骨髓间充质干细胞体外定向软骨细胞分化的研究

目的　研究体外培养的兔骨髓间充质干细胞在特定培养条件下定向软骨细胞分化的情况。方法　取兔髂骨骨髓 ,分离培养骨髓间充质干细胞 ,传代后以高糖DMEM无血清特定培养诱导 (转化生长因子 β1 2 0ug L ,地塞米松10 7mmol L ,维生素C 5 0ug L) ,细胞 爬片甲苯胺蓝染色检测蛋白多糖 ,免疫细胞化学染色法检测Ⅱ胶原 ,S 10 0蛋白分泌 ,常规培养的细胞作为对照组。结果　骨髓间充质干细胞经特定培养条件诱导第 14 ,2 1,2 8天甲苯胺蓝染色呈明显异染 ,Ⅱ胶原 ,S 10 0蛋白免疫细胞化学染色阳性 ,第 7天及对照组阴性。结论　骨髓间充质干细胞是骨髓来源的具有多向分化潜能的干细胞 ,在体外培养可定向分化为软骨细胞 ,并能分泌软骨特异性基质。     

犬骨髓基质干细胞体外定向分化为软骨细胞

目的 体外诱导犬骨髓基质干细胞(BMSCs)定向分化为软骨细胞，探讨体外诱导成软骨的方法和条件。方法 自犬肋骨取骨髓2～3ml，体外行原代和传代培养扩增，顺序加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子β1(TGF-β1)，以培养瓶内较高细胞浓度培养，诱导BMSCs分化为软骨细胞。甲苯胺蓝、阿新蓝染色检测软骨基质的分泌，免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。结果 诱导的软骨样细胞甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性；Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性。结论 应用bFGF和TGF-β1体外可以诱导犬BMSCs分化为软骨细胞，诱导的软骨细胞可作为软骨组织工程较理想的种子细胞。     

骨髓基质干细胞修复软骨缺损的实验研究

[目的]探寻体外诱导骨髓基质干细胞成软骨细胞的最佳细胞因子，寻求体内修复家兔软骨缺损的最为有效方案。[方法]rhFGF1、rhTGF-β1、rhIGF-1单独或联合应用对骨髓基质干细胞进行体外诱导培养，应用常规染色、MTT、免疫组织化学染色的方法筛选诱导骨髓基质干细胞成软骨细胞的最佳细胞因子，并将其与骨髓基质干细胞复合于纤维蛋白凝胶制成凝胶复合物，直接种植到兔膝关节实验性关节软骨缺损处，并与对照组相比较，观察软骨修复效果。[结果]常规形态学观察，rhTGF-β1和rhIGF-1联合应用诱导的细胞在形态上类似于软骨细胞，免疫组化染色提示诱导细胞具有软骨细胞表型。凝胶复合物直接种植在体内能诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化，修复缺损的软骨，缺少细胞因子的对照组软骨缺损修复效果差。[结论]rhTGF-β1和rhIGF-1联合应用可作为诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞分化的最佳组合，骨髓基质干细胞凝胶复合物能修复软骨缺损。     

力学因素对软骨生物学性状的影响及在组织工程中的应用

力学刺激对软骨细胞的增殖及功能状态有明显的促进作用。体外构建组织工程化软骨过程中的力学刺激可加速软骨组织形成与成熟,有利于诱导骨髓基质干细胞向软骨细胞的定向分化。本文兢这些方面内容进行综述。     

MicroRNAs在骨髓间充质干细胞成软骨分化中的作用

软骨组织由细胞外基质与分散其间的软骨细胞共同构成，由于缺乏血管?神经和淋巴系统，损伤后自身修复能力差。目前各种促进软骨损伤修复的方法效果都不理想，诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化修复软骨损伤已成为当下研究的热点。多种MicroRNA参与并调控骨髓间充质干细胞成软骨分化过程，本文就MicroRNA调控骨髓间充质干细胞成软骨分化及其机制的研究进展做一综述。     

骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化的研究进展

骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSC)是位于骨髓中的一种干细胞,因在体外经适当的培养条件可以向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞等多种间充质来源的组织细胞分化,又被称为间充质干细胞(mesenchymal stem cell).骨髓基质细胞位于骨髓,具有取材方便,易于体外扩增,自体移植无免疫排斥性等优点,是骨组织工程中种子细胞的理想来源.骨髓基质细胞,其向成骨细胞的定向诱导分化将是关键的一步.笔者就骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化有关影响因素的研究进展作一综述.     

体外构建组织工程软骨种子细胞的研究进展

体外构建组织工程软骨的首要问题是种子细胞的来源,目前获得种子细胞的可能途径主要有以下几种:(1)培养扩增自体获得的软骨细胞;(2)同种异体软骨细胞;(3)骨髓基质干细胞及其他组织来源干细胞;(4)胚胎干细胞;(5)基因修饰细胞。本文就当前体外构建组织工程软骨的种子细胞研究进展综述如下:1自体软骨细胞自体软骨细胞可由关节软骨、骺板软骨、软骨膜、肋软骨和耳软骨等分离培养获得。软骨细胞是构成透明关节软骨的唯一细胞成分,是终末分化细胞,具有高度特异性。软骨细胞的主要功能是维持软骨基质成分的稳定。新分离的关节软骨细胞在最初的数天…     

骨髓间充质干细胞的培养及向软骨细胞诱导的方法学研究进展

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)可向软骨分化,具有来源广泛、取材方便、易于培养且无明显自体移植免疫排斥反应等优点,在体外进行定向分化可作为软骨修复的种子细胞.体外分离培养纯度高、活力强、生物特性单一的软骨细胞,对组织工程及细胞的实验至关重要.然而,在骨髓中BMSCs含量极低,体外分离培养诱导方法不一,培养难度大.因此,总结骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化方法,并归纳细胞形态学、表面标志物鉴定及其向软骨细胞方向诱导分化的方法很有必要.     

骨髓间充质干细胞成软骨分化研究进展

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于骨髓基质中的一种多能干细胞，在特定的培养条件下，MSCs可分化成成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞等多种间充质细胞。由于它们可以作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也被称为骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)。本文就骨髓MSCs的分离培养及成软骨分化的研究进展作一综述。     

兔髂骨骺板软骨细胞体外构建骺板样软骨组织

目的　利用组织工程学技术体外构建骺板样软骨组织。方法　从 4～ 5周龄兔髂骨骺板软骨处获取软骨细胞 ,在离心管内轻微离心后 ,体外培养。行组织学观察。结果　培养至第 7天时 ,细胞呈现定向分化 ,形态与体内骺板软骨细胞相类似 :肥大软骨细胞体积较大、呈圆形或椭圆形 ;增殖、成熟软骨细胞体积小 ,呈圆形或扁圆形 ;细胞周围充满大量的细胞外基质。这些不同分化阶段的细胞形成了分化区带 ,肥大软骨细胞位于上侧 ,增殖、成熟细胞位于中间 ,其次是散在静止软骨细胞。培养第 14天 ,分化区带更加明显 ,增殖、成熟细胞和肥大软骨细胞呈现纵向定向排列。培养第 2 1天 ,组织表面出现膜样的结构。结论　体外构建的骺板样软骨组织与天然骺板的组织学形态极为相似。从髂骨处骺板处获取肥大软骨细胞进行体外构建骺板软骨材料 ,更具有临床实用性     

同种异体软骨细胞与自体骨髓基质干细胞混合共培养构建软骨皮下移植的可行性研究

背景：软骨组织工程的种子细胞问题是目前研究的热点和难点,如何找到一种既能够避免对自体软骨进行取材又能够达到稳定软骨构建目的的方法呢？本研究尝试利用少量同种异体羊软骨细胞作为软骨诱导微环境提供者,与扩增后的羊自体BMSC混合共培养并植入皮下环境,探讨利用同种异体软骨细胞共培养构建软骨皮下移植的可行性。方法：本实验对山羊软骨细胞和BMSC分别进行取材和分离培养扩增,并将以上细胞分为以下四组进行混合并接种在PGA支架材料上：A组：100%自体软骨细胞;B组：30%自体软骨细胞＋70%自体BMSCs;C组：30%同种异体软骨细胞＋70%自体BMSCs;D组：100%同种异体软骨细胞。经过体外构建6周后植入羊皮下进行体内构建12周,对所形成的组织块进行大体观察和组织学染色等评价。结果：自体软骨细胞组和自体软骨细胞混合自体BMSC组皮下移植后可见成熟软骨组织形成,但同种异体软骨细胞参与的两组（包括同种异体软骨细胞混合自体BMSC的实验组和单纯异体软骨细胞组）在皮下环境中都因为较强的免疫反应未能形成软骨组织。结论：同种异体软骨细胞以及PGA支架材料的存在对于组织工程软骨在羊皮下环境的构建有负面影响。     

关节软骨组织工程种子细胞的研究进展

目的 综述关节软骨组织工程种子细胞的研究进展.方法 广泛查阅近年来有关关节软骨组织工程种子细胞的文献,并进行综述.结果 BMSCs分化为软骨细胞将成为关节软骨组织工程种子细胞的主要来源,与支架利用和培养环境改善构成关节软骨组织工程的重要条件.结论 充分利用细胞因子和转基因技术,改良三维支架和培养条件,将推动关节软骨组织技术的进展.     

组织工程软骨种子细胞的研究进展

目的 综述组织工程软骨种子细胞及培养系统的发展近况。方法 广泛查阅近年来有关组织工程软骨种子细胞和培养系统的文献，进行综述。结果 回顾了组织工程软骨的种子细胞来源及培养方法，自体或异体软骨细胞仍然是目前软骨组织工程的主要细胞，三维立体细胞培养体系是现在主要的细胞培养体系。结论 组织工程软骨种子细胞的来源有待于进一步发掘，培养体系有待于进一步完善和发展。     

骨髓基质细胞膜片复合聚乳乙醇酸支撑体体外构建管状软骨

目的 研究利用骨髓基质细胞膜片复合聚乳乙醇酸(ploy of lactic-co-glycolic acid,PLGA)支撑体,在生物反应器条件下体外构建管状软骨的可行性.方法 分离兔骨髓基质细胞,高密度连续培养,转化生长因子-1诱导构建成干细胞膜片,制作圆柱状PLGA支撑体,将细胞膜片均匀缠绕在表面.静置孵育14 d,使细胞膜片与PLGA相互贴附后,进入生物反应器动态培养8周后,取出标本.从大体形态、组织学结构、蛋白多糖含量以及生物力学性能等方面评价形成软骨的理化特性.结果 通过此策略构建的软骨外观与天然软骨组织非常相似,保持着良好的管状外形,颜色呈乳白色,有光泽,质地均匀,弹性好,具有中等偏软的硬度.组织学结果显示总体结构呈现软骨样结构,HE染色可见软骨样细胞分布于细胞陷窝之中,周围是均匀的细胞外基质,番红-0染色可见细胞外基质着色为鲜红色,提示蛋白多糖含量丰富,有大量软骨基质物产生.结论 细胞膜片复合支撑体策略能形成管状形态的软骨组织,为气管软骨的再造提供了新的方法,有可能解决气管缺损的临床难题.     

组织工程骨软骨复合物的构建与形态学观察

目的探讨采用组织工程技术构建骨软骨复合物的可行性。方法将骨髓基质细胞(BMSCs)成诱导软骨后接种于快速成形的三维支架材料聚乳酸／聚羟乙酸共聚物(PLGA)构建组织工程软骨，经成骨诱导的BMSCs接种于聚乳酸／聚羟乙酸共聚物／磷酸三钙(PLGA／TCP)构建组织工程骨，在体外分别培养2周后，将两种工程化组织及两者以无损伤线缝合形成的组织工程骨软复合体分别植入自体股部肌袋，术后8周取材，行组织学观察。结果术后组织学观察表明。组织工程软骨在体内可形成软骨组织组织工程骨在体内可形成骨组织，两者的复合体在体内可形成骨软骨复合物。结论以骨髓基质细胞为种子细胞、以快速成形的生物降解材料为支架体外构建的组织工程骨软骨复合物，可在体内形成骨软骨组织，有望用于骨软骨缺损的修复。     

体外诱导BMSCs向软骨分化的方法研究进展

目的全面了解目前体外诱导BMSCs向软骨分化的方法,为软骨组织工程研究提供参考。方法广泛查阅近年来有关软骨组织工程中诱导BMSCs向软骨分化的文献,并进行综合分析。结果目前BMSCs诱导成软骨方法主要是添加外源性生长因子,其中TGF-β家族被公认为最重要的诱导和调节因子。其他重要的诱导方法包括添加多种化学因子、物理因素、转基因技术和微环境诱导等方法,但这些方法仍存在诱导效率低、诱导效果不稳定的问题。结论诱导方法的进展促进了BMSCs在软骨组织工程中的应用,建立更高效、简便、安全的诱导方法仍是软骨组织工程领域重要研究课题之一。     

BMSCs构建组织工程软骨的研究进展

目的综述BMSCs构建组织工程软骨的进展。方法查阅近10年来有关BMSCs构建组织工程软骨的文献，并进行综述。结果支架为软骨细胞的生长提供了理想的环境，细胞因子和基因修饰可促进BMSCs分化为软骨细胞，三者在软骨组织工程中具有重要作用。结论三维支架的改良、合理使用细胞因子及基因修饰技术的提高，将推动临床上软骨重建技术的发展。     

Interaction of chondrocytes,extracellular matrix and growth factors: relevance for articular cartilage tissue engineering

The abundant extracellular matrix of articular cartilage has to be maintained by a limited number of chondrocytes. Vice versa, the extracellular matrix has an important role in the regulation of chondrocyte function. OBJECTIVE: In this review we discuss the role of the extracellular matrix in the regulation of chondrocyte function and the relevance for cartilage tissue engineering. To reach this goal the international literature on this subject has been searched with a major focus on the last 5 years. RESULTS: Structural matrix macromolecules (e.g. collagen, hyaluronate), but also growth factors (e.g. IGF-I, TGF beta) entrapped in the matrix and released under specific conditions affect chondrocyte behavior. These factors communicate with the chondrocyte via specific membrane receptors. In this way there is a close interaction between the extracellular and intracellular milieu. Articular cartilage has a limited capacity of intrinsic repair, which has resulted in the development of tissue engineering approaches to repair damaged cartilage. Successful application of scaffolds has to take into account the important role of both soluble and insoluble matrix-derived factors in cartilage homeostasis. CONCLUSION: Functional tissue engineering will only be realized when the scaffolds used will provide cartilage cells with the correct extracellular signals.     

成纤维细胞生长因子在软骨发育过程中的基因芯片分析及相关研究

目的 检测并分析促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中成纤维细胞生长因子(FGF)在软骨发育过程中的基因表达规律;通过细胞培养观察FGF基因对骨髓基质干细胞(BMSCs)生长特性的影响. 方法用基因芯片技术建立妊娠胎鼠肢芽软骨发育过程的基因表达谱,分析MAPK信号通路中碱性成纤维细胞生长因子(brGF)在软骨发育过程中的基因表达规律.构建bFGF质粒并转染至培养的BMSCs中,用MTT法、免疫组织化学、HE染色、RT-PCR及酶联免疫吸附法检测bFGF基因转染BMSCs的效果及产物表达. 结果 MAPK信号通路中的FGF在软骨发育过程中的软骨形成关键期表达显著上调,并启动MAPK信号通路,促进软骨形成.bFGF基因转染的BMSCs生长活力较强,可以保持2周以上;HE染色显示细胞增殖旺盛,胞核深染;RT-PCR表明有bFGF的基因表达;酶联免疫吸附法检测bFGF表达量高. 结论 FGF能够启动MAPK信号通路从而促进软骨彤成.bFGF质粒转染BMSCs后可促进BMSCs的增殖,细胞有向软骨细胞分化趋势.     

新型脱细胞软骨基质三维多孔支架的制备

目的 探讨脱细胞软骨基质三维多孔支架的制备方法以及将其应用于关节软骨组织工程的可行性. 方法 取天然人软骨粉碎后,采用梯度离心法取100 nm～5μm软骨微丝,脱细胞处理后制备为质量体积比为3%的悬液,采用冷冻冻干法制备脱细胞软骨基质三维多孔支架.254nm紫外线和碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺对支架进行交联.冷冻冻干后,对支架材料进行组织学及扫描电镜观察,测定支架孔径和孔隙率、吸水率,并采用MTT法分析支架浸提液毒性.分离培养犬BMSCs,用TGF-β1成软骨诱导后种植至支架,倒置显微镜、电镜观察细胞在支架上的生长、分化情况. 结果 组织学观察显示,三维多孔支架中无软骨细胞碎片残留,甲苯胺蓝染色、番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均呈阳性.扫描电镜显示支架内孔洞相互连通,孔径为(155±34)μm,孔隙率为91.3%±2.0%,吸水率为2 451%±155%.MTT法显示不同浓度支架浸提液与对照DMEM培养液吸光度值比较,差异无统计学意义(P＞0.05),支架无细胞毒性.倒置显微镜观察,细胞在支架上黏附良好;扫描电镜下细胞在支架上均匀分布,细胞呈圆形或椭圆形,并有基质分泌. 结论 制备的脱细胞软骨基质三维多孔支架去细胞彻底,保留了软骨ECM主要成分,无毒,具备合适的孔径和孔隙率,生物相容性良好,是软骨组织工程良好的支架载体.