基于居群DNA条形码的药用植物黄芩的产地鉴别研究

目的:利用居群DNA条形码阐明不同产地(居群)黄芩的遗传分化程度,对其进行产地鉴别。方法:应用进化速率快和母系遗传的叶绿体DNA基因间序列,基于分子谱系地理学理论筛选出居群间遗传分化明显的片段,构建单倍型网状进化树,根据单倍型在网状进化树中的位置、出现的频率和地理分布范围的大小,划分出不同层次的居群DNA条形码,以用于地理分布范围宽窄不同的产地鉴别。结果:本实验筛选出3个叶绿体DNA基因间序列atpB-rbcL,trnL-trnF和psbA-trnH对17个黄芩野生居群进行分子谱系地理学分析,得到13个多态位点,共20个单倍型,其中3个分布最广、频率最高的单倍型可用于较广地域的产地鉴别,称为区域居群DNA条形码;3个分布次之、只存在于2～3个邻近居群的单倍型可用于较窄地域的产地鉴别,称为地区居群DNA条形码;另有8个仅局限在某一个居群的单倍型可用于特定居群的鉴别,称为居群特有DNA条形码。结论:叶绿体基因间序列在居群间存在明显遗传分化,可用于地理分布范围宽窄不同的黄芩产地鉴别。     

北柴胡特异DNA条形码筛选及种质资源鉴定

目的 基于北柴胡Bupleurum chinense叶绿体基因组筛选特异性DNA条形码,并利用特异DNA条形码鉴定不同产地北柴胡种质资源。方法 利用Illumina HiSeq X Ten平台对北柴胡进行叶绿体基因组测序,利用mVISTA软件和核酸多样性分析筛选特异性片段,基于特异性片段进一步分析不同产区北柴胡样品单倍型。结果 不同产地3份北柴胡叶绿体基因组全长为155 557～155 959 bp,均呈现典型的环状四分体结构,均编码131个基因。trnV-UAC、trnC-GCA_petN、petN_psbM、ndhF_rpl32可以作为潜在的北柴胡种质资源鉴定的特异性DNA条形码。基于扩增效率,选择petN_psbM和ndhF_rpl32对来自4省7个产地177份北柴胡样品进行序列分析,结果表明petN_psbM和ndhF_rpl32分别有91和78个变异位点,分别鉴定到28、29个单倍型;两段序列联合分析形成40个单倍型（Hap1～Hap40）,各单倍型的遗传距离为0～0.022。6个产地拥有特有单倍型,可以将不同产地的北柴胡种质资源进行区分。结论 利用比较叶绿体基因组学筛选的特异DNA条形码petN_psbM和ndhF_rpl32可以用于北柴胡种内种质资源鉴定,为后续鉴定北柴胡的产地来源、种质资源保护利用和育种等工作奠定基础。     

不同产地巴戟天叶绿体基因组比较研究

目的以来自道地药材产区规范化种植基地的巴戟天叶绿体基因组为参考,通过对比不同产地巴戟天叶 绿体基因组的碱基变异和遗传距离的差异,探讨巴戟天药材的道地性。方法利用Illumina Hiseq 2500 测序平 台进行高通量测序,利用CMA V1.1.1 软件进行分析和组装叶绿体基因组,在基因注释的基础上,比对广东、 福建、广西和海南不同产地巴戟天叶绿体基因组碱基突变情况和遗传差异情况。结果与参考基因相比,广东 巴戟天群体叶绿体基因组相同,碱基差异数和遗传距离为0;福建巴戟天群体叶绿体基因组碱基差异数为4~ 16 个,遗传距离为0.026~0.126;广西巴戟天群体和海南巴戟天群体叶绿体基因组差异主要为集中在大单拷贝 区的单碱基突变和插入缺失突变,叶绿体基因组碱基差异数为71~81 个,遗传距离为0.470~0.536。结论优 良的种质资源是形成道地药材的重要遗传因素,种质资源包含的特定基因是形成道地药材的关键,该研究从基 因水平上证明了广东巴戟天种源稳定,广东巴戟天群体叶绿体基因变异少,显示出广东为巴戟天道地产区具有 科学性。不同产地的巴戟天叶绿体基因组碱基存在突变差异,这些差异可以为巴戟天的分子标记、遗传背景、 种质资源保护及植物系统发育进化等研究奠定基础。     

党参药材及其混伪品的ITS/ITS2条形码鉴定研究

为简便有效地鉴定党参药材及其混伪品并验证ITS/ITS2 序列作为DNA 条形码鉴定药材的稳定性和准确性,本研究选用党参药材及其混伪品作为研究对象,对33 份药材样本提取基因组DNA,通过PCR 扩增ITS 序列,采用比对法、最小距离法对序列鉴定能力进行评估。通过序列比对,分析变异位点信息确定不同的单倍型并计算种内和种间K2P 距离。ITS2 序列采用基于隐马尔可夫模型的HMMer（Hidden Markov Model）注释方法获得。结果表明,党参药材3 个基原物种ITS 序列长度为654-655 bp,ITS2 序列长度均为239 bp,ITS/ITS2 序列种内平均K2P 遗传距离均远小于其与混伪品的种间平均K2P 遗传距离,因此ITS/ITS2 序列作为DNA 条形码能稳定、准确鉴别党参药材及其混伪品,为其鉴定提供新的技术手段。     

益母草叶绿体基因组序列与系统进化位置分析

目的:对益母草叶绿体基因组序列与系统进化位置进行分析,旨在为益母草种质资源的开发和利用提供科学依据。方法:采用二代测序技术对益母草全基因组DNA进行测序,并成功组装了其完整的叶绿体基因组。结果:益母草叶绿体基因组全长159 375 bp,由一个大的单拷贝区(LSC)87 204 bp,一个小的单拷贝区(SSC)17 515 bp和一对27 099 bp的反向重复序列(IRs)组成。基因组注释结果显示其共编码115个基因,包括99个蛋白编码基因、38个t RNA基因和8个r RNA基因。叶绿体基因组GC含量为38.41%。同时,本研究共检测到160个简单重复序列和49个串联重复序列。结论:系统发育分析表明,益母草属与水苏属的亲缘关系较近,本研究为益母草药材精准鉴定与遗传多样性研究奠定了基础。     

三叶崖爬藤叶绿体基因组的组装与序列分析

目的以药用植物三叶崖爬藤为材料,在利用高通量技术测定DNA序列的基础上,对叶绿体基因组进行组装和序列分析,为进一步开展群体遗传学和多样性研究奠定基础。方法利用HiSeqXTen测定三叶崖爬藤的DNA序列,用NOVOPlasty组装叶绿体基因组,在基因注释的基础上开展序列分析。结果三叶崖爬藤叶绿体基因组的全长为160 189 bp,GC值37.5%,具1个典型的四分区域结构,包括1个大单拷贝区、1对反向重复区和1个小单拷贝区,序列长度分别为88 184、26 519、18 967 bp。三叶崖爬藤的叶绿体基因组共有133个基因,其中编码蛋白基因、rRNA基因与tRNA基因的数量分别为88、8、37个。位于反向重复区和小单拷贝区的ycf1基因3’端发生缺失,是1个假基因。结论三叶崖爬藤的叶绿体基因组的组装和序列分析为后续开展群体遗传学和遗传多样性研究奠定了基础。     

药用植物萹蓄叶绿体基因组特征与系统进化分析

目的 以药用植物萹蓄Polygonumaviculare为材料,利用高通量技术测定基因组DNA序列,对叶绿体基因组进行组装和序列分析,为进一步开展药用植物萹蓄的群体遗传学和遗传多样性研究奠定基础。方法 利用华大MGISEQ-2000PE150测序平台,双末端测序策略对其全基因组DNA建库测序,测定萹蓄的基因组DNA序列,用NOVO Plasty组装叶绿体基因组,采用最大似然法（maximum likelihood,ML）构建系统进化树。结果 萹蓄叶绿体基因组全长为163 461 bp,GC值37.5%,具1个典型的四分区域结构,包括1个大单拷贝区（large single copy region,LSC）、1对反向重复区（inverted repeats,IR）和1个短单拷贝区（small single copy,SSC）,序列长度分别为88 023、31 066、13 306 bp。萹蓄的叶绿体基因组共有130个基因,其中编码蛋白基因、r RNA基因与t RNA基因的数量分别为83、8、37个。系统进化分析表明,萹蓄与木蓼属的额河木蓼构成一单系分支,具有100%支持率。结论 萹蓄隶属...     

基于ITS2序列及二级结构的维吾尔族药材孜然及其混伪品鉴别

目的 应用DNA条形码技术,建立维吾尔族药材孜然及其混伪品小茴香、芫荽子的分子鉴别方法。方法 提取38批孜然及其混伪品的基因组总DNA,聚合酶链式反应（PCR）扩增内转录间隔区2（ITS2）序列并双向测序,测序结果经CodonCode Aligner软件进行序列拼接,利用MEGA软件分析序列特征,计算种内、属间遗传距离,构建邻接（neighbor-joining,NJ）系统聚类树,预测其ITS2二级结构。结果 孜然药材ITS2序列中主体单倍型为A₁,序列长度均为226 bp,鸟嘌呤（G）+胞嘧啶（C）占比为47.79%~48.23%;小茴香ITS2序列中,主体单倍型为B₁,序列长度均为224~227 bp,G+C占比为53.30%~55.36%;芫荽子ITS2序列中,主体单倍型为C₁,序列长度均为220~227 bp,G+C占比为56.82%~56.83%。孜然的种内遗传距离明显小于属间遗传距离。二级结构表明,孜然及其混伪品螺旋区的茎环大小、数目、位置及螺旋角度均有明显差异。结论 ITS2序列作为DNA条形码能稳定、准确地鉴别孜然及其混伪品药材,为保障孜然临床安全用药提供了有效技术手段。     

露兜树叶绿体基因组结构与序列特征分析

目的 明确露兜树Pandanus tectorius Soland叶绿体基因组的结构、序列特征和系统进化关系。方法 以露兜树叶片总DNA为材料，采用illumina NovaSeq高通量测序列平台进行叶绿体基因组测序，利用生物信息学工具对其进行组装、注释和特征分析，并基于最大似然法构建系统进化树。结果 露兜树叶绿体基因组呈典型的环状四分体结构，全长为157 747 bp，其中大单拷贝区的长度为85 929 bp，小单拷贝区的长度为17 992 bp，两个反向互补区的长度则均为26 913 bp。共含有131个基因，其中蛋白编码基因85个，核糖体RNA基因8个，转运RNA基因38个。露兜树叶绿体基因组密码子偏向使用A或T碱基结尾；共检测到144个简单重复序列，其中以A或T碱基的单核苷酸重复为主。基于叶绿体基因组序列的系统进化分析显示露兜树与同目植物巴拿马草同源性较高。结论 获得了露兜树叶绿体基因组序列及其特征信息，为该药用植物的分子标记开发和遗传多样性研究奠定了基础。     

基于ITS条形码的滇鸡血藤及混伪品分子鉴定

目的：基于内转录间隔区（ITS）序列,运用DNA条形码技术对滇鸡血藤药材及其混伪品进行序列比对分析,根据单核苷酸多态性位点构建滇鸡血藤单倍型数据库,建立快速、准确鉴定滇鸡血藤的分子鉴定方法。方法：以滇鸡血藤及其混伪品为材料,利用DNA提取试剂盒,分别提取滇鸡血藤及其混伪品的总DNA,对ITS序列进行聚合酶链式反应扩增及测序分析,使用DNAMAN软件统计其片段长度及变异位点个数,使用MEGA软件对数据进行分析比对,计算Kimura2-parameter遗传距离,并利用邻接法建立系统发育树进行分析。结果：滇鸡血藤ITS序列片段长度为675 bp,共包括19种单倍型,与其主要混伪品的差异位点为212、223、224 bp,系统发育树显示,ITS序列能够区分滇鸡血藤及其混伪品。结论：ITS条形码可以作为区分鉴定滇鸡血藤及其混伪品的分子条形码,包含19个单倍型的单倍型数据库覆盖了滇鸡血藤全部的单倍型。     

栽培奇楠沉香叶绿体基因组特征及系统发育分析北大核心CSCD

以栽培奇楠沉香“糖结”叶片为材料,利用高通量测序技术获取其叶绿体基因组,并结合NCBI下载的12个沉香属叶绿体基因组,采用生物信息学方法明确其叶绿体基因组特征及系统发育关系。结果表明,栽培奇楠沉香“糖结”的叶绿体基因组序列长度为174 909 bp,GC量为36.7%,共注释基因136个,其中蛋白质编码基因为90个、tRNA为38个、rRNA为8个。重复序列分析共检测得到80个SSR和124个长重复序列,其中,SSR大部分由A和T碱基重复组成。密码子偏好性分析结果表明AUU是使用次数最多的密码子,密码子倾向使用A和U结尾。沉香属叶绿体基因组比较分析显示,IR区边界相对保守,共获得5个高变异区域:trnD-trnY、trnT-trnL、trnF-ndhJ、petA-cemA、rpl32,可作为潜在的沉香属特异性DNA条形码。选择压力分析结果表明rbcL、rps11、rpl32基因参与正向选择。系统发育分析结果显示栽培奇楠沉香“糖结”和白木香聚为一支(支持率100%),支持国产奇楠沉香种质基原植物为白木香。该研究得到的叶绿体基因组数据可为栽培奇楠沉香的遗传多样性研究和沉香属分子鉴定奠定基础。     

川芎种质鉴定标记开发和系统发育研究

目的基于藁本属Ligusticum叶绿体基因组高频插入缺失区域开发InDel标记,同时结合通用条形码对道地川芎及其常用混伪品进行种质鉴定和系统发育研究。方法通过8个DNA通用条形码ycf1、matK、ITS2、rpoC1、rbcL、rpoB、trnK、psbA-trnH序列片段对采集的26个川芎样品及其常用混伪品进行了扩增和测序,采用了遗传距离统计法、barcoding gap分析法和构建系统发育树法进行亲缘关系和系统发育研究。同时利用InDel分子标记,采用构建进化树法对道地川芎及其混伪品物种进行分子鉴定。结果 rbcL片段保守位点最多(97.32%),且GC含量最高(44.9%)。rbcL+rpoB片段具有最小的平均种内遗传距离(0.002 5),psbA-trnH片段具有最大的平均种间遗传距离(0.429 2)。trnK片段和rbcL+rpoB片段具有最高的种间变异,psbA-trnH片段的"barcodinggap"区重叠度最小。采用的8对DNA通用条形码无法准确地鉴定道地川芎药材与其他混伪品物种。InDel分子标记的聚类分析中,24对InDel引物中的4对引物组合能准确地鉴定出道地川芎,并将道地川芎及其混伪品物种聚类为4个分支,其中一个分支为采集的道地川产川芎药材。结论 InDel标记对道地川芎及其常用混伪品的鉴定能力高于通用条形码。对于传统的通用DNA条形码,由于遗传成分差异大,无法区分川芎及其常用混伪品。新开发出的InDel分子标记可以有效地鉴定道地川芎及其常用混伪品,从分子水平上为川芎道地性研究提供有效手段。     

单叶铁线莲叶绿体基因组的序列特征与系统发育分析

目的 以药用植物单叶铁线莲Clematishenryi叶片为材料,在高通量测序、组装和序列分析的基础上,明确叶绿体因组的序列特征和系统发育关系。方法 利用CTAB法提取叶片基因组DNA,通过NovaSeq6000平台测序,再用NovoPlasty组装叶绿体基因组,借助PhyML生成系统发育树。结果 单叶铁线莲的叶绿体基因组全长159707bp,GC值为38.0%,大单拷贝区、小单拷贝区和反向重复序列的长度分别为79 449、18 100、31 079 bp;单叶铁线莲的叶绿体基因组总共有基因137个,其中蛋白质编码基因、tRNA、rRNA的数量分别为91、36、8,另有2个假基因,分别为Ψycf1和ΨinfA。序列比对结果表明,单叶铁线莲与牯牛铁线莲叶绿体基因组的相似性最高,达99.6%;共检测到41个SSR,其中40个为单核苷酸重复,1个为三核苷酸重复。系统发育分析结果表明,单叶铁线莲与牯牛铁线莲和大叶铁线莲聚于一组,支持率达100%。结论 单叶铁线莲叶绿体基因组的组装、序列分析和系统发育分析,为该药用植物的遗传结构和遗传多样性研究奠定了基础。     

基于ITS2序列及二级结构鉴别维吾尔药材黑加仑及混伪品

目的 建立了基于核基因内部转录间隔区(ITS2)序列及二级结构鉴别维吾尔药材黑加仑及其混伪品(黑加仑葡萄和异果小檗)的方法。方法 对维吾尔药材黑加仑及其混伪品的ITS2序列进行聚合酶链式反应(PCR)扩增并双向测序，Codon Code Aligner软件对测序峰图进行序列拼接，用MEGA 6.0软件对拼接后的序列进行多重比对。计算种内、种间遗传距离，构建邻接法(Neighbor-Joining, N-J)系统聚类树，预测其ITS2二级结构。结果 经PCR扩增测序后，黑加仑药材ITS2序列长度均为238 bp, GC含量为57.14%～57.98%,A₁为主体单倍型；黑加仑葡萄药材序列长度均为226 bp, GC含量为47.79%,仅为一个单倍型；异果小檗药材序列长度均为223 bp, GC含量为53.36%,仅为一个单倍型。并且维吾尔药材黑加仑的种内遗传距离明显小于种间遗传距离。二级结构表明黑加仑及混伪品其螺旋区的茎环数目、大小、位置以及螺旋角度均有明显差异。结论 ITS2序列可以作为鉴定维吾尔药材黑加仑及其混伪品的DNA条形码，为维吾尔药材黑加仑的用药安全提供...     

射干叶绿体基因组结构、序列特征与系统发育分析

目的以射干Belamcanda chinensis为材料,在测序、组装获得叶绿体基因组的基础上,明确其结构、序列特征及系统发育关系。方法利用PE150双末端策略进行建库测序,用NOVOPlasty组装完整的叶绿体基因组,经PCR验证边界,借助生物信息学工具进行序列分析和系统发育研究。结果射干的叶绿体基因组全长为153816bp,大单拷贝区、反向重复区和小单拷贝区的长度分别为83 143、26 214、18 245 bp。射干叶绿体基因组共有133个基因,编码基因、t RNA和r RNA的数量分别为92、38和8;ycf1有2个拷贝,其中一个为假基因。系统发育分析结果表明,7种植物叶绿体基因组在发育树上可分为4组,射干与同为鸢尾科的溪荪聚为一组,支持率达100%。结论射干叶绿体基因组的组装、序列分析和系统发育分析,为该药用植物的遗传结构和遗传多样性研究奠定了基础。     

基于叶绿体全基因组的贝母属特异性DNA条形码的筛选

本研究通过对贝母属4个物种叶绿体基因组进行全局分析,分别查找基因区域和基因间区的高变异区域,筛选用于高效鉴别贝母属植物的新DNA条形码序列。相关研究发现贝母属植物的基因区域序列相似度极高,不适用于DNA条形码鉴定研究;共有7个基因间区可以作为潜在的贝母属植物鉴定的特异性DNA条形码。本研究所构建的DNA条形码筛选方法,为筛选用于难鉴定科属的新的DNA条形码提供了通用的方法体系。     

不同产地忽地笑的叶绿体基因psb A-trn H序列分析

目的通过叶绿体基因psb A-trn H序列分析,探讨我国忽地笑种质资源的系统进化关系及分子鉴定方法。方法分别提取15省(市)52个忽地笑居群的DNA,经PCR扩增叶绿体基因psb A-trn H序列及测序,并用Mega5.0等软件对测序结果进行分析。结果 52条psb A-trn H序列长度为544～656 bp,GC含量为35.8%～37.0%,遗传距离为0.000 00～0.009 47;核苷酸变异(多态性)位点数共33个,其中简约信息位点9个,单一突变位点18个,插入/缺失片段6个;单倍型数量(H)10个,单倍型多态性水平(Hd)0.749,核苷酸多态性(π)0.002 63,收集的忽地笑资源具有较高的遗传多样性。最大简约法(maximum parsimony,MP)系统树中52个居群聚为4类,并且该聚类结果与其地理分布基本一致。结论不同产地忽地笑居群的遗传变异较大,psb A-trn H序列可作为忽地笑种源分子鉴定的依据;我国忽地笑种质资源在进化上具有明显的地域性特征。     

河南产不同种群茜草遗传多样性分析

目的 对河南7个野生种群的茜草遗传多样性进行调查,为茜草野生资源的保护提供科学依据。方法 通过DNA测序技术分析叶绿体基因片段psbA-trnH遗传变异。结果 psbA-trnH序列共得到40个单倍型（H1～H40）,单倍型多样性指数为0.951 0±0.001 3,核酸多样性指数为0.014 77,遗传分化指数为0.081 53,种群间基因流为2.78。结论 河南地区野生茜草有很高的遗传多样性,种群间存在较强的基因流,种群间分化较小。     

基于多基因组片段构建枸杞属药用植物DNA条形码

目的采用核基因组核糖体DNA ITS区、叶绿体基因组9个DNA片段和线粒体基因组2个DNA片段构建国产枸杞属药用植物DNA条形码。方法采集枸杞属黑果枸杞Lycium ruthenicum、黄果枸杞L.barbarum var.auranticarpum、宁夏枸杞L.barbarum、枸杞L.chinense和新疆枸杞L.dasystemum 5个分类群标本及实验样品,测定各样品的核糖体ITS区,叶绿体mat K、rbc L、rpo C1、trn L(UAA)intron、psb A-trn H、atp B-rbc L、trn S(GCU)-trn G(UCC)、rpl20-rps12、trn L(UAA)-trn F(GAA)和线粒体nad1第2内含子、nad5第4内含子序列;以全萼秦艽Gentiana lhassica为外类群,进行系统学分析。结果共获得108条序列,ITS区变异位点最为丰富;筛选出6个叶绿体DNA片段;2个线粒体DNA片段可作为该属3个物种的条形码推荐序列;构建各物种多基因组多片段组合DNA条形码。结论 ITS区及筛选的6个叶绿体DNA片段均具有物种鉴别意义;2个线粒体DNA片段具有一定鉴别意义;为枸杞类物种鉴定及遗传背景分析提供基础资料。     

石斛属叶绿体DNA序列的系统发育及变异位点分析

目的对石斛属叶绿体IRa(trn V-GAC~trn R-ACG)序列进行系统发育和变异位点分析,深入了解石斛属10个物种此序列所含9个基因的异同,为石斛属植物的系统进化历程及DNA条形码的研究作重要探索。方法用改良试剂盒法提取石斛属10个样本总DNA,自行设计引物,采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)及T载体对PCR产物进行克隆转化,扩增石斛属叶绿体IRa序列的DNA序列,并与NCBI数据库进行序列比对完成序列拼接;绘制此区域序列的基因结构图,对10条目的序列进行差异位点、遗传距离、系统进化关系等分析。结果目的序列长约7 800 bp,10条目的序列共存在55个差异位点,在基因trn V-GAC、rrn16、trn I-GAU、trn A-UGC、orf42、rrn23及基因间隔区上分布的个数分别是1、8、12、6、1、9和18个;系统发育分析将石斛属10个样本聚为4个类群。结论建立了测定石斛属叶绿体IRa序列的方法,对石斛属这一序列的系统发育和变异位点分析表明,此区域序列丰富,且较为集中分布的变异位点将为石斛属DNA条形码的进一步研究、石斛属资源的道地性评价及相关的种质资源鉴定提供较好的理论依据。