MALDI-TOF MS用于副溶血性弧菌检测初探

目的评价基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对副溶血性弧菌的识别能力,并将该方法用于副溶血性弧菌的同源性分析。方法运用标准菌株判断MALDI-TOF MS方法用于检测副溶血性弧菌的重复性及特异性,将从5种贝类中收集到的65株菌株运用MALDI-TOF MS做鉴定,PCA同源性分析。结果 MALDI-TOFMS对65株副溶血性弧菌的质谱鉴定结果与生化鉴定及PCR鉴定结果一致,即能有效区分副溶血性弧菌、创伤弧菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌等5种细菌,其中在副溶血性弧菌,3%NaCl TSA培养24h后的结果鉴定效果更好。10次重复检测副溶血性弧菌的分值均在2.3分以上,PCA聚类分析将65株菌株被分成了4个大类,大多数菌株的PC1、PC2、PC3相对集中靠拢。结论 MALDI-TOF MS检测副溶血性弧菌具有较好的稳定性、特异性,对不同型别的细菌具有较强的分辨能力,且重复性好,同源性分析具有高通量、快速、简单、低成本等优点。     

副溶血性弧菌Vop T蛋白的表达及其抗体的毒力菌株特异性研究

目的 研究副溶血性弧菌VopT蛋白的菌群特异性,为建立致病性副溶血性弧菌的快速检测方法以及探讨VopT的作用机制奠定基础。方法 根据副溶血性弧菌VopT蛋白基因(VPA1327)序列设计合成引物,通过PCR从副溶血性弧菌致病株WX06152(血清型O3∶K6)中扩增出目的基因,构建原核表达载体pET-30a(+)-VPA1327并转化大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,重组蛋白应用MALDI-TOF-MS/MS鉴定和His镍柱纯化,并通过免疫BALB/c小鼠制备抗血清,建立副溶血性弧菌VopT蛋白的间接ELISA检测方法,并分析其敏感性和毒力菌株特异性。结果 成功表达了大小为33 kDa融合蛋白,肽指纹图谱与副溶血性弧菌VopT蛋白一致。重组VopT抗血清能够特异性检测副溶血性弧菌毒力株的全菌细胞及其裂解蛋白,与环境株及其它种属菌株无明显交叉反应,灵敏度达到10⁵CFU·mL^-1。结论 重组VopT的抗血清具有良好特异性,为探讨VopT致病机理和分泌机制研究提供了一定的参考依据。     

一起副溶血性弧菌食物中毒的病原学分析

目的运用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对一起食物中毒中分离的菌株进行同源性分析,为查明原因和溯源提供依据。方法采集患者、食品从业人员、环境样本以及留样食品进行分离、鉴定,对分离的菌株进行PFGE分析。结果本次事件共采集137份样本,检出11株副溶血性弧菌,其中5株来自病人样本,3株来自冷菜间厨师样本,1株来源于生扇贝样本,2株分别来自龙虾池、桂鱼池养殖水。11株菌株经PFGE分析,除1株患者样本与其余10株的同源性为60.0%外,其余10株副溶血性弧菌的同源性为100.0%。结论 PFGE分型技术揭示菌株之间的流行病学联系,为事件的分析和追溯来源提供分子流行病学证据。     

慢性外耳道炎患者分离溶藻弧菌的鉴定及生物学特性分析

目的探讨溶藻弧菌的鉴定方法和生物学特性,为溶藻弧菌感染的诊断提供依据。方法对1例慢性外耳道炎患者耳部脓液标本分离的病原菌通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)、API细菌生化反应鉴定卡、Vitek 2 Compact鉴定仪和16S rRNA基因测序进行鉴定,采用抗菌药物敏感性试验检测耐药表型。结果该菌株鉴定为溶藻弧菌,药敏试验显示其对哌拉西林、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南、庆大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、环丙沙星和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑敏感,对氨苄西林耐药,与患者的临床诊断及疾病预后相符合。结论 MALDI-TOF MS和16S rRNA基因测序对溶藻弧菌的鉴定准确可靠,对溶藻弧菌感染诊断具有重要价值,可供临床参考。     

副溶血性弧菌VBNC的诱导及其免疫捕获PCR检测

目的研究一种适用于副溶血性弧菌活的非可培养状态(VBNC)的检测方法。方法将副溶血性弧菌VPL4-90悬浮于陈海水中,利用低温条件诱导VBNC状态,42d后取样,进行AOAC法观察、DVC法观察、PC计数及国标法检测等;以诱导后菌体为抗原,制备兔抗VBNC血清,用于免疫捕获PCR检测。结果进入VBNC状态的细菌缩小成球形,大部分仍然是活菌,但不能形成菌落;国标检测方法未能使进入VBNC状态的细菌得到分离培养;利用抗血清捕获VBNC菌体后对副溶血性弧菌的tlh基因进行PCR扩增,检测到副溶血性弧菌VBNC。结论制备的抗血清对VBNC菌体具有富集作用;建立的免疫捕获PCR法可应用于对副溶血性弧菌VBNC的检测。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在幽门螺杆菌检测中的应用

目的 建立并评价基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对幽门螺杆菌(Hp)的鉴定能力及Hp耐药性菌株对检测结果的影响.方法 MALDI-TOF MS自建库中的Hp来源于样本库中经传统方法鉴定和药物敏感试验并已进行全基因测序确认的菌株,随机取其中对药物全敏感的Hp菌株10株,用MALDI-TOF M...     

青岛市售养殖海水虾中副溶血性弧菌的分离及耐药性分析

目的 对青岛市售养殖海水虾中副溶血性弧菌进行分离鉴定,并对分离菌株进行耐药性分析。方法 以常规培养法分离,全自动细菌鉴定仪进行鉴定,PCR扩增法检测毒力基因,K-B法进行药敏试验。结果 样品的副溶血性弧菌检出率为78.1% (50/64),所有菌株均不含tdh基因,其中3株菌含trh基因,所有菌株对头孢拉啶耐受,96%菌株对氨苄西林和阿莫西林耐受,部分菌株对头孢呋新钠、链霉素、四环素、土霉素和复方新诺明耐受,少量菌株出现耐受3类抗生素以上的多重耐药性。结论 青岛市售养殖海水虾中副溶血性弧菌存在较严重的污染和一定程度的耐药情况。     

食品与临床分离的致病性副溶血性弧菌耐药性比较

目的比较食品与临床分离的致病性副溶血性弧菌耐药性差异,为该菌耐药机制研究提供基础。方法运用K-B纸片法,对上海市28株临床菌株、18株食品源菌株的副溶血性弧菌进行耐药性监测,以PCR分析菌株的耐药基因。再用多位点测序技术揭示46株副溶血性弧菌的遗传多样性,针对相同进化分支中不同来源的分离株进行耐药性比较。结果28株临床菌株的耐药率(100%)明显高于18株食品源分离株(88.9%),而且临床菌株全部为多重耐药性菌株(n=28),而食品源中仅有2株具有多重耐药性。临床菌株所携带的耐药基因数量比食品源分离菌株更多、种类更为丰富。多位点测序分型结果也显示相同的趋势,在同一进化分支中,临床菌株的耐药性也显著高于食品分离株。结论本研究系统地比较食品与临床分离的致病性副溶血性弧菌耐药表型与耐药基因型的差异,分析了耐药性形成的原因,为副溶血性弧菌耐药性的起源、传播与控制提供依据。     

引起一起食物中毒的副溶血性弧菌病原学检测和分子分型溯源研究北大核心CSCD

目的对引起一起食物中毒的副溶血性弧菌进行实验室鉴定,分析菌株间的相关性。方法按照国标GB4789和有关规范对采自患者的粪便肛拭标本及砧板涂抹标本进行肠道致病菌检测,同时采用实时荧光PCR对耐热直接溶血素(TDH)毒力基因进行鉴定。提取副溶血性弧菌分离株基因组DNA,经限制性内切酶SfiⅠ酶切后进行脉冲场凝胶电泳(PFGE),获得指纹图谱,利用BioNumerics6.6软件进行聚类分析。结果从病人和砧板标本共分离出8株O1血清型副溶血性弧菌,其TDH毒力基因为阳性。聚类分析显示,分离自中毒病人和砧板的8株副溶血性弧菌的指纹图谱相似性高达100%。结论引起该起食物中毒的病原菌为携带TDH毒力基因的O1血清型副溶血性弧菌,且来自同一污染源。     

2009～2011年无锡市副溶血性弧菌分离菌株的毒力检测及PFGE分析

目的了解无锡市2009～2011年副溶血性弧菌分离株携带的主要毒力因子的流行状况,并对同血清型菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析。方法应用PCR方法检测分离的35株副溶血性弧菌耐热性溶血毒素基因(tdh)、耐热性溶血毒素相关的溶血毒素基因(trh)和不耐热溶血毒素基因(tlh)。根据美国CDC PulseNet实验方法,用限制性内切酶SfiⅠ对O3﹕K6血清型菌株的染色体进行酶切,通过PFGE获得电泳图谱,利用BioNumerics软件对图谱进行聚类分析。结果 35株副溶血性弧菌tdh、trh及tlh基因的携带率分别为85.7%、8.6%和100%,77.1%的副溶血性弧菌携带的毒力基因为tdh+、trh-、tlh+。PFGE图谱显示,19株O3﹕K6血清型的副溶血性弧菌共有9种PFGE带型,带型100%相同的菌株几乎都出现在同一年代相近的时间点,但也出现了跨年代菌株。结论无锡市副溶血性弧菌致病性较强,具有潜在的O3﹕K6型副溶血性弧菌暴发流行可能,需进一步加强监测管理。     

江苏省部分地区淡水产品中弧菌菌群及其致病性分析

目的 了解江苏省市场上淡水产品中弧菌的菌群组成及其致病性。方法 对采集的江苏省部分地区淡水产品样本经TCBS培养基分离、纯化弧菌分离株,应用特异性基因tlh、HSP60以及16S rDNA PCR方法鉴定;并检测致病基因、溶血性和引起小鼠肠积水能力分析其致病性。结果 江苏省部分地区55份淡水产品中分离出细菌分离株256株,分别是副溶血弧菌占74.55%、溶藻弧菌占85.45%、哈维氏弧菌占9.1%、河口弧菌占3.6%、麦奇尼科夫弧菌占5.5%、天蓝色弧菌占3.6%株、产钠弧菌占1.8%和重氮养弧菌占1.8%。所有分离株均未检出致病相关基因tdh、trh;15.02%分离株有溶血性(KP⁺);大部分KP⁺分离株能引起小鼠肠积水。结论 江苏省淡水产品中弧菌菌群呈现多样性分布,副溶血弧菌和溶藻弧菌是主要菌群;不同地区和不同样品中的弧菌菌群和检出率有较大差异,沿海地区的检出率明显高于内陆地区,鱼、虾中弧菌的检出率和弧菌种类明显高于贝、蟹。致病性分析说明小部分分离菌株可能具有潜在的致病性     

双毒力基因副溶血性弧菌引起食物中毒病原学分析

目的分析引起食物中毒的病原菌,掌握分离株生化、血清学、毒力基因、耐药性状况。方法采集患者肛拭子标本,进行分离鉴定、耐药性分析、血清学分型,实时荧光PCR法检测毒力基因tdh、trh。结果 3份肛拭子中分离出O3、O1 2株不同血清型的副溶血性弧菌;2株菌株均对氨苄西林耐药;1株同时携带毒力基因tdh和trh。结论这是一起由2种血清型副溶血性弧菌引起的食物中毒,菌株携带双毒力基因可能是导致此次食物中毒患者临床表现较重的原因。     

O3∶K6血清型副溶血性弧菌三重PCR检测方法的建立

目的建立副溶血性弧菌O3∶K6血清型三重PCR检测方法。方法基于副溶血性弧菌种特异性基因toxR,O3血清群特异性基因vp0209,K6血清型特异性基因vp0230,建立O3∶K6血清型副溶血性弧菌三重PCR检测方法。对该方法的检测特异性和灵敏度进行分析。结果与结论该方法对O3∶K6血清型副溶血性弧菌具有很好的检测特异性,灵敏度可以达到102 CFU/PCR反应体系。     

浙江省副溶血性弧菌03：K6血清型菌株多位点序列分型研究

目的掌握浙江省不同来源的副溶血性弧菌O3：K6血清型菌株的分子分型特征,为副溶血性弧菌食源性疾病的预防控制提供技术支持。方法选择副溶血性弧菌的7个管家基因dnaE、gyrB、recA、dtdS、pntA、pyrC及tnaA,对62株不同来源的副溶血性弧菌03：K6血清型菌株样本进行PCR扩增、测序,Chromas软件和DNAStar软件分析,核酸序列上传至MLST数据库进行比对,获得每株菌的序列型,绘制多位点序列分型遗传进化树并进行亲缘性分析。结果62株副溶血性弧菌03：K6血清型菌株中,59株菌为ST-3型（3,4,19,4,29,4,22）,1株菌为ST-121型（3,2,82,52,4,78,66）,1株菌为新的ST型（5,10,34,27,77,49,23）,1株菌仅gyrB基因第562位点由C突变为T,其余基因序列与ST4型（3,5,22,12,20,22,25）一致。结论浙江省副溶血性弧菌03：K6血清型菌株的主要MLST型别为ST-3型。     

基于MALDI-TOF-MS和MLVA技术对军团菌的鉴定和分型研究北大核心CSCD

目的了解福建省4个地区军团菌的基因特征与分布情况。方法采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对2013-2020年分离自福建省4个城市的32株9个血清型(Lp1、Lp3、Lp4、Lp5、Lp6、Lp7、Lp8、Lp9、L. micdadei)军团菌进行鉴定,结合多位点串联重复序列分析(MLVA)检测分析其中8个位点(lpsm1,lpsm3,lpsm13,lpsm17,lpsm19,lpsm33,lpsm34,lpsm35)对其中的13株Lp1进行分型。结果 32株军团菌均可通过MALDI-TOF MS检测到属种水平,鉴定分值平均值为2.04±0.16;通过蛋白聚类可以分为A、B、C 3个群;对其中的13株Lp1菌株进行MLVA分型,菌株间相似度为40.9%~87.5%,按照100%的相似水平可分为13个MLVA型,无优势MLVA型。Lp1 2013-25(7号菌)和Lp1 2013-14(9号菌)在MALDI-TOF MS和MLVA两种聚类均显示亲缘关系较近,并与其他菌株均存在差异。结论 MALDI-TOF MS技术可应用于军团菌的快速鉴定,但MALDI-TOF MS与MLVA用于军团菌的分子分型并不完全一致,可联合应用分析军团菌的群体遗传关系。     

脉冲场凝胶电泳用于副溶血性弧菌的分子流行病学研究

目的运用脉冲场凝胶电泳技术和荧光PCR技术对成都市2008-2009年分离的副溶血性弧菌进行分子分型和毒素基因检测,分析感染来源。方法利用PCR检测副溶血性弧菌分离株耐热直接溶血素(tdh)基因和耐热相关溶血素(trh)基因。用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对菌株进行分型,所得结果用BioNumerics V 4.0软件UPGMA方法进行聚类分析。结果所试38株分离菌tdh基因阳性有31株,2株为trh阳性。以SfiⅠ酶切后PFGE分型,38株菌被分成了24个带型,大多数暴发有各自优势型别,其中有两起暴发优势型别一致;环境分离株菌型分散。结论多起暴发事件分离株之间PFGE型别差异大,成都市副溶血性弧菌暴发的感染来源复杂。     

基于TaqMan探针的双重荧光定量PCR方法检测海产品中的副溶血弧菌

目的建立海产品中副溶血弧菌检测的双重荧光定量PCR体系。方法针对副溶血弧菌种特异性基因tlh和tdh设计引物和TaqMan探针,建立双重荧光定量PCR体系,进行特异性与敏感性研究;利用该体系检测海产品中的副溶血弧菌。结果副溶血弧菌可得到特异性扩增,而其它与副溶血弧菌共存于海产品中的细菌均未见扩增曲线。副溶血弧菌与其它细菌的混合DNA检测表明,其它细菌基因组的存在时并不干扰副溶血弧菌检测。副溶血弧菌典型菌株FJ14和BJ97的敏感性试验显示,该体系的最低检测DNA浓度分别为49.8pg与77.8pg,最低检测细菌浓度为56CFU/mL和371CFU/mL。对舟山菜市场采集的50份样本检测表明,32份为tlh基因阳性,3份为tdh基因阳性,与传统方法的检测结果相同。结论与传统检测方法相比,副溶血弧菌的双重荧光定量PCR检测方法快速准确,结果直观。     

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱快速鉴定沙门菌临床分离株

目的评估基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)在沙门菌鉴定中的临床应用,并研究其影响因素。方法用传统血清学方法鉴定沙门菌的血清型,用MALDI-TOF MS对哥伦比亚血平板、HE平板、SS平板和麦康凯平板分别培养24h、72h、120h和168h的179株沙门菌进行鉴定。结果 179株沙门菌可分为38种血清型,肠炎沙门菌(21.2%)、斯坦利沙门菌(17.3%)和Ⅰ4,5,12:i:-沙门菌(16.2%)居前3位。所有菌株在血平板、HE平板、SS平板和麦康凯平板分别培养24h和72h均能被MALDI-TOF MS准确鉴定为沙门菌。MALDI-TOF MS的耗材成本约为微生物自动生化鉴定系统(Vitek 2)的1/3,检测时间约为Vitek 2的1/7。结论在血平板、HE平板、SS平板和麦康凯平板培养3d以内的沙门菌,MALDI-TOF MS均可以准确鉴定。与Vitek 2相比,MALDI-TOF MS检测的速度更快,消耗的成本更低,并且可以直接鉴定生长在选择性培养基的沙门菌。     

大肠杆菌O157的致病性:1例大肠杆菌O157∶NM和副溶血性弧菌的重叠感染

目的　探讨从杭州一急性腹泻患者粪便中分离的大肠杆菌 Ｏ１５７∶ Ｎ Ｍ 的致病性。方法对一重叠感染大肠杆菌 Ｏ１５７∶ Ｎ Ｍ 和副溶血性弧菌的急性腹泻患者,调查其临床表现及相关流行病学资料, 同时对分离菌株进行生化特性分析、血清学鉴定、毒力试验等, 并采集发病后第４ 、１８ 天血清与分离菌株试管定量凝集试验, 检测其特异性抗菌抗体。结果　菌株２６ － １ 为大肠杆菌 Ｏ１５７∶ Ｎ Ｍ, Ｖｅｒｏ 毒素阴性, 未携６０ Ｍ Ｄａ 质粒, Ｅ Ｈ Ｅ Ｃ 溶血素基因阴性： 菌株２６ － ２ 为副溶血性弧菌, 为强毒株。患者第４ 、１８ 天血清与分离菌株未见凝集阳性反应。结合临床表现和流行病学资料, 考虑诊断该病例为急性副溶血性弧菌肠炎。结论　我国人群和家畜肠道中可能存在一类致病性不明或非致病性的大肠杆菌 Ｏ１５７ 菌株; Ｅ Ｈ Ｅ Ｃ 的鉴定应重视毒力因子的检测, 同时亦不能忽视患者是否有其它肠道病原体的重叠感染。     

基因芯片检测肠道致病菌技术的建立和应用

目的 快速、准确地检测水中存在的肠道致病菌。方法 采用基因芯片技术对水中常见肠道致病菌进行检测和鉴定，包括检测靶基冈的扩增、基因芯片的制备、杂交反应和杂交结果的检测与分析四个步骤。结果 应用基因芯片对涉及9个菌属的143株致病菌在相同的条件下进行了杂交检测，得到菌属(科)特异性的杂交图谱，从而达到对细菌进行检测鉴定的目的。结论 制备的基因芯片能够同时检测沙门菌属、志贺菌属、埃希菌属、葡萄球菌属、变形杆菌属的细菌以及小肠结肠炎耶尔森菌、副溶血性弧菌等。