重组结核分枝杆菌PPE17蛋白原核可溶性表达纯化和血清学诊断研究

目的利用原核系统可溶性表达结核分枝杆菌PPE17蛋白并进行纯化,研究其免疫学特性,并评价该重组蛋白在结核病血清学诊断方面的价值。方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中利用PCR扩增PPE17核酸序列然后克隆至融合表达载体pET-DsbC中,转入大肠埃希菌BL21(DE3)进行诱导、表达和纯化,用Western Blot和EL ISA方法进行抗原性初步评价。结果融合蛋白Ds-bC-PPE17在原核系统内经IPTG诱导表达后,主要以可溶性形式表达存在,经镍柱层析获得了纯的重组蛋白,纯度达95%以上。Western Blot和EL ISA方法结果证明重组DsbC-PPE17蛋白具有较强的抗原活性。用纯化的PPE17蛋白做抗原,临床诊断结核病人血清,阳性率达60%。结论融合蛋白DsbC-PPE17在大肠埃希菌中以可溶性表达形式存在,高纯度的重组融合蛋白有可能成为结核病的血清学诊断抗原。     

结核特异性抗体结合肽的筛选研究

目的 利用纯化的结核病患者血清IgG从噬菌体展示随机7肽库中筛选结核特异性抗体结合肽,为下一步开发新的结核病血清学检测试剂提供思路.方法 以纯化后结核病患者血清IgG作为固相配基,按吸附、洗脱、扩增的生物淘洗(简称淘选)过程对噬菌体展示随机7肽库进行筛选,并于第2至3轮的筛选中加入纯化后健康人血清IgG进行反筛,经过3轮淘选使噬菌体得到富集,分别从滴度测定平板上各个方位挑取结核病患者IgG和健康人IgG洗脱单噬菌体各20个进行扩增纯化,提取单链DNA作为模板进行测序,间接ELISA法检测不同单噬菌体与结核病患者和健康人IgG的结合情况,鉴定出阳性克隆.取收集的47份结核病患者和37份有卡介苗接种史的健康人血清标本,采用phage-ELISA法对获得的阳性单噬菌体进行初步验证,并对其中24份筛选用血清标本的检测结果进行分别统计.结果 通过3轮淘选,能与靶分子特异性结合的噬菌体得到明显富集.单噬菌体测序分析共获得12种共同序列.12种序列各取1个克隆扩增后进行间接ELISA检测,结果表明单噬菌体H12与结核患者IgG具有较高的亲和力(S/N≥2.1),确定为阳性克隆.间接ELISA检测发现,单噬菌体H12对47份结核病患者血清标本的检出值(0.105±0.010)明显高于对37份健康人的检出值(0.070±0.005),t=2.912,P<0.0001.对其中筛选用12份结核病患者和12份健康人血清标本的检出值分别为0.144±0.016、0.052±0.004,差异同样具有统计学意义(t=5.69,P<0.0001).结论 利用噬菌体展示随机肽库淘选获得了结核特异性抗体结合肽,显示出与结核病患者IgG较特异的结合活性,为以多肽为基础探索新的结核病血清学诊断方法提供了依据.

Abstract：

Objective To screen the specific antibody binding peptides of tuberculosis from phagedisplayed random phage display(Ph. D.)-7 peptide libraries with purified IgG from tuberculosis serum ,and to provide the basis for the development of serological detection reagent of tuberculosis. Methods Purified IgG of tuberculosis serum was used as solid ligand to screen the binding peptide from the Ph. D.-7 peptide library,according to the biopanning process of absorption, elution and amplification. Purified IgG of health people serum was used as the molecule of counter selection during the second and third selection. Phages were enriched after 3 rounds of screening, then 20 single phages separately eluted by IgG of tuberculosis and health people were randomly selected on each direction of the determination plates and amplified. The single chains DNA were extracted as template for sequencing. The combination abilities of selected clones to IgG of tuberculosis and health people were tested by indirect enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) ,and the positive clone was identified. Serum samples, from 47 patients with tuberculosis and 37 healthy people vaccinated with BCG, were verified by positive phage clones using phage-ELISA. The verifying results of 24 serum samples used for panning were separately analyzed statistically. Results After 3 rounds of panning, remarkable enrichment of phages that could specifically bind with target molecules were observed. Single phages were randomly selected for sequencing analysis and 12 sequences were obtained.12 phage clones with different sequences were amplified and detected with indirect ELISA and single phage H12 showed higher affinity with IgG of tuberculosis(S/N ≥2. 1)and was identified as the positive clone. It was found that,in indirect ELISA with singe Phage H12,the A450 value of tuberculosis patients (0. 105 ±0. 010) was significantly higher than that of healthy individuals (0. 070 ± 0. 005), and the t value was 2.912 (P< 0. 0001). The A450 value of 12 serum samples of tuberculosis patients and 12 samples of health individuals used for panning were 0. 144 ± 0. 016 and 0. 052 ± 0. 004, and the t value was 5. 69 (P <0. 0001). Conclusion By using phage-displayed random peptide libraries, we obtained the specific antibody binding peptides of tuberculosis,which showed specific binding activity with IgG of tuberculosis. It can provide a basis for the establishment of a new serological detection method of tuberculosis with peptide.     

结核分枝杆菌PPE60的GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的构建结核分枝杆菌PPE60的GST融合蛋白表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板,经PCR技术扩增目的基因,将目的基因克隆到pGEX-4T-1载体中,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆。进行质粒的酶切鉴定和序列分析;对重组的大肠杆菌进行诱导表达,SDS-PAGE分析菌体蛋白,凝胶密度扫描分析目的蛋白的表达情况,Western-blot鉴定融合蛋白。结果正确构建了pGEX-PPE60融合表达载体,载体能在大肠杆菌中表达分子量约为70 kDa的重组蛋白,占菌体总蛋白的50%。该融合蛋白能与GST抗体产生阳性反应。结论成功构建了GST-PPE60融合蛋白的表达载体,并能在大肠杆菌中高效表达,为PPE60蛋白的功能研究奠定了基础。     

应用噬菌体生物扩增技术快速检测痰标本中结核分枝杆菌

目的探讨噬菌体生物扩增法(PhaB)快速检测结核分枝杆菌的临床应用价值。方法应用涂片镜检法、L-J罗氏培养法、Bactec-960快速培养法及PhaB法共同检测151例痰标本。结果痰标本四种方法检测结果比较:151份临床确诊的活动性肺结核患者痰标本,涂片镜检、L-J罗氏培养、Bactec-960快速培养和PhaB法检查结果分别是20.5%、38.4%、59.6%和60.9%;比较PhaB与涂片和培养的阳性检测率,Phab检出率远高于涂片法(χ2=51.04,P<0.05),差异有统计学意义,Phab检出率高于罗氏法检出率(χ2=15.31,P<0.05),差异有统计学意义。结论PhaB方法能快速、简便地检测结核分枝杆菌,且检出率较高,可作为结核病诊断的重要方法。     

噬菌体生物扩增法检测痰中结核分枝杆菌的价值

目的评价噬菌体生物扩增法快速检测痰中结核分枝杆菌的应用价值。方法应用噬菌体生物扩增法快速检测27例痰标本,通过与改良罗氏培养法进行比较,对应用噬菌体生物扩增法检测痰中结核分枝杆菌进行初步的分析和评价。结果对于27例痰标本,噬菌体生物扩增法检测出阳性12例(44.44%),改良罗氏培养法检出阳性9例(33.33%),两种方法均阳性8例(29.63%);噬菌体生物扩增法检测痰中结核分枝杆菌与改良罗氏培养法无显著性差异(2=0.80,p>0.05)。结论噬菌体生物扩增法可简便、快速地检测痰中的结核分枝杆菌,具有很好的临床应用价值。     

筛选肝细胞p53启动子结合蛋白的噬菌体表面展示技术

目的 筛选p53启动子结合蛋白,探讨p53对肝细胞调节的分子生物学机制.方法 应用噬菌体表面展示技术,以p53作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,最后对所筛选克隆进行DNA测序和生物信息学分析.结果 噬菌体经5轮富集后,成功构建了噬菌体p5...     

脂多糖结合蛋白与脂多糖结合位点模拟肽的筛选

目的应用噬菌体随机12肽库筛选脂多糖结合蛋白（LBP）与脂多糖结合位点的多肽序列。方法以脂多糖为固相筛选分子,对噬菌体12肽库进行4轮亲合筛选,采用酶联免疫吸附法鉴定筛选后的噬菌体克隆与脂多糖的结合活性．取结合活性较高的克隆进行DNA测序,推导其多肽序列并与LBP序列比对,再进行竞争抑制实验检测筛选噬菌体与LBP竞争结合的效力。结果选取的86个噬菌体克隆中,多数结合实验鉴定阳性,取20个亲和力最高的克隆测序,得到20条不同编码的12肽序列,20条多肽与LBP一级结构有不同程度同源性,均为模拟肽。12个噬菌体克隆有较高的竞争抑制率。结论用噬菌体12肽库成功筛进出LBP与脂多糖结合位点模拟肽为讲一步以技蜱多肽曲鼻导物拼行串向讲什研密撂僻了宴聆依据和结构其础     

应用随机肽库筛选展示河豚毒素模拟表位噬菌体

目的利用噬菌体随机肽库筛选展示河豚毒素(TTX)模拟抗原表位的噬菌体,并以其替代毒素建立免疫学检测方法。方法以抗TTX单克隆抗体为靶分子,从以融合蛋白形式表达在丝状噬菌体M13外壳蛋白Ⅲ表面的随机七肽库中进行生物亲和淘选,用ELISA法鉴定阳性克隆。结果通过4轮淘选,获得了7株能与抗TTX单克隆抗体特异性结合的噬菌体,采用间接竞争ELISA,筛选到3株能抑制TTX的阳性克隆。其中以4号噬菌体建立的免疫检测方法,线性范围为1～20ng/ml(TTX毒素浓度),R2=0.9947,检测下限为1ng/ml。结论从噬菌体七肽库筛选到了展示TTX模拟抗原表位的噬菌体,淘选出来的噬菌体粒子可作为毒素的替代品用于免疫学检测。     

结核分枝杆菌特异性蛋白抗体检测在结核病诊断中的价值

目的探讨结核病诊断中应用结核分枝杆菌特异性蛋白抗体检测可行性和有效性。方法回顾性分析2008年1月-2011年10月年收集的425例肺结核患者、218例肺外结核、78例除结核病以外其他肺部疾病和184例符合入选条件的健康志愿者临床资料。对全部样本进行结核分枝杆菌特异性蛋白抗体检测,对痰结核分支杆菌涂片及培养检查肺结核患者和肺结核肺部疾病。观察检测敏感度和特异度。结果经实验发现,结核分枝杆菌特异性蛋白抗体检测菌阳肺结核敏感度、菌阴性敏感度分别为70.0%和66.3%,肺外结核病75.2%,结核总敏感度66.1%;而至于特异度,除结核病以外其他肺部疾病为79.5%,健康人群为68.4%,结核总敏感度71.8%,以上敏感度和特异度显著高于此前临床预测值。讨论利用结核分枝杆菌特异性蛋白抗体检测诊断结核病有较为显著的敏感度和特异度,但依然存在较高的假阳性率,建议采取多种蛋白抗原联合应用以进一步提高诊断率。     

噬菌体生物扩增法与3D培养检测结核分枝杆菌的对比分析

目的探讨噬菌体生物扩增法快速检测结核分枝杆菌的临床应用价值。方法对117份肺结核患者痰和体液标本进行噬菌体生物扩增法检测并与3D培养进行对比分析。结果痰噬菌体生物扩增法阳性率为43.9%,3D培养为27.1%;体液噬菌体生物扩增法阳性率为80.0%,3D培养为0。结论噬菌体生物扩增法快速检测结核分枝杆菌明显优于3D培养。     

应用噬菌体展示技术筛选氯胺酮模拟表位的研究

目的应用噬菌体展示技术筛选氯胺酮模拟表位,为建立无毒ELISA检测体系提供基础。方法以抗氯胺酮单克隆抗体为配体,在噬菌体七肽库中淘选氯胺酮的模拟表位。经4轮淘选后,选择可与氯胺酮单克隆抗体有不同程度结合的噬菌体,并进一步以间接竞争ELISA确定与盐酸氯胺酮存在竞争抑制的阳性克隆。结果发现10个噬菌体均可与氯胺酮单克隆抗体不同程度的结合;以间接竞争ELISA确定其中5个阳性克隆与盐酸氯胺酮存在竞争抑制现象;5个阳性克隆测序结果表明,获得了4种不同的氨基酸序列。结论初步判断这4个噬菌体展示了氯胺酮模拟抗原表位。     

重组结核分枝杆菌特异性分泌抗原融合蛋白的活性鉴定及初步应用

目的：融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白CFP10-ESAT-6或ESAT-6-CFP10，研究其免疫学特性，为结核病的血清学诊断提供物质基础。方法：将一个柔性的氨基酸“接头”插入原核表达载体pET32c（＋）中，构建pET32c（＋）-linker。PCR法扩增CFP10、ESAT-6基因。将CFP10克隆入改建的载体pET32e（＋）的linker前，ESAT-6克隆入linker后，构建CFP10-ESAT-6融合基因；或将ESAT-6克隆入改建的载体pET32c（＋）的linker前，CFP10克隆入linker后，构建ESAT-6-CFP10融合基因，分别转化大肠杆菌XL1-blue，抽提质粒，酶切鉴定；在大肠杆菌B121中表达，通过Western blot分析其抗原性。结果：两个目的基因分别被按顺序成功克隆入载体pET32c（＋）的linker前或后。重组质粒pET32c（＋）-CFP10-ESAT-6或pET32c（＋）-ESAT-6-CFP10靶基因的测序结果与预计序列完全一致。融合蛋白在B121菌中高效表达。Western blot分析表明，融合蛋白与活动性肺结核患者血清能发生特异性免疫反应。结论：成功地构建了多抗原基因DNA质粒；pET32e（＋）-CFP10-ESAT-6或pET32c（＋）-ESAT-6-CFP10质粒在B121菌中能高效表达rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白，该蛋白兼具CFP10和ESAT-6两种蛋白的抗原性。本研究为rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白在结核病血清学诊断中应用奠定了基础。     

结核分枝杆菌MPT64蛋白多克隆抗体的制备

目的利用原核表达系统获取结核分枝杆菌MPT64蛋白,制备并鉴定MPT64蛋白多克隆抗体。方法提取结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA并以其为模板,PCR扩增获取目的基因MPT64,并插入蛋白表达载体PET-26b(+)。将纯化得到的MPT64蛋白免疫新西兰兔,最终制备得到MPT64多克隆抗体,通过免疫印迹法鉴定该抗体的特异性。结果成功获取结核分枝杆菌MPT64基因及其重组蛋白,分子量约为27 k D左右。免疫印迹实验证实,以该重组蛋白为免疫原制备得到的多克隆抗体可特异性识别来自于结核分枝杆菌MPT64基因重组腺病毒疫苗所表达的MPT64蛋白。结论获得高特异性的结核分枝杆菌MPT64蛋白多克隆抗体,有助于结核分枝杆菌疫苗的研发。     

噬菌体展示肽库筛选赭曲霉毒素A模拟表位的研究

目的从噬菌体随机肽库中筛选模拟赭曲霉毒素A表位的噬菌体粒子,并以其替代毒素建立免疫学检测方法。方法以抗赭曲霉毒素A的单克隆抗体为配基,免疫亲和筛选以融合蛋白形式表达在丝状噬菌体M13外壳蛋白Ⅲ上的随机七肽库,以ELISA方法鉴定阳性克隆,同时进行DNA测序确定插入七肽的氨基酸序列。结果经过4轮淘选,共筛选到11株能与该抗体特异性结合的阳性克隆,且该结合能被赭曲霉毒素A阻断,模拟表位的共有序列为IRPMVXX,X为任意氨基酸。以其中的P2号克隆建立了竞争ELISA检测方法,线性范围为200～8000pgml,检测下限为150pgml。结论噬菌体展示技术可成功筛选到赭曲霉毒素A模拟表位,筛选到的噬菌体粒子可作为毒素的替代品建立免疫学分析方法。     

结核分枝杆菌ESX-1分泌蛋白对巨噬细胞调控作用

近年来结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculo-sis,MTB)多重耐药性(multi-drug resistance,MDR)的不断出现以及艾滋病人群对MTB易感性的增加,导致患结核病的人数迅速增加,死亡率也在不断上升,大有死灰复燃的趋势^[1],这促使科研工作者加速了新疫苗研制和新药物的开发,而与之相关的就是对结核分枝杆菌致病机理和发病机制的深入研究提出了非常紧迫的要求^[2].     

采用噬菌体展示技术筛选黄曲霉毒素B_1模拟抗原表位

目的从随机肽库中筛选黄曲霉毒素B1模拟抗原表位,以建立无需黄曲霉毒素B1偶联抗原的免疫学检测方法。方法利用噬菌体展示技术,以抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体为靶分子,从随机七肽库中进行生物亲和淘选,ELISA鉴定阳性克隆,通过DNA测序对每个阳性克隆进行定性分析。结果通过4轮结合/扩增循环,获得了能与抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体结合的肽,采用间接竞争ELISA,筛选到了4株能抑制黄曲霉毒素B1的阳性克隆子,经DNA测序得到HXXDPXH共有序列,其中X为任意氨基酸。以其中P10噬菌体阳性克隆建立竞争ELISA方法,线性范围为500~2000pg/ml,检测下限为50pg/ml。结论利用噬菌体展示技术筛选到了黄曲霉毒素B1模拟抗原表位,并以其代替黄曲霉毒素B1偶联抗原建立了免疫学检测方法。     

噬菌体生物扩增法与常规方法在结核分枝杆菌检测中的比较

目的评价噬菌体生物扩增技术在结核分枝杆菌快速检测中的临床应用价值,并与其他两种常规方法进行比较。方法应用噬菌体生物扩增法（PhaB法）、Bactec 960培养法、涂片法同时对135份临床确诊为结核病（包括肺结核、结核性胸膜炎、结核性脑膜炎）的患者的标本（痰、胸腔积液、肺泡灌洗液、脑脊液）以及排除结核病的患者（21例慢性支气管炎、20例支气管扩张病、18例肺癌、8例肺炎）的痰液共计67份进行检测。结果 135份标本应用噬菌体生物扩增法、Bactec 960培养法与涂片法的阳性率为48.2%、44.4%、28.2%。噬菌体生物扩增法的阳性检出率较高于涂片法,差异有统计学意义,阳性符合率为58.5%（38/65）,阴性符合率为95.7%（67/70）,总体符合率为77.8%（105/135）。噬菌体生物扩增法与Bactec 960培养法比较差异有统计学意义,阳性符合率为78.5%（51/65）,阴性符合率为72.9%（51/70）,总体符合率为75.6%（102/135）。在涂片阴性、Bactec 960培养法检测均为阴性的75例标本中,用噬菌体生物扩增法检测出11例阳性,其检出率为14.7%。67份排除结核病的痰标本应用三种方法的阳性率均为0%。结论噬菌体生物扩增法检测结核分枝杆菌在诊断结核病中有较好的灵敏度和特异度,是辅助诊断和鉴别诊断结核病的有效手段。     

结核分枝杆菌4种分泌蛋白血清学应用价值

目的通过对4种基因重组的结核分枝杆菌分泌蛋白进行包被,建立了酶联免疫检测方法,用于检测肺结核病患者、非结核肺部疾病患者、卡介苗接种者的血清抗体,并探讨结核分枝杆菌分泌蛋白的血清学应用价值。方法在酶标板上分别包被基因重组蛋白ESAT-6、Ag85A、MPT64、MPT81抗原,建立间接ELISA方法,分别检测肺结核病患者、非结核肺部疾病患者和卡介苗接种前后的血清抗体。结果肺结核组血清抗体除ESAT-6外,Ag85A、MPT64、MPT81的阳性率均显著高于非结核肺部疾病组(P0.01)。结核菌素试验阴性者注射上述卡介苗前阳性率分别为19.0%、13.8%、12.1%、12.1%,注射后阳性率分别为37.9%、24.1%、15.5%、17.2%,其中注射ESAT-6前后阳性率之间的差异有显著性(P0.05)。结论用结核分枝杆菌重组分泌蛋白检测结核病人血清抗体具有重要的诊断价值,有望作为结核蛋白芯片的候选抗原。     

7种结核分枝杆菌重组蛋白的纯化及血清学特性

目的分离纯化结核分枝杆菌重组蛋白38-kDa、16-kDa、Mtb81、ESAT-6、CFP10、Rv3425、Rv3391,并比较7种蛋白的免疫学特性,评价其在结核血清学诊断中的应用价值。方法利用间接酶联免疫吸附试验评价确诊结核病人、非结核病人、健康人血清中7种重组蛋白的抗原性。结果成功分离纯化了7种重组蛋白;酶联免疫吸附试验结果表明,7种抗原均能有效区分确诊结核病人、非结核病人和健康人,其中阳性率最高的是ESAT-6为47.3%,特异性最高的是Rv3391为98.3%。联合抗原中阳性率和特异性最高的是CFP10+ESAT-6+Rv3391抗原组合。结论单一抗原中ESAT-6具有较高的免疫原性,联合抗原中CFP10+ESAT-6+Rv3391抗原具有很高的阳性率和特异性,在结核诊断具有很高的诊断潜力。     

结核分枝杆菌分泌蛋白NPT64的克隆、表达、纯化和复性

目的 构建结核分枝杆菌分泌蛋白MPT 64的重组质粒,并在大肠杆菌中表达及纯化和复性重组蛋白.方法 用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出mpt64基因片段,插入PKRX-T载体中,再亚克降到表达载体PET30a中,在大肠杆菌中表达;应用组氨酸标签（His-Tag）纯化重组蛋白;在PBS中通过半透膜恢复重组蛋白的天然结构.结果 构建了含MPT64重组质粒的大肠杆菌工程菌,并以包涵体形式表达重组蛋白MPT 64,其占细胞总蛋白的20%～30%;重组蛋白变性后经镍柱纯化,其纯度达90%以上;通过半透膜完全恢复重组蛋白的天然结构.结论 具有天然结构和高纯度的重组融合蛋白有可能成为有效的结核病血清学诊断的候选抗原.