核特别是耐多药肺结核的快速筛查和临床及时诊治。     

异烟肼与力克肺疾对结核菌耐药情况分析

目的了解结核分枝杆菌对抗结核药物异烟肼、力克肺疾的耐药情况。方法采用绝对浓度法对结核分枝杆菌作异烟肼、力克肺疾耐药性试验。结果3087株结核分枝杆菌的异烟肼、力克肺疾总耐药率为51.60%、13.12%。异烟肼与力克肺疾相比耐药率高,两者之间有显著差异(P0.01)。结论临床上可以选用力克肺疾替代异烟肼作为初治、复治、耐药结核病的治疗用药和结核病感染者预防用药。     

210株结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB突变特征研究

目的了解结核分枝杆菌利福平耐药株rpoB基因突变特点。方法对结核分枝杆菌临床分离株包括rpoB基因利福平耐药决定区(RRDR)81个碱基在内的286bp的片段进行PCR-SSCP分析,并对经检测显示有突变的结核分枝杆菌的rpoB基因此扩增区域进行序列测定。结果共对210株结核分枝杆菌临床分离菌株进行了研究,其中利福平耐药株110株,非利福平耐药株40株,敏感株60株。PCR-SSCP检测显示110株利福平耐药株中有75株有突变存在,经测序分析,77.3%(58/75)的菌株发生rpoB基因的单位点突变,主要集中在456位60.3%(35/58)和451位25.9%(15/58);22.7%(25/110)的菌株发生了联合突变。此外,经PCR-SSCP检测,40株非利福平耐药株中有3株发生突变,60株敏感株中有2株发生突变。经直接测序分析突变涉及位点为436位、451位和460位。结论结核分枝杆菌利福平耐药的主要原因是rpoB基因耐药决定区发生突变,其中456位丝氨酸和451位组氨酸是最常见的突变位点。     

铜陵地区结核病耐药特征的初步探讨

目的了解铜陵地区结核病耐药特征,为治疗耐药结核病提供科学依据。方法对结核病患者的标本采用BACT/ALERT 3D系统进行分枝杆菌培养,阳性者进行菌种鉴定,并采用改良罗氏(L-J)培养基按绝对浓度法对9种药物进行敏感试验。结果培养显示结核分枝杆菌复合群96株,耐药54例(56.3%)。单耐药26例(27.1%),耐多药(MDR)为9例(9.4%)。对初治、复治患者比较,发现耐利福平、利福喷丁、异烟肼及MDR率差别有显著性(P0.05)。结论我市结核病耐药率、耐多药率高;复治肺结核治疗困难。制定耐药结核病化疗方案时应注意乙胺丁醇、丙硫异烟胺、喹喏酮类药物的使用。     

结核病诊断T-SPOT.TB、Gene Xpert MTB/RIF技术应用价值研究北大核心CSCD

目的评估结核分枝杆菌及其利福平耐药株实时荧光定量核酸扩增(Gene Xpert MTB/RIF)和结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)在结核病诊断中的价值。方法分析2020年1月-2022年3月济宁市公共卫生医疗中心收治的住院及门诊病患者643病例的抗酸染色镜检、960液体培养、Gene Xpert MTB/RIF检测和结核抗体、T-SPOT.TB检测结果,评价Gene XpertMTB/RIF和T-SPOT.TB检测诊断结核病的特点和价值,以临床诊断为金标准,以检测方法的敏感度、特异度及绘制的ROC曲线等作为评价指标。结果抗酸染色、960快速培养和Gene Xpert MTB/RIF检测结核病的敏感度分别为21.57%、39.21%和59.80%,特异度分别为100.00%、97.22%和100.00%。ROC曲线分析显示,抗酸染色、960结核菌培养和Gene XpertMTB/RIF的AUC分别是0.60、0.70和0.80,差异有统计学意义(P<0.05);95%置信区间范围分别为0.50~0.70,0.61~0.78,0.73~0.87。T-SPOT.TB和结核抗体检测的敏感度分别为84.61%和70.19%,特异度分别为95.83%和79.16%。ROC曲线分析结核抗体与TSPOT检测的AUC分别为0.75和0.90,95%,置信区间范围分别为0.64~0.86和0.84~0.97。T-SPOT.TB和Gene Xpert MTB/RIF的阳性率分别为86.47%和36.60%。结论在结核病诊断中,Gene Xpert MTB/RIF和T-SPOT.TB检测结核病的敏感性高于痰涂片和痰培养检查及结核抗体检测,其中T-SPOT.TB检测的阳性率较高。Gene Xpert MTB/RIF和T-SPOT.TB均可应用于肺结核的临床诊断以提高肺结核的诊治效率。