盾叶薯蓣转录组分析及其皂苷元生物合成关键酶基因的挖掘

目的分析比较盾叶薯蓣根茎与叶片的转录组,挖掘与盾叶薯蓣中皂苷元生物合成途径相关的关键酶基因。方法利用Illumina Hi Seq2000高通量测序技术对盾叶薯蓣根茎与叶片进行转录组测序,对测序结果进行注释分析;并结合根茎与叶片中皂苷元的含量测定结果,挖掘与盾叶薯蓣中皂苷元生物合成途径相关的关键酶基因;最后利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术对部分候选基因的表达模式进行分析。结果共获得了81 660个Unigene,有64.33%在NT、NR、Swiss-Prot、KOG、GO、KEGG数据库中得到注释;根据其表达量与代谢通路分析筛选出29种共227个可能参与盾叶薯蓣中皂苷元生物合成途径的催化酶基因,部分催化酶基因的表达模式与皂苷元含量具有一定相关性;并发现5个盾叶薯蓣内生菌基因。结论研究初步获得了盾叶薯蓣中参与皂苷元生物合成的候选关键酶基因,部分候选酶基因可能参与盾叶薯蓣中皂苷类成分的后修饰过程,并发现盾叶薯蓣根茎中内生菌可能参与其皂苷元的生物合成,为进一步阐明盾叶薯蓣中皂苷元生物合成的分子机制奠定基础。     

盾叶薯蓣须根响应低磷胁迫的GC-MS代谢产物及基因表达特征分析

目的 探讨盾叶薯蓣须根在低磷胁迫下的代谢产物及基因表达特征。方法 设置重度胁迫组、中度胁迫组与正常组模拟盾叶薯蓣低磷胁迫实验,在胁迫初期采取盾叶薯蓣须根,分别利用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）衍生化及RNA-seq技术对其代谢产物和转录组特征进行分析,通过对不同处理代谢产物的多元统计分析、差异表达基因的功能分析及数据挖掘,筛选低磷胁迫下盾叶薯蓣须根产生的代谢标志物,分析差异表达基因的代谢通路特征。结果 从盾叶薯蓣须根中共检测到116个GC-MS代谢产物,不同低磷处理下盾叶薯蓣须根的代谢特征存在明显差异,利用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型从不同处理须根的代谢产物中筛选到6个差异代谢物,主要为糖类、醇类等成分,这些物质可能是盾叶薯蓣须根响应低磷胁迫的代谢标志物;重度胁迫组与正常组中筛选到的差异基因主要富集到过氧化物酶途径、磷酸盐和次磷酸盐代谢途径,重度胁迫组与中度胁迫组中筛选到的差异基因主要富集到谷胱甘肽代谢途径及磷酸戊糖途径;从须根中筛选出177个潜在响应低磷胁迫的差异基因,涉及萜类骨架、肌醇生物合成等多个途径,这与盾叶薯蓣须根部位响应低磷胁迫的代谢差异物多为糖类与肌醇等物质相吻合。结论 低磷胁迫下盾叶薯蓣须根部位的代谢产物及基因表达均发生了相应的应答,差异代谢物与差异表达基因具有密切的关系,该研究为盾叶薯蓣响应低磷胁迫的分子机制提供理论依据。     

多花黄精甾体皂苷生物合成途径分析及关键酶基因研究

甾体皂苷是黄精属植物的特征性成分及主要活性成分,黄精属甾体皂苷具有调节血糖、防治心脑血管疾病及抗肿瘤等多种药理活性。为解析黄精甾体皂苷生物合成途径,探究其关键酶基因,该研究使用BGISEQ-500平台对多花黄精的花、叶、根和根茎进行转录组测序,获得129 989条unigenes, 88 958条unigenes被七大数据库注释,其中22 813条unigenes可归类于53个GO功能分类中,64 877条unigenes涉及136条KEGG代谢通路。502条unigenes涉及多花黄精甾体皂苷生物合成途径,其中97条unigenes编码甾体皂苷生物合成途径12个关键酶。对甾醇生物合成过程中的第一个关键酶环阿屯醇合酶进行序列分析和同源建模发现其具有保守的催化结构域和底物结合结构域。将多花黄精根茎与花、叶、根的基因表达水平比较,有2 437条unigenes在根茎中特异性高表达且被KEGG注释,其中35条与甾体皂苷生物合成途径相关。该研究极大地丰富了黄精属植物的转录组数据,为植物甾体皂苷生物合成途径的解析提供了线索,为进一步研究甾体皂苷生物合成途径关键酶的功能及调控机制奠定了基础。     

多花黄精根茎的转录组分析与甾体皂苷生物合成相关基因发掘

为了丰富多花黄精Polygonatum cyrtonema幼苗期根茎发育的转录组数据,发掘参与甾体皂苷生物合成的功能基因,为多花黄精活性成分的合成代谢途径与调控机制研究提供遗传资源,该研究基于Illumina深度测序平台,对多花黄精幼苗期根茎进行转录组测序及生物信息学分析,包括序列数据的组装拼接、unigene序列的功能注释、分类和代谢途径分析,并对次生代谢途径中甾体皂苷的生物合成通路进行深入解析。结果显示,多花黄精根茎的转录组数据经拼接共产生了126 546条unigene序列,其中47 226条被注释。共有16 499条unigene被定位到了KEGG数据库中的132个代谢通路,其中2 768条被鉴定出参与了22个次生代谢物生物合成通路。鉴定出的113条unigene序列,分别编码27个与甾体皂苷生物合成相关的代谢酶,与45个拟南芥酶基因同源。该研究从多花黄精转录组数据库中发掘到一系列与活性成分甾体皂苷生物合成相关的酶基因,对这些基因的深入研究,有助于从分子水平上解析多花黄精中甾体皂苷的生物合成途径。该研究也为多花黄精的转录组学研究提供了丰富的参考数据,对于多花黄精的功能基因组学研究具有重要意义。     

基于转录组挖掘球药隔重楼螺甾烷型重楼皂苷生物合成相关基因

目的 以球药隔重楼Paris fargesii根茎、茎和叶为材料,探究螺甾烷型重楼皂苷的生物合成基因。方法 采用HPLC分析6个螺甾烷型重楼皂苷含量,进一步利用Illumina Hi Seq X Ten平台进行转录组测序,结合定量和转录组数据进行生信分析。结果 6个螺甾烷型重楼皂苷在球药隔重楼根茎、茎和叶中的含量具有显著差异。Illumina转录组测序共获得61 755条非冗余unigenes,其中30263条（49.0%）被成功注释。催化生成薯蓣皂苷元的31个关键基因均被成功鉴定,且基因表达模式与皂苷的积累水平总体一致,其中IDI、8,7SI-4、CYP90G4、SMO2-2、C5-SD1、CYP51G、C14-R-2、HMGCR、CPI-5、CYP94D108、CAS、HMGCS、SMO1-3、SSR1-3、SQS、isp H和DXR等基因与重楼皂苷的积累呈显著正相关。共获得了61条尿苷二磷酸糖基转移酶（UGT）基因,其中30条潜在参与重楼皂苷的糖基化修饰。结论 球药隔重楼根茎、茎和叶中皂苷合成基因表达模式与皂苷积累规律存在一致性,鉴定的基因可指导该类活性产物的生物合成途径解析。     

积雪草皂苷生物合成基因筛选与表达量分析

目的：筛选积雪草皂苷生物合成相关的关键酶基因,并利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术进行验证。方法：采用HPLC对积雪草不同部位进行皂苷含量测定;利用转录组学、KEGG富集分析等手段挖掘积雪草皂苷生物合成关键酶基因;采用qRT-PCR技术验证挖掘出的关键酶基因在不同组织中的表达模式,并使用皮尔逊(Pearson)法分析关键酶与皂苷类成分的相关性。结果：在根、茎、叶、叶柄、果实这5个不同组织中,叶的积雪草皂苷含量最高;挖掘遴选出积雪草皂苷生物合成相关的关键酶基因4个,分别为氧化鲨烯环化酶(CaOSC1、CaOSC2)、鲨烯环化酶(CaSE)、鲨烯合酶(CaSS);这4个关键酶基因均在叶中表达量最高。结论：积雪草不同组织的皂苷含量与4个关键酶基因表达量关系紧密,该结果为今后探究积雪草皂苷生物合成与积累的调控机制积累了必要的研究基础。     

药用植物甾体皂苷生物合成途径研究进展

甾体皂苷是药用植物中普遍存在的一类功效物质,由糖基和甾体皂苷元缩合而成,甾体皂苷的生物合成途径主要包括细胞质甲羟戊酸(MVA)途径和质体2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(MEP)两条途径,并以MVA途径为主。在生物合成途径中涉及一系列关键酶,包括3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR),1-脱氧-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS),1-脱氧-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR),法尼基焦磷酸合酶(FPS),鲨烯合酶(SS),鲨烯环氧酶(SE),环阿屯醇合酶(CAS),细胞色素P450酶(CYP450),糖基转移酶(SGTase)等。在综合前人研究的基础上,该文对甾体皂苷生物合成途径路线图进行了补充和细化,而对近5年来有关药用植物甾体皂苷生物合成关键酶(基因)生物学信息研究报道整理发现,药用植物中HMGR,SS,CYP450,UGT基因研究相对较多,而对FPS,SE,CAS的报道则较少。整体来看,目前对甾体皂苷生物合成途径研究尚处于初级阶段,对于关键酶功能研究缺乏强有力的直接证据。可为甾体皂苷的后续研究提供参考和理论支撑。     

盾叶薯蓣中甾体类化合物的分离与结构鉴定

目的:对盾叶薯蓣进行化学成分研究。方法:应用多种色谱法分离盾叶薯蓣中的化学成分,采用多种光谱分析法鉴定它们的结构。结果:从盾叶薯蓣中分离得到6个甾体类化合物,即三角叶薯蓣皂苷(1)、原三角叶薯蓣皂苷(2)、盾叶新苷(3)、薯蓣皂苷(4)、3-O-[β-D-葡萄吡喃糖(1→4)]-β-D-葡萄吡喃糖-薯蓣皂苷元(5)、薯蓣皂苷元(6)。结论:化合物1、2为首次从该植物中分离得到。     

土壤酸碱度和质地对盾叶薯蓣品质的影响

目的探讨土壤酸碱度和质地对盾叶薯蓣薯蓣皂苷元含量的影响。方法采用HPLC法对生长在不同酸碱度和质地土壤上的盾叶薯蓣薯蓣皂苷元含量进行分析。结果不同质地土壤上的盾叶薯蓣中薯蓣皂苷元含量差异不明显,但以沙壤土上的薯蓣皂苷元含量较高;生长在酸性、中性和微碱性土壤中的盾叶薯蓣薯蓣皂苷元含量较高,碱性越强,薯蓣皂苷元含量越低。结论盾叶薯蓣虽然对土壤质地的要求并不敏感,但是对土壤酸碱性的要求相当严格,因此,盾叶薯蓣引种驯化前,土壤酸碱性的检测是一个不可忽略的因素。     

三七PnbHLH转录因子过表达与PnCAS RNAi协同作用对皂苷合成的影响

该研究克隆了三七转录因子基因PnbHLH,其开放阅读框长为966 bp,编码321个氨基酸。构建了三七转录因子PnbHLH过表达载体,成功实现了转录因子PnbHLH基因过表达与植物甾醇合成支路关键酶基因PnCAS RNAi在三七细胞中的整合,探讨过表达PnbHLH基因与PnCAS RNAi协同作用对三七皂苷生物合成的调控作用。结果表明,转录因子PnbHLH能够与三七皂苷生物合成途径关键酶基因PnDS,PnSS和PnSE的启动子互作,进而通过调控关键酶基因的表达,间接影响皂苷的生物合成。进一步研究证明,过表达PnbHLH与PnCAS RNAi协同作用是调控皂苷生物合成更加高效的手段。与野生型和PnCAS RNAi三七细胞相比,过表达PnbHLH和PnCAS RNAi细胞系中,三七总皂苷和主要单体皂苷(Rd,Rb₁,Re,Rg₁,R₁)的含量均有不同程度提高,说明皂苷生物合成的正向调节和反向调节2种方式产生了叠加效应。该研究既发挥了转录因子的“多点调控”优势,又整合了皂苷副产物支路的弱化调节,探索出针对三七皂苷生物合成更加合理而高效的调控策略。     

倒心盾翅藤总皂苷提取工艺优化

甾体总皂苷为倒心盾翅藤抗肾结石的活性成分,该研究选用菝葜皂苷元为对照品,以1%茴香醛-硫酸作为显色剂,建立倒心盾翅藤甾体总皂苷含量测定方法。分别评价了乙醇体积分数、液料比、提取温度、提取时间对甾体总皂苷得率的影响,并且进一步通过响应曲面法优选提取工艺为乙醇体积分数50%、液料比15、提取温度100℃、提取时间3 h,甾体总皂苷得率为2.37%±0.19%。该提取工艺稳定可行,所得甾体总皂苷生物活性明确。     

薯蓣皂苷的现代药理学研究进展

<正>薯蓣皂苷广泛存在于薯蓣科、百合科、石竹科和蔷薇科等药用植物中,尤其是在薯蓣科植物根茎中含量丰富,如穿山龙、盾叶薯蓣、福州薯蓣等。祖国医学认为薯蓣皂苷归脾、肺、肾经,具有祛痰、舒筋活血、消食利水等作用。薯蓣皂苷为糖缀合物,非极性三萜或类固醇苷骨架可以连接一个或多个糖链,化学结构上与甾体激素非常相似~([1]),是工业上提取甾体激素的重要原料。近年来,随着科学技术的不断     

利用转录组分析款冬萜类化合物生物合成关键酶基因及表达特征

目的挖掘与款冬萜类化合物生物合成途径相关的关键酶基因。方法利用Illumina HiSeq2500测序平台对野生款冬花蕾和叶进行转录组测序,使用Trinity软件de novo从头组装,并通过基因功能注释、差异表达基因分析等生物信息学方法进行分析,挖掘款冬中萜类化合物生物合成途径相关的酶基因。结果转录组测序获得39 912 371条高质量reads(SRA号:SRR9113366,SRR9113367),组装获得91 118条Unigene,55 830条Unigene在NR、Swiss-Prot、GO、COG、KEGG等数据库得到注释。鉴定出参与款冬萜类化合物生物合成相关酶基因的129个Unigene,包括91个参与三萜骨架生物合成酶基因,32个萜类合成酶基因,6个细胞色素P450基因,其中差异表达基因25个,涉及上游MVA途径的4个差异基因在花蕾中表达量高于叶,MEP途径的5个差异基因在叶中表达高于花蕾,另外还有10个基因在叶中高表达,9个基因在花蕾中高表达。根据差异基因HMGR、TPS、AS、CYP450基因在花蕾中高表达,推测可能与花蕾中萜类物质含量高有关。结论从款冬转录组数据库中初步获得了可能参与萜类化合物生物合成途径的候选关键酶基因,为进一步阐明款冬萜类化合物生物合成的分子机制奠定基础。     

基于转录组测序揭示适度干旱胁迫对丹参基因表达的调控

目的对丹参进行转录组测序,分析丹参不同组织响应适度干旱胁迫的分子机制。方法以栽培4个月的丹参为材料,设置适度干旱胁迫组(土壤相对含水量55%～60%)和对照组(土壤相对含水量75%～80%),应用IlluminaHi Seq2000分别对根和叶进行转录组测序,对测序后的结果进行基因功能注释、差异表达基因(differentiallyexpressedgenes,DEGs)筛选和共表达网络分析等。结果转录组测序共获得58085条Unigene。其中28846条被注释,根和叶中的DEGs分别有1853、1457个。GO富集结果表明,丹参根和叶中的DEGs在GO功能部位中的分布基本一致,均在代谢过程、刺激响应、细胞结构、催化活性等功能中得到显著富集。KEGG途径富集分析表明,根中DEGs显著富集在DNA复制、植物激素信号转导、植物-病原菌相互作用、胡萝卜素合成等途径,叶中DEGs则主要富集在氨基酸、生物碱、苯丙烷类生物合成等途径。适度干旱胁迫能促进丹参叶中苯丙烷类、根中萜类化合物生物合成途径关键酶基因的表达,是促进丹参有效成分累积的基础。AP2/ERF、b HLH、b ZIP、WRKY、MYB类转录因子在根和叶中差异表达均较显著,基因共表达网络分析预测了在适度干旱胁迫下可能参与调控萜类基因表达的转录因子。结论通过高通量转录组测序,揭示了适度干旱胁迫对丹参不同组织基因表达的调控特征,可为深入研究丹参药效成分的生物合成机制和在栽培中的合理灌溉提供科学依据。     

聚氧乙烯-马来酸酐聚合物改性纤维素酶催化酸水解盾叶薯蓣薯蓣皂苷元的研究

目的提高纤维素酶在催化过程中的稳定性，并考察聚氧乙烯-马来酸酐聚合物改性纤维素酶在盾叶薯蓣薯蓣皂苷转化为薯蓣皂苷元过程中的可行性。方法采用聚氧乙烯-马来酸酐共聚物对纤维素酶进行化学改性，并以相对酶活考察改性酶的稳定性。以薯蓣皂苷元的提取率和熔点为指标，比较了纤维素酶和改性酶的辅助催化作用。对改性酶催化所得薯蓣皂苷元产品进行元素分析和HPLC分析。结果改性酶在高温下的活力衰减速率减小，在50℃pH4．8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中放置100min，保持了初始酶活的69．4％。改性酶辅助催化盾叶薯蓣中薯蓣皂苷的转化时，较未改性酶的效果好，所得薯蓣皂苷元产品提取率为97．6％以上，为白色或乳白色，熔点为200-203℃，元素分析结果为H：77．96％，O：10．11％，HPLC法测定的质量分数高达96．03％。结论聚氧乙烯-马来酸酐聚合物改性纤维素酶在较高温度下能够保持较高的催化活性，可以更有效地促进盾叶薯蓣薯蓣皂苷向薯蓣皂苷元的转化．     

盾叶薯蓣药材甾体总皂苷成分HPLC-ELSD指纹图谱的研究

建立不同产地盾叶薯蓣药材中甾体总皂苷成分HPLC-ELSD指纹图谱的方法.采用Welchrom C₁₈(4.6 mm ×250 mm,5 μm)色谱柱,乙腈(A)-水(B) 作为流动相,梯度洗脱;柱温室温;体积流速1.0 mL·min^-1;蒸发光散射检测器条件:漂移管温度90.0℃,载气(N₂)流速2.8 L·min^-1;进样体积10 μL.通过检测10个批次盾叶薯蓣药材,首次建立了盾叶薯蓣甾体总皂苷成分HPLC-ELSD指纹图谱的共有模式,确定了25共有峰,并利用对照品对照法对其中的10个共有峰进行了成分指认.以共有模式对10批药材进行相似度评价,其相似度全部大于0.80.该方法准确、可靠、重复性好,为全面评价和控制盾叶薯蓣药材的质量提供了科学依据.     

盾叶薯蓣WRKY转录因子的鉴定和生物信息学分析

目的鉴定盾叶薯蓣WRKY(DzWRKY)转录因子家族基因,分析DzWRKY蛋白的序列特征,检测DzWRKY在根和叶中的表达量。方法以拟南芥WRKY基因的c DNA为查询序列,应用BLASTn进行比对,应用生物信息学方法进行全长开放阅读框(ORF)预测和蛋白序列特征分析,根据转录组数据检测DzWRKY的表达量。结果共检测到27个具有全长ORF的DzWRKY家族基因,其中6个基因编码的蛋白具有2个WRKY结构域。DzWRKY蛋白均为亲水性蛋白,亚细胞预测为核蛋白,WRKY结构域序列保守程度高。进化分析均把27个DzWRKY蛋白和19个At WRKY蛋白分为3个大类群。27个DzWRKY在叶片中的表达量均比根茎低,高表达的DzWRKY基因主要集中在第I类和第IId亚类。盾叶薯蓣WRKY与已知功能的WRKY序列相似性较低。结论首次从盾叶薯蓣中鉴定出DzWRKY基因,为进一步阐明DzWRKY在盾叶薯蓣生长发育和药效成分代谢中的作用奠定基础。     

盾叶薯蓣中有效成分含量的影响因素研究

目的:探讨影响盾叶薯蓣中有效成分含量的因素,更好地控制其质量。方法:参照2010年版《中国药典》(一部)测定水分,高效液相色谱法测定薯蓣皂苷元的含量,对含水量、生长年限、产地及土壤类型与薯蓣皂苷元含量的相关性进行研究。结果:生长在沙土地上的盾叶薯蓣中薯蓣皂苷元含量相对较高,一般生长3~5年薯蓣皂苷元含量达到最大值,而且薯蓣皂苷元含量与盾叶薯蓣根茎中含水量呈正相关,但3个产区的盾叶薯蓣薯蓣皂苷元的含量差别不大。结论:本实验以薯蓣皂苷元为评价盾叶薯蓣质量的指标,分析了生长年限、水分含量、土质、产地等对其质量的影响,为指导工业生产和药农规范化种植,获得更高的经济效益,建立和完善盾叶薯蓣药材的质量标准体系提供参考。     

滇重楼甾体糖基转移酶的克隆及功能表征北大核心CSCD

该研究从滇重楼中克隆得到糖基转移酶基因PpUGT2,该基因ORF长度为1773 bp,编码蛋白质的氨基酸为590个。系统进化树分析显示,该糖基转移酶归为UGT80A亚家族,经国际糖基转移酶命名委员会命名为UGT80A49。构建原核表达载体pET28a-PpUGT2,通过诱导蛋白表达及蛋白提取,进行体外酶促实验,以UDP-葡萄糖为糖基供体,薯蓣皂素和偏诺皂素为底物,鉴定了其具有催化薯蓣皂素及偏诺皂素C-3羟基β糖基化的功能,为进一步研究其催化特性,对其进行了底物宽泛性研究,以UDP-葡萄糖为糖基供体,共选取了包括甾体及三萜类化合物在内的15个底物,发现其具有催化甾体类化合物睾酮C-17羟基糖基化的功能。通过同源建模及分子对接,预测了PpUGT2与底物薯蓣皂素及偏诺皂素之间相互作用的关键识别位点。并且通过对配体与多肽的氨基酸扫描,模拟突变,根据复合物的结合亲和力变化,在以底物为中心的5Å范围内,寻找到了最佳突变体,对突变体的设计具有参考意义。该研究为完整解析重楼皂苷生物合成途径以及甾体类糖基转移酶的结构研究奠定了基础。     

基于转录组数据对七叶树中三萜皂苷合成途径的研究

七叶树是七叶树科七叶树属高大乔木,集药用与观赏于一身。七叶树种子是其主要的药用部位,主要有效成分为齐墩果烷型三萜皂苷类化合物七叶皂苷。为了解七叶树三萜化合物生物合成的分子基础,该研究采用Illumina Hi Seq 2000高通量测序获得七叶树种子与花的转录组数据,并对其代谢途径相关基因进行挖掘;使用Trinity软件实现unigene的de novo拼接;并将转录组的测序结果运用KEGG数据库进行注释,从而预测七叶树三萜代谢的具体途径。结果显示七叶树转录组共有2个三萜代谢途径相关数据集,分别为萜类物质前体代谢途径(途径编号为ko00900)和倍半萜与三萜代谢途径(途径编号为ko00909),对应的基因分别有47,27条。进一步根据催化酶与活性产物的总结比较分析发现萜类物质前体代谢途径相关酶共有8种,三萜代谢途径相关酶有3种。该研究首次在七叶树中解析出5条与三萜环化酶对应的基因,它们可能参与β-香树精合成进而形成七叶皂苷。通过种子与花的转录组表达差异分析显示,ko00900和ko00909途径相关的差异基因有33个;相对于花器官,种子中有17个unigenes表达量上调,16个unigenes表达量下调。该研究运用qRT-PCR实验对SQE(Unigene25806),HMGS(Unigene36710),β-AS(Unigene33291) 3个差异显著的关键酶基因的表达进行了试验验证,实验结果qRT-PCR结果与转录组数据一致。该研究所发现的七叶树的三萜皂苷合成相关候选基因能对七叶树三萜代谢合成与调控方面提供理论依据。