大鼠肝星状细胞和库普弗细胞的分离培养及鉴定

目的 应用改良的方法同步分离、培养和鉴定原代大鼠肝星状细胞(HSC)和库普弗细胞(KC).方法 采用Ⅳ型胶原酶肝脏灌注消化及Percoll密度梯度离心体外同步分离、纯化及培养HSC和KC,并用光学显微镜、免疫组织化学染色、电子显微镜等方法进行鉴定.结果 每只大鼠HSC和KC的细胞获得率分别为(1.8～2.9)×107和(0.8～1.4)×107,平均纯度分别为94.7%±1.7%和95.2%±1.5%,活力分别为95.5%±1.3%和96.4%±2.4%.结论 Ⅳ型胶原酶肝脏灌注消化及Percoll密度梯度离心体外同步分离培养HSC和KC方法简单,细胞获得率、活力和纯度高.     

人脐静脉血管内皮细胞体外培养的方法研究

目的建立人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)体外高效稳定培养的方法,为组织工程及相关医学基础研究提供稳定的细胞来源。方法取自愿捐赠足月妊娠分娩的新生儿脐带,用自制空针软管静脉注入0.1%Ⅱ型胶原酶,置于37℃培养箱中,消化收集,采用含5%FBS及1%内皮细胞生长因子(endothelial cell growth factor,ECGS)的内皮细胞专用培养基进行培养。将消化前后的脐带标本行HE染色,观察HUVECs脱壁情况;流式细胞仪检测原代细胞纯度;细胞培养期间于倒置相差显微镜下观察细胞形态;取第3代HUVECs行免疫细胞化学染色观察、MTT检测细胞增殖情况,并将细胞接种于细胞外基质胶Matrigel上培养24 h,观察细胞管腔形成情况。结果经Ⅱ型胶原酶消化后的脐带内HUVECs大量脱落,细胞消化完全。经Ⅱ型胶原酶37℃培养箱中消化15 min后,可获得纯度为99.56%的HUVECs;原代HUVECs培养后2～3 d生长最快,呈典型的铺路石或鹅卵石样排列,4～6 d融合成片。MTT法检测显示第3代HUVECs培养后3～4 d细胞生长最快,5 d左右融合;免疫细胞化学染色显示内皮细胞Ⅷ因子相关抗原表达阳性,培养24 h后在细胞外基质胶Matrigel上可见类似于毛细血管的完整闭合管腔形成。结论经自制空针软管静脉注入0.1%Ⅱ型胶原酶,使静脉充分充盈,内皮消化完全,采用含5%FBS和1%ECGS的内皮细胞专用培养基,可迅速获取大量高纯度、高存活率的HUVECs。     

原代猪肝细胞培养体系及培养模式的初步探讨

目的探索一高密度、高效率的原代猪肝细胞培养方法,为生物人工肝的生物材料提供一种有效的培养模式.方法采用改良Seglen二步胶原酶灌注法分离肝细胞,分别将5×106的肝细胞加入胎牛血清、猪门静脉血清的培养体系中进行方瓶静止培养及聚球培养.结果肝细胞在接种后呈明显的Cytodex-3聚集趋势.门静脉血清培养体系中肝细胞的Albumin、Urea合成能力明显高于胎牛血清组.在培养后的前3周门静脉血清培养体系中聚球细胞模式优于微载体静止培养模式.结论与胎牛血清培养体系相比,猪门静脉血清培养体系更适合原代猪肝细胞高密度培养.聚球培养是一种较为理想的原代猪肝细胞培养模式.     

兔主动脉内皮细胞制备方法的优化

目的为构建骨组织工程血管化提供优质种子细胞。方法采用血管内膜外翻和胶原酶消化法分离培养兔主动脉内皮细胞并传代;采用倒置显微镜、透射电镜观察和免疫荧光法鉴定。结果培养的血管内皮细胞在第3~5天为对数生长期,倒置显微镜下可见内皮细胞呈紧密排列、短梭多角形的"鹅卵石"形态;透射电镜可见内皮细胞特征性Weible-Palade小体;经免疫荧光法鉴定证明该细胞CD31抗原阳性。结论采用血管内膜外翻等方法制备的兔血管内皮细胞的成活率高,且纯度高、数量多、具有良好的生物学活性。该法可为骨组织工程血管化的研究提供种子细胞。     

静脉内皮细胞的培养及异体血管种植

目的 探讨血管内皮细胞种植于异体血管的可行性.方法 采用胶原酶法消化获取原代内皮细胞.原代细胞经培养后,体外扩增至一定数量后高密度种植于经处理的异体血管上,继续培养至生长牢固.观察细胞状态和生长状况.结果 内皮细胞体外培养生长正常,可顺利扩增至需要数量;其分泌von Willebrand因子功能传代后无明显变化,传代变化无统计学差异(P>0.05).种植后细胞生长正常.结论 血管内皮细胞可以经过体外培养扩增,其分泌功能无变化,在异体血管上生长良好.     

简便有效分离培养大鼠主动脉内皮细胞的一种新方法

目的：探索分离、培养鼠主动脉内皮细胞的有效方法。方法：将鼠主动脉内膜翻向外，结扎两端，置于50mL培养瓶中培养、传代，Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色。结果：培养6-8d时有少量细胞自主动脉迁移出并贴壁生长；12～14d时贴壁细胞覆盖大部分培养瓶面，约80％的细胞汇合成单层；传代细胞生长旺盛；细胞汇合后呈现典型的“鹅卵石”样内皮细胞特征，内皮细胞标志物Ⅷ因子相关抗原表达阳性；未见杂细胞。结论：此方法无损伤、不需要酶消化，能比较容易的获得高纯度大鼠原代主动脉内皮细胞，适用于细小血管内皮细胞的分离与培养。     

改良的大鼠近端肾小管上皮细胞分离纯化方法

目的　建立纯度高、操作简便的大鼠近端肾小管上皮细胞分离纯化方法。 方法 Wistar大鼠无菌取肾前先心脏抽血替代原位肾脏灌注，分离肾皮质，经Ⅰ型胶原酶消化后用45% Percoll分离液制备细胞悬液直接连续密度梯度离心。所得细胞用含10%胎牛血清的DMEM-F12培养基原代培养并传代，根据细胞形态、细胞角蛋白18（CK18）和水通道蛋白1（AQP1）免疫细胞化学染色及碱性磷酸酶化学染色进行鉴定。 结果 此简化方法获得的肾小管细胞中肾小球掺杂明显减少，培养4～5 d后细胞融合长满，呈典型上皮样细胞的鹅卵石状，其CK18、AQP1免疫细胞化学染色及碱性磷酸酶化学染色几乎均呈阳性，证实所培养细胞为近端肾小管上皮细胞。 结论 改良后的分离纯化方法可获得大量高纯度近端肾小管上皮细胞，操作简便。     

大鼠肝窦内皮细胞分离、培养及其生物学特性的初步研究

目的　建立大鼠肝窦内皮细胞 (SEC)的原代分离、培养方法 ,并研究其生物学特性。方法　胶原酶灌注结合Percoll密度梯度离心加选择性贴壁的方法分离SEC ;用光镜、扫描电镜观察培养SEC的形态学变化及超微结构 ;用Ⅷ因子和CD14免疫细胞化学染色及RECA 1单抗间接免疫荧光法观察SEC表面分子的表达。结果　分离培养的SEC得率为 (2 .0 6± 0 .35 )× 10 7/只大鼠 ,活力≥ 92 % ,纯度达 90 % ;光镜下细胞形态典型 ,SEM下可观察到特征性的窗孔结构 ;Ⅷ因子染色阴性而CD14染色阳性 ,RECA 1单抗间接免疫荧光染色阳性。结论　分离培养的SEC细胞得率、活力及纯度较高 ,形态典型且具有一般细胞所没有的窗孔结构及表面标志 ,为其功能和作用机制的深入研究奠定了基础。     

不同胶原酶消化对原代成骨细胞获得率及活性的比较

目的:比较Ⅰ、Ⅱ型胶原酶对新生大鼠颅盖骨的消化效果,选择效率较高的胶原酶,为日后从细胞水平研究中药治疗骨质疏松症的机制提供大量种子细胞.方法:新生24 h SD大鼠10只,雌雄不限,脱颈处死后取出颅盖骨,剪成约1 mm×1 mm的碎片,采用胰酶预消化15 min后将骨片按重量平分成两等份,随机分为Ⅰ型组、Ⅱ型组,分别用0.1％Ⅰ型、0.1％Ⅱ型胶原酶37℃消化1h×2次,所得细胞置于5％CO2培养箱中37 ℃恒温培养.原代细胞分别于培养0h、72 h时采用血球计数板进行计数,第2代细胞于培养48 h后采用NBT/BCIP染色液进行染色,并通过对硝基苯磷酸盐法(PNPP)进行ALP定量检测.结果:镜下观察所获得的细胞形态不规则,细胞计数显示Ⅰ型组细胞数量大于Ⅱ型组;ALP染色为阳性;PNPP法测得两组吸光度均值分别为0.427和0.262,Ⅰ型组显著高于Ⅱ型组,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:两种胶原酶均适用于成骨细胞的原代消化,但采用Ⅰ型胶原酶获得的细胞数量更多、活性更好,可为日后骨质疏松症的机制研究提供优质的种子细胞.     

人脐静脉内皮细胞分离与冻存技术及Gore-Tex人工血管内皮化

目的体外分离人脐静脉内皮细胞，进行冷冻保存，并采用冻存脐静脉内皮细胞，复融后体外扩增培养，种植于Gore-Tex表面，进行人工血管内皮化。方法脐静脉内灌注消化液分离内皮细胞，所获内皮细胞体外培养，经免疫荧光染色及扫描电镜检查，鉴定所获内皮细胞及其纯度；采用梯度降温法，冻存内皮细胞，经复苏后，进行形态学检查，以台酚蓝试验、四氮唑盐（MTT）试验、流式细胞术细胞凋亡检测等方法鉴定细胞生物特性；冻存脐静脉内皮细胞体外培养扩增后，种植于Gore-Tex材料上，并行扫描电镜观察。结果血管内灌注消化液法可获取高纯度的内皮细胞；与新鲜细胞相比，复苏的内皮细胞活力保持在95％以上；复苏后的内皮细胞HE染色及生长曲线与新鲜细胞差异无统计学意义。冻存内皮细胞的凋亡率较新鲜内皮细胞高，但无统计学差异。冻存内皮细胞成功种植于Gore-Tex材料上．细胞生长良好，覆盖于大部分Gore-Tex表面。结论冻存内皮细胞作为种子细胞对人工血管内皮化具有可行性。脐静脉灌注酶消化法可获取足够数量及纯度的内皮细胞。冻存的内皮细胞复苏后无明显形态学改变，并保持较高的活力及体外增殖能力，可作为种子细胞来源。     

PLA O CMC纳米粒子培养的猪肝细胞大鼠腹腔内移植后凋亡相关蛋白的变化

目的:探讨聚乳酸 O 羧甲基壳聚糖（PLA O CMC）纳米粒子培养的猪肝细胞大鼠腹腔内移植后移植肝细胞凋亡相关蛋白Bcl 2，Bax和Fas表达的变化。方法:原位胶原酶循环肝灌注法分离猪肝细胞。D 氨基半乳糖腹腔内注射制作大鼠急性肝衰竭模型。随机分为2组，48 h后分别将5 mLⅠ型胶原凝胶包埋的PLA O CMC纳米粒子黏附培养24 h的猪肝细胞（A组），5 mLⅠ型胶原凝胶固定培养24 h的猪肝细胞（B组）移植至急性肝衰竭大鼠腹腔内。移植量均为5.0×107个肝细胞。采用免疫组化法检测移植后3 d内移植肝细胞Bcl 2，Bax和Fas的表达情况。结果:移植后1，2，3 d，A组Bcl 2阳性细胞百分数明显高于B组（P＜0.05），Bax和Fas阳性细胞百分数明显低于B组（P＜0.05）。结论:PLA O CMC纳米粒子能上调移植猪肝细胞的抗凋亡蛋白的水平和下调凋亡蛋白的水平，具有良好的抗凋亡作用。     

内皮祖细胞和去细胞猪主动脉瓣构建组织工程瓣膜的研究

目的将内皮祖细胞(EPCs)诱导分化为内皮细胞后种植在去细胞猪主动脉瓣膜(APV)上,以期为组织工程瓣膜(TEHV)的研制提供一个新的思路。方法采用去垢剂联合胰蛋白酶法去除猪主动脉瓣膜细胞。采用密度梯度离心法从羊骨髓中分离出EPCs,并诱导分化后,免疫组织化学染色鉴定。将诱导分化得到内皮细胞种植到APV上。采用光镜和电镜检测猪主动脉瓣膜的去细胞效果。对内皮细胞在APV上的生长效果进行观察。结果猪主动脉瓣内的细胞完全去除。EPCs经定向诱导后,具有表达CD-31,CD-34,von Willebrand因子等内皮细胞特征。诱导分化后的EPCs可以在APV表面黏附生长,并且表达CD-31和yon Willebrand因子。结论EPCs可以定向诱导分化为内皮细胞并可以在APV上种植生长。     

成骨细胞与血管内皮细胞联合培养的生物学特性

目的探讨成骨细胞与血管内皮细胞联合培养的生物学特性. 方法取2周龄乳兔颅盖骨及肾脏皮质传代培养制备成骨细胞(A组)、血管内皮细胞(B组)及成骨细胞与血管内皮细胞联合培养(C组),用Ⅰ型胶原和血管Ⅷ因子免疫细胞化学染色鉴定成骨细胞和血管内皮细胞,倒置相差显微镜和组织学染色观察细胞的生长特性和细胞相容性,检测碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase,ALP)活性,观察血管内皮细胞对成骨细胞产生的ALP活性有无影响,MTT法检测细胞活力,分析细胞生长和增殖情况. 结果免疫细胞化学染色证实,培养的细胞为成骨细胞和血管内皮细胞.倒置相差显微镜、HE和Masson染色均显示两种细胞混合生长良好.ALP检测结果:C组ALP活性明显高于A组和B组(P＜0.01),A组高于B组(P＜0.05).MTT检测结果表明:C组细胞早期增殖较慢,而后期增殖较快. 结论成骨细胞与血管内皮细胞具有良好的相容性,血管内皮细胞能够增强成骨细胞的ALP活性,提高成骨细胞的增殖能力.联合培养细胞具有很强的增殖潜能.     

肝细胞对肝窦内皮细胞生长的支持作用

目的 探讨肝细胞在大鼠肝窦内皮细胞(hepatic sinus endothelial cell,HSEC)生长过程中的作用,并建立一种新的HSEC原代培养方法.方法 Ⅳ型胶原酶分离肝细胞,运用Pereoll建立的梯度密度离心以及选择性贴壁纯化HSEC,舍肝细胞条件培养液(HC-CM)的RPMI-1640培养液培养HSEC.结果 平均每只大鼠可获取2.55×107个HSEC,平均活力98%,培养24 h后纯度约91%.HC-CM有效刺激HSEC生长,促进细胞内DNA合成.HSEC体外生长保持良好的形态,维持5～6 d,扫描电镜下可见典型的"窗孔"样结构.结论 本实验方法能提供高活力的HSEC,肝细胞条件培养液内舍有多种营养因子支持HSEC生长.     

单纯Ⅱ型胶原酶消化法分离、培养人退变椎间盘髓核细胞的形态学观察

目的:探讨单纯Ⅱ型胶原酶消化法体外培养扩增人退变椎间盘髓核细胞的可行性。方法:收集20例人退变椎间盘髓核,单纯Ⅱ型胶原酶消化分离出髓核细胞并连续培养传代,倒置相差显微镜和HE染色观察细胞形态学变化,甲苯胺蓝染色检测髓核细胞内聚集蛋白聚糖的表达,免疫细胞化学法行Ⅱ型胶原染色,观察髓核细胞的类软骨表型表达情况。结果:单纯Ⅱ型胶原酶消化法可较好的分离培养人退变椎间盘髓核细胞,20例人退变椎间盘髓核,培养成功16例;原代髓核细胞平均7d贴壁,呈类圆形或多角形,P1代髓核细胞平均12h贴壁,呈大梭形或多角形,两代细胞融合95%所需时间分别为30d和7d,差异有统计学意义(P0.01);聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原主要表达于原代和P1代髓核细胞浆内,被甲苯胺蓝染成天蓝色,免疫细胞化学染色主要表现为黄褐色沉淀,两代间聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达无统计学差异(P0.05)。结论:单纯Ⅱ型胶原酶消化法可简化髓核细胞分离步骤,提高培养效率;传一代后髓核细胞增殖速率提高,但仍维持类软骨表型,表达聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原。     

人类肥大乳房乳腺上皮细胞的原代培养

目的 探讨人类肥大乳房乳腺上皮细胞的原代培养方法.方法 采用胶原酶消化培养法,在体外进行人类肥大乳房乳腺上皮细胞的分离培养,用倒置显微镜观察、细胞爬片、HE染色和细胞角蛋白免疫组织化学染色的方法对分离培养的细胞进行形态学观察和鉴定.结果 倒置显微镜下观察细胞形态呈鹅卵石型或多角型,部分形态不规则,增殖的过程中形成岛屿状闭合型的细胞群,细胞之间连接紧密.细胞HE染色可见细胞胞质呈粉红色或浅紫色,细胞核呈蓝紫色,圆形或椭圆形,核中可见深蓝色的染色体.免疫组化鉴定结果显示,培养的细胞胞浆内可见棕黄色的细胞角蛋白着色,表达上皮细胞特异的细胞角蛋白18.结论 应用酶消化法和条件培养液可以获得纯度较高的人类肥大乳房乳腺上皮细胞.     

猪肝细胞用于生物人工肝的研究进展

异种动物肝细胞一直是国外生物人工肝研究的主要细胞 ,其中猪肝细胞已成为生物人工肝应用最多的肝细胞。由于猪肝细胞的代谢功能 (细胞色素P4 5 0含量及其代谢能力 )与人工肝细胞最为接近 ,其混合氧化酶的高水平表达正是代偿肝衰竭解毒功能的重要基础〔1〕,故猪肝细胞被公认是目前生物人工肝较好的细胞材料。近年来 ,在大量实验研究的基础上 ,猪肝细胞型生物人工肝已进入Ⅱ /Ⅲ期临床研究阶段〔2〕。一、猪肝细胞用于生物人工肝的优缺点在人肝细胞来源极为困难的情况下 ,猪肝细胞在生物人工肝的实验研究和临床实验中起着重要作用〔3〕,占据…     

犬骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞定向分化的研究

目的：研究犬骨髓间充质干细胞（MSCs）在体外定向诱导,向血管内皮细胞（ECs）方向分化,探讨其作为组织工程血管种子细胞的可行性。方法：获取犬骨髓单个核细胞,体外分离出MSCs。将分离的MSCs接种于含EBM-2完全培养液的培养瓶,向内皮样细胞定向诱导分化;LG-DMEM完全培养液培养的MSCs作为对照组。对MSCs表型进行流式细胞仪鉴定;诱导的内皮样细胞进行CD31、Ⅷ因子免疫细胞化学鉴定和摄取Dil-Ac-LDL、结合FITC-UEA的双染色功能鉴定。结果：流式细胞术检测培养的原代MSCs表面标志CD44表达呈阳性,而CD34表达则呈阴性;诱导分化的内皮样细胞具有内皮细胞形态特征,与成体内皮细胞相似;诱导的内皮样细胞Ⅷ因子染色和CD31免疫荧光染色均呈明显阳性,对照组细胞为阴性;诱导的内皮样细胞Dil-Ac-LDL摄取实验和FITC-UEA结合实验,细胞呈阳性表现。结论：在体外用骨髓MSCs能够成功诱导分化为血管内皮样细胞,为组织工程血管内皮化提供了一种可行的种子细胞来源。     

白细胞介素1β对大鼠肝细胞毒性作用的细胞内信号传导途径

目的研究白细胞介素-1β(IL-1β)对原代培养大鼠肝细胞细胞毒性作用的细胞内信号传导机制. 方法使用雄性Wistar大鼠,原位胶原酶灌注分离肝细胞.应用比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)活性,Wes tern Blot方法分析c-Jun N末端激酶(JNK)、p38激酶的表达,凝胶电泳移动抑制实验检测激活物蛋白-1(AP-1)的结合活性. 结果 IL-1 β促进原代培养大鼠肝细胞LDH释放(IL-1β刺激组与对照组LDH活性分别为21.9%±3.6% 和11.0%±1.8%,P＜0.01);IL-1β通过激活JNK途径,激活转录因子AP-1,对原代培养大鼠肝细胞产生细胞毒性作用,而同时激活的p38激酶途径对这一过程起负性调节作用. 结论 IL-1β通过激活JNK途径,激活转录因子AP-1,对原代培养大鼠肝细胞产生细胞毒性作用.     

BALB/c鼠肝脏枯否细胞不同分离培养方法的比较

目的建立简便易行,存活好、产量和纯度高,稳定的枯否细胞（Kupffer Cell,KC）分离培养方法。方法根据酶消化时间不同和裂解红细胞的方法在酶消化之后和之前分方法Ⅰ和方法Ⅱ。分别运用0.1%的Ⅱ型胶原酶、0.05%链酶蛋白酶E和0.005%DnaseⅠ在不同方法中离体消化肝组织并进行密度梯度离心和贴壁培养提取KC,通过吞噬实验观察鉴定KC。结果方法Ⅰ和方法Ⅱ中KC的数量分别是（0.71±0.21）×10^7/g和（0.96±0.20）×10^7/g,细胞贴壁率分别40.1%、45.1%。用0.4%台盼蓝染色鉴定,存活率分别为90%、95%。吞噬实验发现,细胞纯度分别为90%、95%。结论结合碾磨筛网滤过降低酶作用时间并在酶消化之前裂解红细胞分离提取枯否细胞具有存活好产量纯度高的优点。