小鼠Lewis肺癌细胞与旋毛虫相关抗原基因sHSPs的原核表达及鉴定

目的对小鼠Lewis肺癌(LLC)细胞与旋毛虫(Trichinella spiralis)相关抗原基因sHSPs进行原核表达,对表达产物进行抗原性鉴定。方法利用噬菌体文库展示技术筛选旋毛虫与LLC细胞相关抗原基因并分析,获得sHSPs(DQ 986457)基因。以旋毛虫cDNA为模板,PCR扩增sHSPs基因,连接至表达载体pET-32a(+)后转化入感受态BL21(DE3),以IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白的表达及其反应原性。结果重组表达质粒pET-32a(+)-sHSPs经双酶切及测序鉴定证明克隆载体构建正确,SDS-PAGE检测其表达重组蛋白相对分子质量约为36×10~3。Western blot检测重组蛋白可被抗LLC细胞多抗血清识别。结论成功构建了pET-32a(+)-sHSPs克隆载体,其表达的重组蛋白可与抗LLC细胞多抗血清反应即具有反应原性,为该蛋白的研究奠定了基础。     

旋毛虫原肌球蛋白的特性分析及原核表达北大核心CSCD

目的 分析旋毛虫(Trichinella spiralis)的原肌球蛋白(Tropomyosin,TM)特性并制备重组旋毛虫TM蛋白。方法 在NCBI的Nucleotide数据库选取旋毛虫TM (GenBank:AF419300.1),利用在线分析工具分析旋毛虫TM的氨基酸组成、二级/三级结构、疏水性等特性。密码子优化后合成旋毛虫TM(GenBank:AF419300.1)的全长并插入到原核表达载体pET-28a(+),构建重组原核表达质粒pET-28a(+)-TM,转化至BL21(DE3)中,以终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导旋毛虫TM的表达,纯化后采用Western blot法对重组旋毛虫TM蛋白进行鉴定。结果 旋毛虫TM为亲水性不稳定蛋白,二级结构以α-螺旋为主,无复杂的空间结构。构建的重组原核质粒pET-28a(+)-TM经双酶切得到867 bp的基因片段,序列测定后证实重组原核质粒pET-28a(+)-TM构建正确。经IPTG诱导的菌体超声混悬液、离心后上清均检测到相对分子质量约40×10~3的目的蛋白,纯化后得到条带单一的旋毛虫TM。Western bolt显示纯化的重组旋毛虫TM具有良好的反应原性,能被相应抗体识别。结论 获得具有反应原性的纯化的重组旋毛虫TM,该蛋白为亲水性不稳定蛋白,无复杂空间结构,为进一步研究旋毛虫TM蛋白的生物学功能奠定了基础。     

旋毛虫抗原基因Ts88原核表达及重组蛋白鉴定

目的　原核表达旋毛虫抗原基因Ts88,并对重组蛋白的抗原性进行鉴定。　方法　免疫筛选cDNA文库得到旋毛虫抗原新基因Ts88,克隆入原核表达载体pET28c(+),异丙基βD硫代半乳糖苷诱导表达。重组蛋白免疫小鼠制备免疫血清,ELISA检测抗体滴度。蛋白质印迹法检测重组蛋白的抗原性。免疫荧光试验确定Ts88蛋白在虫体的分布。　结果　经原核表达的Ts88重组蛋白,用其免疫小鼠可得到高滴度的抗体血清。蛋白质印迹法结果表明该重组蛋白能与旋毛虫病患者血清、旋毛虫病猪血清、人工感染及人工免疫兔血清反应,不与其他蠕虫病患者血清发生交叉反应 ,并能识别旋毛虫虫体天然抗原成分。免疫荧光试验显示Ts88蛋白主要分布于虫体体壁。　结论　成功制备Ts88基因的重组蛋白,证明该蛋白具有较好的抗原性     

旋毛虫抗原基因Ts43原核表达及重组蛋白鉴定

目的原核表达旋毛虫相对分子质量(Mr)43 000抗原基因(Ts43)并对重组蛋白进行抗原性鉴定。方法将旋毛虫抗原基因Ts43克隆入原核表达载体pET30a(+),构建重组表达质粒pET30a(+)-Ts43,经测序分析正确后转化大肠埃希菌BL21,以异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析(Western blotting analysis)鉴定重组蛋白的抗原性。结果SDS-PAGE结果显示表达产物为Mr 41 000的重组融合蛋白,IPTG诱导4 h时表达量最大,薄层凝胶光密度扫描显示表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的14.7%。Western blotting结果显示该重组蛋白可被旋毛虫、乡土旋毛虫及纳氏旋毛虫感染小鼠血清及旋毛虫病患者血清识别,与人芽囊原虫、微小隐孢子虫感染小鼠和正常小鼠血清和正常人血清无交叉反应,但与棘球蚴病、囊尾蚴病、日本血吸虫病、并殖吸虫病及华支睾吸虫病患者血清均有交叉反应。结论旋毛虫Ts43基因的重组蛋白具有较好的抗原性,但与某些寄生虫病患者血清有交叉反应。     

旋毛虫抗原基因Ts21的原核表达与重组蛋白鉴定

目的 原核表达旋毛虫相对分子质量（Mr）21 000抗原基因（Ts21）并对重组蛋白进行纯化和抗原性鉴定。 方法 将旋毛虫抗原基因Ts21亚克隆入原核表达载体pMAL-c2X，构建重组表达质粒pMAL-c2X-Ts21，经酶切鉴定正确后转化大肠埃希菌TB1，以异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。亲和层析法纯化表达产物。应用十二烷基磺酸钠?鄄聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blotting）分析鉴定重组蛋白的抗原性。将重组蛋白免疫小鼠制备免疫血清，ELISA检测抗体滴度，免疫荧光检测（IFA）确定Ts21蛋白在肌幼虫体内的分布。 结果 SDS-PAGE结果显示，表达产物为Mr 63 500的重组融合蛋白，IPTG诱导4 h后表达量最大，薄层凝胶光密度扫描显示表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的18.2%。Western blotting结果显示该重组蛋白可被旋毛虫、纳氏旋毛虫感染小鼠血清及旋毛虫病患者血清识别，但不能被乡土旋毛虫、布氏旋毛虫及伪旋毛虫感染小鼠血清识别；与钩虫病、囊尾蚴病、日本血吸虫病患者血清无交叉反应，但与并殖吸虫病、华支睾吸虫病及棘球蚴病患者血清有交叉反应。重组蛋白免疫小鼠可产生高滴度的血清抗体，IFA显示Ts21蛋白主要分布于肌幼虫体壁。 结论 成功制备了旋毛虫Ts21基因的重组蛋白，该蛋白具有较好的抗原性。     

免疫筛选旋毛虫cDNA克隆及原核表达

目的 获取旋毛虫抗原的cDNA克隆并进行蛋白的原核表达。方法 应用兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清对旋毛虫成虫cDNA文库进行筛选，并用兔人工感染旋毛虫血清对强阳性克隆进行再筛选。将编号为Ts87阳性克隆的基因片段亚克隆PET－28a( )表达载体，IPTG诱导表达后用SDS－PAGE电泳分析表达产物。结果 免疫筛选获得阳性克隆Ts87；成功构建重组表达质粒PET－28a( )/Ts87。诱导表达该融合蛋白，SDS－PAGE电泳表明，其能表达一分子质量约为40ku的融合蛋白，与预测分子质量相符。结论 筛选到cDNA克隆Ts87，与兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清和兔人工感染旋毛虫血清均产生特异性免疫反应，PET原核表达系统所获重组蛋白为蛋白功能研究奠定了基础。     

旋毛虫Ts43基因的克隆与原核表达

目的构建旋毛虫Ts43基因原核表达载体，并且在大肠埃希菌中表达。方法将构建的pMD-Ts43克隆质粒酶切回收目的片段定向克隆到pET-28a（＋）载体上，构建原核表达载体pET-28a—Ts43，酶切鉴定正确后，导入菌株Rosetta中，用IPTG诱导表达，并经SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果成功构建了含目的基因的原核表达质粒pET-28a—Ts43，IPTG诱导表达分子质量单位约为43ku的融合蛋白，与预测值相符。以0．9mmol／LIPTG诱导4．5h后表达量最高，薄层扫描表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的20％。Western blot显示表达产物可被抗旋毛虫的多克隆血清识别。结论原核细胞融合表达旋毛虫Ts43基因获得成功，为旋毛虫重组苗的研究奠定了基础。     

免疫筛选旋毛虫cDNA克隆及原核表达

目的　获取旋毛虫抗原的 c DNA克隆并进行蛋白的原核表达。　方法　应用兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清对旋毛虫成虫 c DNA文库进行筛选 ,并用兔人工感染旋毛虫血清对强阳性克隆进行再筛选。将编号为 Ts87阳性克隆的基因片段亚克隆入 PET- 2 8a( +)表达载体 ,IPTG诱导表达后用 SDS- PAGE电泳分析表达产物。　结果　免疫筛选获得阳性克隆 Ts87;成功构建重组表达质粒 PET- 2 8a( +) / Ts87。诱导表达该融合蛋白 ,SDS- PAGE电泳表明 ,其能表达一分子质量约为 40 ku的融合蛋白 ,与预测分子质量相符。　结论　筛选到 c DNA克隆 Ts87,与兔抗旋毛虫成虫可溶性全虫抗原血清和兔人工感染旋毛虫血清均产生特异性免疫反应 ;PET原核表达系统所获重组蛋白为蛋白功能研究奠定了基础。     

旋毛虫抗原及旋毛虫感染小鼠血清对MCF-7细胞生长的抑制作用探讨北大核心CSCD

目的观察感染旋毛虫小鼠血清及旋毛虫幼虫抗原对MCF-7细胞生长的抑制作用。方法用旋毛虫感染昆明小鼠,分别于第9、28d从小鼠颈动脉取血,离心、分离旋毛虫成虫感染期血清及旋毛虫幼虫感染期血清。用旋毛虫幼虫抗原和上述感染后血清分别处理MCF-7细胞,通过MTS试验检测MCF-7细胞增殖活力,通过划痕试验检测MCF-7细胞迁移能力,通过Caspase-3/7试验和TUNEL试验检测MCF-7细胞凋亡情况。以正常小鼠血清和正常培养基作为对照组。结果旋毛虫抗原、旋毛虫感染的小鼠血清处理对数生长期MCF-7细胞48h后和对照组比较。正常培养基、幼虫抗原组的细胞A490值分别为1.729和1.493,Caspase3/7活性检测值分别为217 979.500和730 395.70,TUNEL检测MCF-7细胞的平均凋亡数量分别为21和57。正常血清、幼虫期血清、成虫期血清组的细胞A490值分别为1.970、1.828和1.641,Caspase3/7活性检测值分别为137 557.700、209 552.367和152 058.700,TUNEL检测MCF-7细胞的平均凋亡数量分别为34、42和38。划痕实验结果显示幼虫期血清,成虫期血清,幼虫纯化抗原较正常血清"疤痕"愈合时间延长。结论感染不同阶段旋毛虫的小鼠血清及幼虫抗原均可抑制MCF-7细胞活力,诱导细胞凋亡。     

旋毛虫原肌球蛋白的特性分析及原核表达

目的 分析旋毛虫(Trichinella spiralis)的原肌球蛋白(Tropomyosin, TM)特性并制备重组旋毛虫TM蛋白。方法 在NCBI的Nucleotide数据库选取旋毛虫TM (GenBank:AF419300.1),利用在线分析工具分析旋毛虫TM的氨基酸组成、二级/三级结构、疏水性等特性。密码子优化后合成旋毛虫TM(GenBank:AF419300.1)的全长并插入到原核表达载体pET-28a(+),构建重组原核表达质粒pET-28a(+)-TM,转化至BL21(DE3)中,以终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导旋毛虫TM的表达,纯化后采用Western blot法对重组旋毛虫TM蛋白进行鉴定。结果 旋毛虫TM为亲水性不稳定蛋白,二级结构以α-螺旋为主,无复杂的空间结构。构建的重组原核质粒pET-28a(+)-TM经双酶切得到867 bp的基因片段,序列测定后证实重组原核质粒pET-28a(+)-TM构建正确。经IPTG诱导的菌体超声混悬液、离心后上清均检测到相对分子质量约40×10³的目的蛋白,纯化后得到条带单一的旋毛虫TM。West...     

旋毛虫抗原基因Ts87在真核细胞中的表达

目的 在体外真核细胞COS7中表达重组质粒pcDNA3．1／Ts87，为旋毛虫病DNA疫苗的研究奠定基础。方法 将重组质粒pcDNA3．1／Ts87：经脂质体Lipofectamine介导，体外转染真核细胞COS7，通过细胞免疫组化，细胞裂解物的SDS—PAGE电泳和Western—blot分析检测表达产物。结果 重组质粒能够在COS7中表达出约38ku的目的蛋白，并能够被旋毛虫阳性血清特异识别。结论 构建的重组质粒可在体外真核细胞COS7中成功表达。     

旋毛虫抗原基因Ts87在真核细胞中的表达

目的　在体外真核细胞 COS7中表达重组质粒 pc DNA3.1/ Ts87,为旋毛虫病 DNA疫苗的研究奠定基础。　方法　将重组质粒 pc DNA3.1/ Ts87经脂质体 L ipofectamine介导 ,体外转染真核细胞 COS7,通过细胞免疫组化 ,细胞裂解物的 SDS- PAGE电泳和 Western- blot分析检测表达产物。　结果　重组质粒能够在 COS7中表达出约 38ku的目的蛋白 ,并能够被旋毛虫阳性血清特异识别。　结论　构建的重组质粒可在体外真核细胞 COS7中成功表达。     

旋毛虫5'-nucleotidase基因特征与克隆表达

目的 研究旋毛虫5'-nucleotidase基因的序列结构特征及其蛋白克隆表达。方法 从旋毛虫获得5'-nucleotidase基因的序列,利用生物信息学方法进行系统性分析,并进行原核表达。结果 旋毛虫5'-nucleotidase基因大小为1 653 bp,编码550个氨基酸,119个氨基酸残基组成,理论相对分子质量(Mr)为62 kD,分子式为C₂₈₀₀H₄₃₅₈N₇₄₂O₈₀₃S₂₃,等电点为6.13,属于稳定存在的亲水蛋白质。该蛋白含有21个氨基酸组成的信号肽,同时具有跨膜区域,此外还含有3个N-糖基化位点、2个O-糖基化位点、20个磷酸化位点、28个B细胞线性结合位点和13个T细胞结合位点。二级结构中,α-螺旋占43.27%(238个),伸展链占22.73%(125个),β-折叠占7.82%(43个),无规则卷曲占26.18%(144个)。SDS-PAGE显示,5'-nucleotidase基因在原核表达系统中呈可溶性形式表达,重组蛋白大小约为74 kD。结论 成功克隆了旋毛虫5'-nucleotidase基因,对其进行序列分析和原核表达,为进一步探究5'-nucleotidase蛋白在旋毛虫感染过程中的作用奠定基础。     

旋毛虫成虫抗原基因的原核表达及表达产物的特性分析

目的　获得旋毛虫成虫抗原基因的原核表达产物并对其进行纯化及免疫特性分析。　方法　旋毛虫成虫Ts87基因片段亚克隆入PET-28a(+)表达载体,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。亲和层析和电洗脱法纯化表达产物,SDS-PAGE、ELISA和Westernblotting对表达产物进行分析鉴定,并将纯化的表达产物人工免疫兔。结果　SDS-PAGE结果显示,表达产物为分子量约为40kDa的重组蛋白。纯化后免疫兔获得高滴度的抗血清。该基因重组蛋白可被感染旋毛虫的猪、兔血清及人工免疫兔血清所识别,与感染囊尾蚴、棘球蚴的患者血清或感染日本血吸虫的兔血清不发生交叉免疫反应。　结论　获得一个新的旋毛虫成虫Ts87基因重组蛋白,该蛋白具有特异的抗原性。     

类鼻疽伯克霍尔德菌AraC转录因子基因的原核表达及纯化北大核心CSCD

目的从海南类鼻疽伯克霍尔德菌菌株BPHN001中克隆得到AraC转录因子基因,构建类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)AraC转录因子基因原核表达质粒,对该转录因子基因进行原核表达,并对表达产物进行纯化。方法根据AraC转录因子基因设计特异性扩增引物,将PET-28a(+)质粒和扩增得到的AraC转录因子基因产物同时用BamHⅠ和HindⅢ双酶切,构建带His标签的重组质粒。经测序验证后,将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3),采用最佳浓度IPTG进行诱导,采用SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达情况。通过Ni^(2+)柱纯化目的蛋白,采用Western blot检测纯化蛋白的免疫反应性。结果特异性引物扩增得到的产物大小约为1000 bp,与目的基因片段1032 bp基本一致。将扩增产物与PET-28a(+)载体连接后测序,与预期完全一致。重组载体转化BL21(DE3)后用最适IPTG浓度(0.5 mmol/L)诱导过夜(约16 h),SDS-PAGE检测表达产物分子质量在40~55 ku之间,与预期相符。表达蛋白纯化后进行Western blot,能被相应抗体识别。结论成功克隆得到AraC转录因子基因,,构建的含AraC转录因子基因原核表达载体转化DE3后经IPTG诱导可表达出融合蛋白,经Ni^(2+)柱纯化得到具有免疫反应原性的AraC转录因子蛋白,为AraC转录因子的功能研究奠定了基础。     

家蝇天蚕素Cec4的原核表达与纯化北大核心CSCD

目的构建家蝇天蚕素(Cecropin)Cec4原核表达质粒,表达及纯化Cec4蛋白。方法从家蝇cDNA文库中筛选家蝇天蚕素基因Cec4,设计并合成特异性引物,PCR扩增Cec4基因,连接克隆载体后转入DH5α感受态细胞,通过重组子鉴定及测序完成目的基因的克隆。用限制性内切酶BamHI和HindⅢ双酶切目的基因和质粒,构建GST表达载体pGEX 4T-1-Cec4,转化到大肠埃希菌BL-21中,利用IPTG诱导表达重组Cec4蛋白,经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE电泳分析。结果 PCR扩增获得的Cec4基因全长为192 bp,连接到表达载体pGEX 4T-1获得重组质粒pGEX 4T-1-Cec4,转化大肠埃希菌BL-21后经30℃、0.6 mmol/L的IPTG诱导18 h,表达相对分子质量约为26×10~3上清表达的融合蛋白,亲和层析纯化后的蛋白浓度为0.117 mg/ml。结论成功构建重组质粒pGEX 4T-1-Cec4并表达和纯化获得Cec4蛋白,为其进一步研究奠定了实验基础。     

旋毛虫ES抗原P49基因的体外表达分析

目的克隆和表达旋毛虫ES抗原P49基因,并分析表达产物的免疫原性。方法以重组质粒pCDNA3.1 P49为模板,PCR扩增旋毛虫ES抗原P49基因,将扩增片段双酶切产物连接到质粒pEGFP N1中,构建重组真核表达载体pEGFP N1 P49,利用脂质体法将其转染哺乳动物细胞COS 7。于转染24h后在荧光显微镜下观察发绿色荧光的转基因细胞;通过Western blot分析证实P49基因表达产物的免疫原性。结果成功构建旋毛虫ES抗原P49基因的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP N1 P49,并在COS 7细胞中表达了目的蛋白,并且表达的蛋白可被感染旋毛虫小鼠阳性血清特异地识别。结论成功获得了重组蛋白,并证实该融合蛋白具有免疫原性,其结果为研究其生物学功能奠定了基础。     

表皮葡萄球菌VraSR生物信息学分析及VraR蛋白的原核表达北大核心CSCD

目的对表皮葡萄球菌VraSR进行生物信息学分析并原核表达VraR蛋白,为表皮葡萄球菌VraSR系统功能研究奠定基础。方法 PCR扩增表皮葡萄球菌SE1457菌株vraR基因,PCR片段经酶切后连入载体pET28a,构建重组表达质粒pET28a-vraR,并转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达。重组蛋白His;-VraR经Western blot鉴定后采用Ni-NTA柱纯化。采用DNAMAN、SMART、Megalign等软件对VraSR系统进行生物信息学分析。结果成功构建重组表达质粒pET28a-vraR,在22℃、0.5 mmol/L IPTG诱导12 h高效表达重组蛋白His;-VraR。分析重组His;-VraR序列,与金黄色葡萄球菌VraS/VraR核苷酸同源性皆为82%,氨基酸同源性分别为92%/94%,氨基酸组成差异主要存在VraS的胞外区和VraR的CheY结构域。结论成功表达并纯化表皮葡萄球菌VraR蛋白,生物信息学分析表皮葡萄球菌VraSR的功能,可能不同于金黄色葡萄球菌。     

两个旋毛虫新抗原基因的生物信息学分析及表达鉴定

目的 预测旋毛虫成虫期Ad48 h-Ts3基因和旋毛虫四跨膜基因的抗原性,合成和表达这两个基因并评价其潜在诊断价值. 方法 对旋毛虫四跨膜基因和成虫期Ad48h-Ts3基因采用生物信息学分析其亲、疏水性,预测其可能的抗原表位,对其密码子优化后进行基因序列合成,并亚克隆至pET28a表达载体,在大肠埃希菌中表达获得重组蛋白,以小鼠感染血清进行Western blotting识别重组蛋白,评估其诊断价值. 结果 生物信息学分析表明,旋毛虫四跨膜基因在其他物种中存在同源序列,具有两个跨膜区;而成虫期基因Ad48 h-Ts3具有丰富的抗原表位,为旋毛虫所特有;这两个基因经亚克隆至表达载体后,可观察到Ad48 h-Ts3基因有较明显的表达,且表达产物可被感染旋毛虫的小鼠血清识别,而四跨膜蛋白未见明显表达. 结论 旋毛虫成虫期蛋白Ad48 h-Ts3原核表达成功并可作为旋毛虫病诊断的潜在候选抗原.     

猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B2基因的原核表达、纯化以及免疫反应性分析北大核心CSCD

目的原核表达猪囊尾蚴排泄分泌抗原Ts8B2基因,分析重组蛋白的免疫反应性。方法参照GenBank中Ts8B2基因序列设计引物,以合成基因为模板获得预期DNA片段,双酶切后连接至原核表达载体pGEX-4T-1。将重组质粒转化入大肠埃希菌DH5α(E.coli DH5α),PCR、双酶切筛选阳性质粒,测序确认后转化至E.coli Rosstea,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表达产物。尿素法提取重组蛋白,然后以脑囊虫病患者血清为一抗,Western blot分析其免疫反应性。结果 Ts8B2基因PCR扩增产物为258 bp,与理论值一致。双酶切和测序鉴定重组表达质粒构建成功,SDS-PAGE分析重组质粒转化菌表达相对分子质量为3.5×10~3,以包涵体形式存在目的蛋白,Western blot分析尿素法提取的重组蛋白能被脑囊虫患者血清识别。结论成功构建Ts8B2基因重组表达质粒表达的重组蛋白具有免疫反应性,为进一步研究该蛋白在抗体检测中的应用奠定了基础。