结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗的免疫效果观察

目的:研究并比较结核分枝杆菌(H37Rv)Ag85B、MPT64DNA.以及两者的融合基因(AM)的免疫原性。方法:雌性C57BL/6小鼠25只,随机分为5组,即A组(PBS)、B组(peDNA3.1)、C组(pcDNA/Ag85B)、D组(pcDNA/MPT64)和E组(pcDNA/AM)。分别于胫前肌注射7.5 g/L利多卡因和质粒混合物(1:4,100μL,含质粒70μg/次),间隔2 wk免疫 1次,共3次。末次免疫后4 wk取血分离血清测定总IgG,同时分离脾淋巴细胞,用PPD刺激后分别做脾淋巴细胞增殖实验(MTT比色法)和测定脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ的水平。结果:Ag85B、MPT64和AM质粒DNA,均能诱导小鼠产生较高水平的PPD特异性IgG。免疫小鼠脾淋巴细胞体外经PPD刺激后,能产生特异性淋巴细胞增殖和分泌IFN-γ。peDNA/AM组IFN-γ的分泌水平明显高于pcDNA/Ag85B和pcDNA/MPT64免疫组(P<0.05)。结论:结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因疫苗,能在小鼠体内诱导特异性细胞和体液免疫。     

抗原85B-6kDa早期分泌靶抗原(Ag85B-ESAT-6)亚单位疫苗黏膜免疫对结核分枝杆菌的免疫应答

目的 评价抗原85B-6kDa早期分泌靶抗原融合蛋白(AE)亚单位疫苗经黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答及其对结核分枝杆菌(MTB)感染的保护力。方法 分别用AE、 AE联合环二腺苷酸(c-di-AMP)亚单位疫苗经鼻黏膜免疫小鼠,ELISA检测抗体水平以及1型辅助T(Th1)细胞的细胞因子γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)和Th2细胞的IL-10分泌水平,实时荧光定量PCR检测IFN-γ、 IL-2、 IL-10和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA水平。MTB静脉感染免疫小鼠,ELISA检测感染小鼠血清抗体及脾细胞细胞因子分泌水平,HE染色分析肺病理改变,平板法计数菌落形成单位(CFU)检测脾和肺荷菌数。结果 AE和AE联合c-di-AMP经鼻黏膜免疫可诱导小鼠产生高水平的特异性抗体,促进脾细胞增殖、脾和肺脏Th1/Th2型细胞因子和TNF-α转录增加、脾Th1/Th2型细胞因子分泌增加。小鼠MTB感染后,与对照组相比,AE和AE联合c-di-AMP免疫小鼠特异性抗体水平仍升高,Th1/Th2型细胞免疫应答增强,肺组织呈炎症反应,肺、脾荷菌数显著降低,且AE联合c-di-...     

结核分枝杆菌Ag85A基因DNA疫苗的构建及其联合人IL-12表达质粒诱导的小鼠细胞免疫应答观察

目的:构建编码结核分枝杆菌Ag85A分泌蛋白重组真核表达质粒,研究其与hIL-12联合免疫小鼠后的细胞免疫应答。方法:(1)构建质粒:采用PCR法从H37Rv菌株中扩增Ag85A编码基因,用限制性内切酶消化后,插入克隆载体PMD20-T中,经酶切鉴定与序列测定证实后,以亚克隆法构建于真核表达载体PCDNA3.1的相应酶切位点。(2)动物实验:50只C57BL/6N小鼠随机分为:①Ag85A基因疫苗+hIL-12质粒组(联合免疫组);②重组Ag85A基因疫苗组;③卡介苗BCG组(阳性对照);④空载体组(阴性对照);⑤PBS组(空白对照)。基因疫苗、空载体和PBS经肌内注射法免疫各组小鼠,每隔3周免疫1次,共免疫3次,BCG组经尾部皮下注射1×106CFU BCG免疫1次,约0.3 ml/只。第三次免疫小鼠后28天,处死各组小鼠,分离脾细胞,ELISA法检测脾细胞培养上清液中IFNγ-、IL-2、IL-4水平;乳酸脱氢酶释放法检测脾细胞杀伤活性;分离的脾细胞经TB-PPD刺激后,XTT比色法检测脾淋巴细胞增殖活性。结果:(1)成功构建结核分枝杆菌Ag85A基因DNA疫苗。(2)联合免疫组能诱导较强烈的抗原特异性Th1型细胞免疫应答,免疫小鼠脾细胞培养上清液IFN-r和IL-2水平显著高于Ag85A基因疫苗组,与BCG组相当,IL-4分泌减少;特异性CTL杀伤活性明显增强;淋巴细胞增殖活性也明显高于其他组别。结论:hlL-12表达质粒能够增强结核分枝杆菌Ag85A基因DNA疫苗所诱导的小鼠免疫应答。     

结核杆菌热休克蛋白65"自杀性"DNA疫苗的构建及其免疫效应研究

目的 构建表达结核杆菌热休克蛋白65(HSP65)的"自杀性"DNA疫苗.方法 用聚合酶链反应,从我室构建的表达结核杆菌HSP65真核表达质粒中(pCHSP65),扩增出编码HSP65的基因,与"自杀性"DNA载体pSFV重组.经酶切、测序鉴定,间接免疫荧光(IF)证实其能表达HSP65后,将此"自杀性"DNA疫苗(pAHSP65)免疫小鼠.用ELISA、MTT法研究其免疫效应,并观察其对结核菌感染小鼠的保护作用.结果 酶切、测序鉴定结果证实为结核杆菌HSP65基因,在BHK21细胞中经IF证实有HSP65表达.该疫苗接种能诱导小鼠产生特异性抗体,刺激淋巴细胞增殖,并能抵抗结核杆菌的感染.结论 我们成功地构建了表达结核杆菌HSP65的"自杀性"DNA疫苗,该疫苗能诱导特异性免疫应答,并对结核菌感染的小鼠有保护作用.其免疫效应优于常规的HSP65 DNA疫苗.     

结核分枝杆菌Rv1626的原核表达及其免疫功能研究

结核分枝杆菌;Rv1626;原核表达;免疫原性;结核病     

结核杆菌Ag85B与ESAT-6双顺反子真核表达质粒的构建及体外表达

目的构建结核杆菌Ag85B与ESAT-6双顺反子真核表达质粒。方法采用PCR的方法从结核杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出Ag85B及ESAT-6基因,将其分别定向克隆入真核双表达载体pIRES,构建同时表达两个目的基因的双顺反子重组质粒。进行酶切分析及序列测定后,用脂质体包裹体外转染A549细胞,RT-PCR检测Ag85B及ESAT-6的表达。结果核酸序列测定证实重组质粒构建正确;该重组质粒能在体外表达Ag85B及ESAT-6mRNA。结论成功构建了结核杆菌Ag85B及ESAT-6双顺反子真核表达质粒,并在体外实现了共表达,为进一步在整体动物水平的实验研究奠定了基础。     

T-bet佐剂对Ag85B抗结核DNA疫苗的免疫调节

目的:构建以Th1转录因子T-bet为基因佐剂的Ag85B新型DNA疫苗,并研究其免疫调控作用。方法:RT-PCR法扩增出Ag85B基因和T-bet基因,克隆入pcDNA3.1质粒构建T-bet和Ag85B真核表达质粒,脂质体法转染重组质粒至RAW264.7细胞系,Western blot法检测质粒蛋白表达情况。3次肌肉注射免疫BALB/c小鼠,末次免疫2周后,ELISA法检测血清中抗Ag85B抗体滴度。同时将脾脏淋巴细胞悬液于Ag85B刺激下培养,ELISA法检测培养液中细胞因子分泌情况。结果:质粒蛋白成功表达,并且质粒剂量与质粒蛋白表达水平呈正相关。此外,T-bet/Ag85B不仅诱导IgG2a滴度显著增高伴随IgG1显著降低,而且还刺激IL-2/IFN-γ(Th1类)分泌增加伴随IL-4/IL-10(Th2类)减少。结论:T-bet增强抗Ag85B特异性IgG2a抗体反应,并诱导显著的Th1细胞优势免疫。     

可表达结核分枝杆菌融合蛋白Ag85A-ESAT-6重组卡介苗免疫保护作用研究

目的以Balb/c小鼠为动物模型,评价重组卡介苗新型结核病疫苗rBCG-Ag85A-ESAT-6(rBC-AE)的免疫保护效应。方法将重组卡介苗rBCG-AE免疫动物10周后,结核分枝杆菌H37Rv尾静脉注射进行感染攻击,分别于感染攻击后3、6和9周,通过观察肺组织大体病变、脾肺组织细菌载荷量计数、肺组织抗酸染色、HE染色结合肺组织病理变化,综合评价该疫苗诱导的免疫保护作用。结果 rBCG-AE组脾肺组织细菌载荷量在各时间点均显著低于阴性对照组(PBST组,P0.01),但明显高于卡介苗(BCG)组(P0.01)。rBCG-AE组肺组织病变在感染攻击后6～9周逐渐改善,但其病理打分在各时间点均明显高于BCG组(P0.01)。各组肺组织大体病变与组织病理打分变化相似。结论重组卡介苗rBCG-AE仅能诱导产生与BCG疫苗相当甚至较低的免疫保护作用。     

结核分枝杆菌Ag85A蛋白的原核表达、纯化和免疫反应性

目的通过原核表达获得结核分枝杆菌Ag85A蛋白。方法用PCR从结核分枝杆菌H37Rv菌株中扩增出编码Ag85A的fbpA基因,克隆入原核表达载体pProEXHTb,产生重组质粒pPro85A后,转化至大肠杆菌感受态细胞BL21并诱导大量表达。用镍纯化系统纯化重组Ag85A蛋白,用不同分枝杆菌感染的小鼠血清通过ELISA确定其免疫反应性。利用PCR技术鉴定fbpA基因在不同分枝杆菌的分布。结果32 ku的Ag85A蛋白获得高效表达和纯化。表达Ag85A蛋白的fbpA基因在结核分枝杆菌H37Rv、H37Ra、BCG、草分枝杆菌、土地分枝杆菌、耻垢分枝杆菌和次要分枝杆菌中均有表达,但在牝牛分枝杆菌中未表达。结核病患者和结核分枝杆菌毒株H37Rv感染小鼠血清所产生的抗Ag85A抗体滴度最高。结论重组Ag85A蛋白已成功表达纯化,并保留了免疫反应性。     

A novel recombinant DNA vaccine encoding Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 and FL protects against Mycobacterium tuberculosis challenge in mice

Mycobacterium tuberculosis 6-kDa early secretory antigenic target (ESAT-6) is a dominant target antigen for cell-mediated immunity in the early phase of tuberculosis. The fms-like tyrosine kinase 3 ligand (FL) that induces potent immune response has been used as an adjuvant in vaccine development. In this study, a new recombinant plasmid (pIRES-epitope-peptides-FL) encoding three T cell epitopes of ESAT-6 and FL was constructed, and the immunogenicity of the DNA vaccine was assessed in C57BL/6 mice immunized with the plasmid DNA vaccine. Additionally, a strategy of intramuscular injection with the DNA vaccine (prime) and intranasal administration of the epitope peptides (boost) was employed to induce higher immune reaction of the mice. The results showed that mice vaccinated with the recombinant plasmid DNA vaccine and boosted with the peptides not only increased the levels of Th1 cytokines (IFN-γ and IL-12), the number of IFN-γ⁺ T cells and activities of cytotoxic T lymphocytes as well as IgG, but also enhanced protection against Mycobacterium tuberculosis challenge. In conclusion, these data indicate that the novel recombinant pIRES-epitope-peptides-FL plasmid is a useful DNA vaccine for preventing Mycobacterium tuberculosis infection.     

结核分枝杆菌Ag85B基因的克隆及真核表达载体的构建

目的 构建以结核分枝杆菌分泌蛋白Ａｇ８５Ｂ基因为基础的核酸疫苗。方法 采用聚合酶链反应从结核杆菌Ｈ３７Ｒａ株基因组中,扩增出蛋白Ａｇ８５Ｂ的成熟蛋白的编码基因,用限制性内切酶消化后,插入克隆载体ｐＵＣ１９中。经酶切鉴定与序列测定证实后,以亚克隆法构建于真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的相应酶切位点。结果 结核分枝杆菌Ｈ３７Ｒａ株Ａｇ８５Ｂ成熟蛋白的编码基因经序列测定证实,与Ｅｒｄｍａｎ株完全一致;用Ｅｃｏ     

Immunogenicity and protective efficacy of tuberculosis DNA vaccines combining mycolyl-transferase Ag85A and phosphate transport receptor PstS-3

DNA vaccines encoding the 32,000 MW mycolyl-transferase Ag85A and the 40,000 MW phosphate-binding protein PstS-3 can elicit protective immune responses against experimental infection with Mycobacterium tuberculosis in C57BL/6 mice. Here we have analysed the vaccine potential of a combination of both antigens using plasmid vectors expressing either a fusion protein of both antigens or the separate proteins driven by two independent promoters (in pBudCE4.1 vector). Comparable levels of Ag85A specific T helper 1 (Th1) type immune responses could be induced by the two combination vaccines and the single vaccine encoding the mycolyl-transferase, whereas induction of PstS-3 specific Th1-mediated responses was impaired in both combination vaccines. In contrast, magnitude of CD8+ mediated responses against the PstS-3 protein was comparable following combination or single DNA vaccination. Antigenic competition was also observed at the antibody level; PstS-3 specific levels being lower in mice vaccinated with the fusion vector and Ag85A specific levels being lower in mice vaccinated with the combination pBudCE4.1 vector (as compared to levels obtained following single plasmid immunization). Protection against M. tuberculosis was only modestly improved in mice vaccinated with the DNA combinations. It is possible that prior activation of Ag85A specific CD4+ T cells directed against this common mycobacterial antigen leads to cross-competition for major histocompatibility complex class II-restricted peptide complexes of the Pst-3 antigen. This may have implications for future combination vaccines using Ag85.     

结核杆菌Ag85A/GM-CSF嵌合表达质粒的构建及表达

目的：探讨对结核病DNA疫苗进行基因修饰的新方法。方法：以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得结核杆菌Ag85A抗原蛋白基因的成熟肽编码区，以经PHA诱导后的小鼠脾组织总RNA为模板，通过RT－PCR获得小鼠粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子的cDNA，将二者定向克隆入质粒pBK-CMV中构建含嵌合目的基因的重组质粒，转染培养的COS7细胞后检测嵌合目的基因的表达。结果：成功构建了小鼠粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子cDNA与结核杆菌Ag85A抗原基因的真核嵌合表达质粒，重组质粒能在COS7细胞中进行稳定表达。结论：本研究首次将细胞因子基因与结核杆菌免疫保护性抗原基因嵌合构建嵌合DNA疫苗，为进一步研究其在动物体内的免疫原性和免疫保护性奠定了基础。     

结核分枝杆菌Ag85B/GST融合蛋白表达载体构建及在大肠杆菌中的表达

目的 构建结核分枝杆菌Ag85B／GSF融合蛋白表达质粒，并在大肠杆菌(E．coli)中诱导表达。方法 以质粒pUC18／Ag85B为模板，用PCR法扩增结核杆菌Ag85B基因，扩增的Ag85B上游含有EcoR Ⅰ酶切位点，下游含有SalⅠ酶切位点；将Ag85B基因定向插入质粒pGEX-4T-1中，构建原核表达质粒pGEX-Ag85B并转化E．coli B121，筛选阳性重组子，限制性内切酶切鉴定和DNA序列测定，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，SDS-PAGE和Westem blot鉴定结果。结果 成功构建原核表达质粒pGEX-Ag85B并表达出Mr约56000大小的Ag85B／GSY融合蛋白，表达量占总菌体的30％。结论 为进一步进行纯化Ag85B蛋白和研究其在膀胱肿瘤治疗中的作用奠定了基础。