抗重组人表皮生长因子单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

目的　制备出高效价的抗重组人表皮生长因子 (EGF)单克隆抗体。方法　以重组人表皮生长因子作为抗原 ,免疫Balb/c小鼠 ,以未免疫的Balb/c小鼠脾细胞为饲养细胞 ,运用细胞杂交瘤技术制备 ,间接ELISA法筛选产生针对人表皮生长因子的单克隆抗体细胞株 ;以体内诱生法产生腹水 ,并采用ProteinA Sepharose柱对其纯化 ,快速定性试纸鉴定McAb的Ig亚类 ,采用间接ELISA法相加实验鉴定抗原识别表位。结果　获得 3株产生针对人表皮生长因子的单克隆抗体细胞株EGF B2 、EGF C7、EGF A8,Ig亚分别为IgG1κ型 ,IgG1λ型 ,IgG3 κ型 ,亲和力常数分别为 2 .76× 10 10 、3.2× 10 9、1.4 5× 10 9。结论　成功制备 3株稳定分泌抗rhEGF的杂交瘤细胞株 ,产生的McAb特异性好 ,亲和力高 ,为探讨EGF的作用机制及临床应用奠定了基础 ,为肿瘤的诊断与治疗提供具有实用价值的研究工具 ,此外 ,为EGF的纯化提供实验材料     

一对高亲和力抗人肌钙蛋白Ⅰ单克隆抗体的制备及鉴定

目的 获取抗人肌钙蛋白Ⅰ（cTnI）的单克隆抗体（McAb）.方法 以人cTnI作为抗原,免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制备了抗人cTnI高亲和力、高特异性单克隆抗体.随后采用间接ELISA法测定抗血清效价,用protein G亲和纯化法纯化抗体,抗原竞争ELISA法鉴定抗体亲和力,SDS-PAGE法鉴定纯度,Western blotting鉴定抗cTnI单克隆抗体的特异性,竞争ELISA法分析抗原结合位点.结果 筛选出9株稳定分泌抗cTnI的单抗杂交瘤细胞株,其中A3、A9两株免疫球蛋白亚类均为IgG2a,分泌的抗体纯度高,与CK-MB、cTnT无交叉反应,效价均为：1：1024000,亲和力分别为4.21×10^8mol/L、1.07×10^8mol/L,抗原结合位点不同.结论 成功制备出了一对高亲和力、高特异性抗人cTnI单克隆抗体.     

阪崎肠杆菌单克隆抗体的制备与特性鉴定

目的:制备抗阪崎肠杆菌的单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法:采用灭活的阪崎肠杆菌菌体为抗原,免疫BALB/c小鼠,取血清效价高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,mAb亚类检测试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型,通过Western blot和间接ELISA法鉴定该单克隆抗体的特性、效价及mAb相对亲和力。结果:获得2株能稳定分泌抗阪崎肠杆菌mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为1H7、2B12,抗体Ig亚类分别为IgG1和IgG2b;交叉反应显示单抗具有良好的特异性;ELISA分析表明制备的单抗效价在1×107～2×107,相对亲和常数达109L/mol,染色体鉴定分别为104和106条,符合杂交瘤细胞的特性。结论:抗阪崎肠杆菌单克隆抗体的成功制备为其快速检测方法的建立奠定了基础。     

平榛主要过敏原Corh1单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备和鉴定鼠抗平榛主要变应原Cor h 1的单克隆抗体(Monoclonal Antibody,McAb)。方法用重组Cor h 1蛋白为免疫原,免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合。通过间接ELISA法筛选分泌特异性McAb的杂交瘤细胞。用杂交瘤细胞株诱导小鼠产生腹水,再用蛋白A亲和层析法纯化抗体。采用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型;通过间接ELISA、Western Blotting鉴定该McAbs的特性和交叉性。结果获得4株可稳定分泌鼠抗平榛主要变应原Cor h 1的McAbs,其Ig亚型均为IgG1,均具有良好的效价;ELISA和Western Blotting分析表明该4株单抗均能识别重组Cor h 1蛋白,其中3株单抗能够识别天然平榛提取物。结论成功制备了4株鼠抗平榛主要变应原Cor h 1的单克隆抗体,为建立平榛主要变应原Cor h 1检测及纯化方法奠定了基础。     

C-myc单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备与鉴定鼠抗C-myc蛋白单克隆抗体。方法利用C-myc蛋白做免疫原免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,经间接ELISA法筛选、有限稀释法克隆、单克隆抗体Ig亚型鉴定,获得2株能够稳定分泌抗C-myc特异性抗体的杂交瘤细胞株,再将杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔诱使小鼠产生腹水。结果获得2株可稳定分泌抗C-myc抗体的杂交瘤细胞株,命名为SHH-1H11,SHH-2A9,Ig亚型分别为IgG1亚类和IgM。细胞培养上清效价分别为1:10240、1:5 120;小鼠腹水效价分别为1:64 000、1:32 000。结论制备的C-myc单克隆抗体仅与C-myc蛋白反应,与其他蛋白没有交叉反应,表明获得的单克隆抗体的特异性很高。     

重组人碱性成纤细胞生长因子单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的制备重组人碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human basic fibroblast growth factor,rhbFGF)单克隆抗体,鉴定其特性,建立双抗体夹心ELISA检测方法。方法以rhbFGF为免疫原,免疫Balb/c小鼠,通过细胞融合技术建立能稳定分泌抗rhbFGF杂交瘤细胞株,制备抗rhbFGF单克隆抗体,采用Ig亚类ELISA试剂盒鉴定抗体亚类,间接ELISA法检测抗体效,Western blot鉴定抗体特异性。HRP标记McAb并建立夹心ELISA检测方法。结果获得2株(分别命名2D3、5F7)可分泌特异性McAb的强阳性细胞株,腹水抗体效价在10-5以上,IgG亚类均为IgG1,轻链为K链。Western blot证明2株McAb特异性良好,双抗体夹心ELISA检测rhbFGF最低检测限达到2 ng/ml。结论成功制备高效价的抗rhbFGF单克隆抗体,建立抗rhbFGF双抗体夹心ELISA定量检测方法。     

抗肠出血性大肠杆菌O157:H7 EspA单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备抗肠出血性大肠杆菌O157:H7EspA单克隆抗体(mAb)。方法:以重组EspA蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术并且联合间接ELISA筛选只针对EspA的杂交瘤细胞株。以Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定mAb的Ig亚类,ELISA、Western blot及免疫荧光技术鉴定抗体的免疫学特性。结果:获得3株稳定分泌抗EspA杂交瘤细胞的mAb,Ig亚型分别为IgG1κ型、IgG2aκ型、IgG2bκ型。Western blot和免疫荧光分析表明,3株杂交瘤细胞制备的mAb腹水都能特异地结合重组EspA蛋白和识别O157:H7的EspA成分。结论:成功地制备了抗肠出血性大肠杆菌O157:H7EspA的mAb,并证明了该mAb的生物学活性,为深入研究肠出血性大肠杆菌O157:H7的致病机制提供新的手段。     

Annexin A2单克隆抗体制备及初步鉴定

制备Annexin A2特异性单克隆抗体(McAb),为Annexin A2的体内外功能的研究提供有力的抗体工具。以原核表达的全长p36蛋白(Annexin A2单体)免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备针对Annexin A2的McAb。以间接ELISA法筛选出目的杂交瘤细胞株并进行染色体计数;分析McAb的亚型,检测其效价、浓度及亲和常数;以细胞荧光染色,Western blot和RT-PCR鉴定McAb特异性。结果得到1株能稳定分泌特异性针对p36的McAb的细胞株F8,其抗体亚类重链为IgG2a,轻链为κ型;腹水纯化后效价为1∶4 000;亲和常数为3.4×109L/mol。成功获得了能稳定分泌AnnexinA2特异性McAb的细胞株。     

抗CMG2单克隆抗体的制备及其初步应用

目的制备鼠抗人毛细血管形态发生基因2(CMG2)单克隆抗体,并将其初步应用于胃癌组织和细胞系中CMG2表达的检测。方法重组表达CMG2胞外区肽段,免疫Balb/c小鼠,常规制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA方法筛选目标克隆,制备小鼠腹水并经蛋白A亲和纯化获得相应抗体。间接ELISA法鉴定抗体的亚类类型及亲和力;抗原竞争性抑制实验鉴定抗体的特异性。用候选抗体建立流式细胞术、免疫荧光、免疫印迹及免疫组织化学方法,初步应用于胃癌组织和细胞系中CMG2表达的检测。结果共获得3株针对CMG2胞外区的杂交瘤细胞株,其中以8F3单克隆抗体的亲和力和特异性最好,亚型为Ig G1。8F3单抗能用于胃癌细胞株CMG2表达的流式细胞术和免疫荧光检测以及胃癌组织的免疫组织化学检测。结论成功制备出高效价高特异性的鼠抗人CMG2单克隆抗体,为CMG2的基础和临床应用研究提供了有用工具。     

抗鸡蛋卵类黏蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备和鉴定鼠抗鸡蛋主要过敏原卵类黏蛋白的单克隆抗体。方法利用鸡蛋卵类黏蛋白(ovm)为免疫原,免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合。采用半固体培养基法和有限稀释法相结合的方法快速筛选获得稳定分泌的特异性杂交瘤细胞。用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白A亲和层析法进行抗体纯化。采用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型;通过间接ELISA、Western blotting鉴定该单克隆抗体的特性和交叉性。利用双抗体夹心ELISA法检测食品中的鸡蛋过敏原。结果获得4株可稳定分泌鼠抗卵类黏蛋白的单克隆抗体,分别命名为1G8,2H5,3A7,4G4,其Ig亚型均为IgG1。且4株单抗效价均在10-8以上。ELISA和Western blotting分析表明该4株单抗均能特异性识别卵类黏蛋白,并且建立双抗体夹心ELISA的方法可以准确的检测出食品中鸡蛋过敏原的存在。结论成功制备了4株高效价的鼠抗卵类黏蛋白的单克隆抗体,为建立卵类黏蛋白检测及纯化方法奠定了基础,也可为食品中鸡蛋过敏原的检出提供依据。     

抗3-硝基酪氨酸单克隆抗体的制备及免疫学特性分析

目的制备抗3-硝基酪氨酸(3-NT)单克隆抗体并鉴定其免疫学特性。方法用化学合成方法将3-NT与OVA用戊二醛偶联合成的人工抗原3硝基酪氨酸-戊二醛-鸡卵白蛋白(3NT-G-OVA)作为免疫原,皮下注射免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,扩大培养并对抗体进行免疫学鉴定与分析。结果获得1株稳定分泌抗3-硝基酪氨酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗亚型为Ig G2a;纯化后的抗体效价为1∶(6.14×106);单抗亲和力常数为7.81×107(L·mol-1);Western blot检测证明该单抗与含有3-硝基酪氨酸的蛋白能特异地结合。结论制备了1株具有较高免疫学活性和特异性的抗3-NT单克隆抗体,并可用于Western blot检测病人样本中的蛋白硝基化水平。     

以人IgG作免疫原同时获取抗人γ重链及κ、λ轻链单克隆抗体的研究

本文报道用纯化的IgG免疫BALB/c小鼠,同时获得抗人γ重链及抗κ、λ轻链三种单克隆抗体。经鉴定,抗人γ重链McAb只与IgG反应,不与其它Ig及轻链反应。抗κ及λ链McAb除分别与游离的κ、λ轻链反应外,也与和Ig分子中重链结合的κ、λ反应。免疫电转印法测定,抗γ链McAb识别分子量为50KD的重链抗κ、λMcAb识别分子量为22KD的轻链。将所得抗κ、λ单克隆抗体分别与正常人周血单个核细胞进行反应,染色结果表明κ链表达与λ链表达细胞之比为2∶1;两种抗体配对混合后的反应结果与多克隆抗体Sm Ig一致。实验结果表明所获抗体符合抗γ、κ、λ单克隆抗体的特点。     

副溶血弧菌TDH单克隆抗体的研制与性质鉴定

目的:制备副溶血弧菌耐热直接溶血毒素TDH单克隆抗体,并分析其免疫学特性。方法:用纯化的TDH毒素蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA方法进行阳性细胞筛选,有限稀释法进行亚克隆。并对该单克隆抗体进行了分子量大小、效价、亚类、特异性和亲和力分析。结果:筛选出一株能够稳定分泌TDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为T9H4,其免疫球蛋白亚型鉴定为IgG1,亲和力常数可达2.19×109L/mol,并表现出较强的特异性。抗体纯化后效价达1∶1 024 000,SDS-PAGE电泳结果显示单抗蛋白重链分子量约为50 kD和轻链23 kD。结论:成功获得一株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,为开发免疫学快速检测方法提供重要实验基础。     

抗人μ链单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的:制备高效价的鼠源性抗人μ链单克隆抗体(mAb),并建立可用于感染性疾病早期血清学诊断的ELISA捕捉法。方法:以人IgM全分子免疫BALB/c小鼠,按常规方法进行细胞融合,用间接ELISA法筛选及克隆化,建立可稳定分泌抗μ链mAb的杂交瘤细胞株。mAb的特性(效价、Ig亚类、特异性及相对亲和力)采用ELISA及Westernblot法鉴定。以纯化的mAb包被建立ELISA捕捉法,并用于可疑乙脑患者标本中特异性IgM抗体的检测。结果:筛选到1株可稳定分泌抗人μ链mAb的细胞株2E5。mAb腹水的ELISA效价为1×10-6,Ig亚类(型)为IgG1(κ),相对亲和力为1×10-5。Westernblot结果显示mAb2E5仅与IgM的μ链结合,Mr为75000。以辛酸硫酸铵法纯化的mAb2E5包被,建立了ELISA捕捉法,用于30份乙脑患者血清IgM的检测,敏感性及特异性良好。结论:成功地制备1株抗人μ链mAb2E5,建立了可用于感染性疾病早期血清学诊断的ELISA捕捉法。     

雪卡毒素单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备雪卡毒素的单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法以雪卡毒素类似物莫能菌素为半抗原,分别采用混合酸酐法将其与载体牛血清白蛋白(BSA)偶联合成免疫抗原M-BSA,碳二亚胺法与卵清白蛋白(OVA)偶联合成包被抗原M-OVA。以M-BSA免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤。以自制雪卡毒素提取物为竞争抗原,间接竞争ELISA法筛选稳定分泌雪卡毒素抗体的特异性细胞株。小鼠体内诱生腹水,辛酸硫酸铵沉淀法进行纯化。采用抗体亚型鉴定试剂盒鉴定所得抗体的亚型,间接竞争ELISA法鉴定抗体的特异性和交叉性。结果获得3株稳定分泌抗雪卡毒素抗体的杂交瘤细胞株1D5、2G11、3G11,其Ig亚型均属于IgG1亚型。交叉反应结果表明3株单克隆细胞产生的抗体除与莫能菌素有较高的交叉反应外,与其他雪卡毒素类似物均无明显交叉反应。结论成功筛选到了分泌雪卡毒素抗体的细胞株,为雪卡毒素免疫分析方法的进一步研究奠定基础。     

抗艰难梭菌A毒素单克隆抗体的制备及特性分析

目的 :制备抗艰难梭菌A毒素的单克隆抗体 (mAb)并鉴定其特性。方法 :用纯化的艰难梭菌A毒素免疫BALB/c小鼠 ,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2 / 0融合 ,采用间接ELISA筛选杂交瘤细胞。用ELISA检测mAb腹水的效价、相对亲和力和进行表位分析 ;用Westernblot检测mAb的特异性。结果 :得到 6株杂交瘤细胞株 ,5C10株细胞分泌的mAb为IgG2a ,4B5和 8A1株细胞分泌的mAb为IgG1,其他 3株细胞mAb (2H7、3E9和 6G8)均分泌IgM。中和试验表明 ,所有的mAb均无中和活性。腹水mAb的效价均在 10 -4以上 ,其中mAb 2H7、6G8、5C10、4B5和 8A1具有共同的表位 ,而mAb 3E9识别的位点与其他 5株不同。mAb 8A1和 4B5的相对亲和力>10 5,其他 4株mAb的相对亲和力 >10 4。在非变性条件下 ,PAGE后Westernblot的结果显示 ,6株mAb均可与相对分子质量 (Mr)为 5 5× 10 4的A毒素产生反应 ;而在变性条件下 ,还原与非还原SDS PAGE后Westernblot均显示 ,6株mAb均可与Mr 为 5× 10 4～ 2 4× 10 4的A毒素产生反应。结论 :6株杂交瘤细胞株均能分泌抗艰难梭菌A毒素的特异性mAb ,为艰难梭菌A毒素的研究提供了有利的工具     

重组人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备重组人心肌肌钙蛋白I(rhcTnI)的单克隆抗体,并对其单克隆抗体的特性进行鉴定.方法 利用纯化后的rhcTnI作为免疫原,常规免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与同系骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,用甲基纤维素半固体培养基法获得单克隆抗体杂交瘤细胞株,利用ELISA、Western blot等方法对单克隆抗体的特性进行鉴定.结果 筛选出3株稳定分泌抗rhcTnI的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为4B3、7D5和3E6.3株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类分别为IgG1(4B3、7D5)和IgG2b(3E6).3株单克隆抗体与rhcTnI发生特异性结合,而与大肠杆菌菌体蛋白、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)无特异性交叉反应,3株单克隆抗体的亲和力常数分别为1.76×109Umol、143×109L/mol和1.04×109L/mol.结论 获得了效价高、特异性好的抗rhcTn I的单克隆抗体,为cTnI诊断试剂盒的研制奠定了基础.     

抗伏马菌素B_1单克隆抗体的制备及鉴定

目的建立抗伏马菌素B1（FB1）的单克隆杂交瘤细胞株,制备抗FB1的单克隆抗体（McAb）。方法采用FB1-KLH偶联物小剂量长周期免疫BALB/c小鼠后,采用细胞融合方法获得分泌抗FB1的杂交瘤细胞株,采用多次亚克隆的方法建立了4株稳定分泌抗FB1抗体的杂交瘤细胞株。腹水诱生法获得大量McAb,采用抗体亚类测定试剂盒鉴定抗体的亚类,SDS-PAGE测定抗体分子量,McAb的特异性和灵敏度用间接竞争抑制ELISA。结果免疫小鼠血清检测结果显示经过5次免疫后血清的效价稳定在1×10-6,经过4次亚克隆后建立4株稳定分泌抗FB1抗体的杂交瘤细胞株,获得腹水,纯化抗体,抗体亚类属于IgG2a类,轻链为κ,轻链和重链的相对分子质量分别是55000和32000,ELISA检测抗体特异性显示可与FB1发生特异性反应,采用此抗体建立间接竞争抑制ELISA方法的线性范围在2～500ng/ml。结论制备了特异性和灵敏度较高的抗FB1单克隆抗体,为建立伏马菌素免疫学检测方法打下良好基础。     

以人IgG作免疫原同时获取抗人γ重链及κ、λ轻链单克隆抗体的研究

本文报道用纯化的IgG免疫BALB／c小鼠，同时获得抗人γ重链及抗κ、λ轻链三种单克隆抗体．经鉴定，抗人γ重链McAb只与IgG反应，不与其它Ig及轻链反应。抗κ及λ链McAb除分别与游离的κ、λ轻链反应外，也与和Ig分子中重链结合的κ、λ反应。免疫电转印法测定，抗γ链McAb识别分子量为50KD的重链抗κ、λ McAb识别分子量为22KD的轻链。将所得抗κ、λ单克隆抗体分别与正常人周血单个核细胞进行反应，染色结果表明k链表达与λ链表达细胞之比为2；1：两种抗体配对混合后的反应结果与多克隆抗体SmIg一致。实验结果表明所获抗体符合抗γ、κ、λ单克隆抗体的特点。     

抗博尔纳病病毒核蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备并鉴定鼠抗博尔纳病病毒核蛋白单克隆抗体。方法重组核蛋白免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行常规融合,用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤并进行有限稀释法克隆和亚克隆,建立分泌抗核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,纯化单克隆抗体并进行效价测定和特异性鉴定。结果建立了1株能稳定分泌抗核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2F6E8,重链为IgG2a,轻链为κ。ELISA法测得腹水的效价高达1∶32 000以上。Western-blot和间接免疫荧光实验证实该单克隆抗体能特异性结合重组核蛋白及天然核蛋白。结论成功制备了效价高、特异性好的抗核蛋白单克隆抗体,为建立博尔纳病病毒血清免疫学检测方法奠定了基础。