鹿类中药材的位点特异性PCR鉴定研究

目的　建立一种简便、准确的鹿类中药材鹿茸、鹿鞭、鹿筋、鹿胎的DNA分子标记鉴定方法。方法　在对鹿类中药材的正品原动物梅花鹿、马鹿及其混伪品原动物的Cytb基因全序列分析的基础上 ,设计了一对专用于鉴定正品鹿类药材的位点特异性鉴别引物ILu0 1 L和ILu0 1 H。结果　在 6 4℃的复性温度下 ,用鉴别引物对原动物样品进行鉴别PCR ,仅正品能得到约 36 5bp阳性扩增带 ;对鹿茸、鹿鞭及鹿筋正、伪品药材进行PCR鉴定 ,结果表明 :3批鹿茸仅一批为正品 ,2批鹿鞭皆为伪品 ,鹿筋正、伪品药材PCR鉴定与形态鉴定结果一致。随机选取 2枚鹿茸及一个原动物做Cytb基因片段序列分析 ,其结果与PCR鉴定完全一致。结论　对市售鹿类商品药材需加强质量监督和管理。所设计的鉴别引物对梅花鹿、马鹿有高度特异性 ,可应用于以其为原动物的鹿类中药材的鉴定。     

金钱白花蛇及其伪品的Cyt b基因片段序列分析和PCR鉴别研究

对金钱白花蛇及其伪、混品药材和原动物的Cyt b基因片段的序列分析发现,该基因片段在金钱白花蛇及其伪品间的差异远远大于金钱白花蛇种内个体间的差异,是理想的用于鉴别金钱白花蛇及其伪混品的分子遗传标记。在对Cyt b基因片段序列分析的基础上,设计了金钱白花蛇PCR鉴别的一对高度特异性引物BuL-1和BuH-1。结果表明,该对引物在对金钱白花蛇的PCR鉴别中,用60℃～65℃的复性温度,可以100%检出金钱白花蛇,误检率和漏检率为0,并能在混合的药材粉末中检测出被检样品中是否含有金钱白花蛇组份。本研究还表明PCR鉴别将有可能成为中成药复方组分鉴别的一种新手段。     

鹿鞭线粒体DNA指纹鉴定

目的探讨鹿鞭及牛鞭线粒体细胞色素b基因部分序列片段特征,建立中药材鹿鞭敏感、特异的DNA分子标记学鉴定方法。方法碱变性法提取新鲜鹿鞭及牛鞭,采用引物设计软件PrimerPremier5.0对鹿鞭及牛鞭的细胞色素b基因序列分析,用于鉴定正品鹿鞭的特异性引物,经聚合酶链式反应(PCR)扩增,对鹿鞭进行DNA指纹鉴定。结果对鹿鞭进行mtDNA鉴定图谱显示,真品鹿鞭有306bp条带,伪品没有。结论用此方法对鹿鞭进行鉴定,可准确辨别正品与伪品。重现性、稳定性好,简便准确而可行。鹿鞭mtDNA具有特异性指纹特征,所得鹿鞭DNA指纹特征图谱可用于鹿鞭的鉴定。     

梅花鹿鹿茸和马鹿鹿茸中5种核苷类成分的含量比较

目的 建立HPLC测定梅花鹿鹿茸和马鹿鹿茸药材中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、鸟苷和肌苷5种核苷成分含量的方法,并比较不同批次的梅花鹿鹿茸和马鹿鹿茸药材中5种核苷类成分含量的差异。方法 采用HPLC对15批梅花鹿鹿茸药材和15批马鹿鹿茸药材进行测定,并对测定结果进行聚类分析。结果 测定了梅花鹿鹿茸和马鹿鹿茸药材中5种核苷类成分的含量,二者中核苷类成分含量差异显著;不同产地不同养殖户的鹿茸药材中,5种核苷成分含量也存在明显差异。采用聚类分析能将不同产地的15批梅花鹿鹿茸和15批马鹿鹿茸药材分为2类。结论 不同产地梅花鹿鹿茸和马鹿鹿茸药材核苷成分的组成存在显著性差异,鹿茸药材的质量受鹿的品种、自然环境、养殖技术等因素的影响。该方法适用于梅花鹿鹿茸和马鹿鹿茸中核苷类成分的含量测定,为二者质量控制提供保证。     

市售鹿鞭的DNA指纹鉴定研究

目的：探讨鹿鞭及牛鞭线粒体细胞色素b基因（Cytb）部分序列片段特征,建立中药材鹿鞭敏感、特异的DNA分子标记学鉴定方法。方法对市售鹿鞭进行样本处理,模板制备,采用鹿鞭特异性引物进行PCR反应,对市售鹿鞭样本采取DNA指纹鉴定。结果对市售鹿鞭中药材进行mtDNA鉴定,有三个样本为正品。结论此方法对市售鹿鞭鉴定,可准确辨别正品与伪品。重现性、稳定性好,简便准确而可行,说明鹿鞭mtDNA具有特异性指纹特征,所得鹿鞭DNA指纹特征图谱可用于市售鹿鞭的鉴定。     

市售鹿鞭的DNA指纹鉴定研究

目的探讨鹿鞭及牛鞭线粒体细胞色素b基因(Cytb)部分序列片段特征,建立中药材鹿鞭敏感、特异的DNA分子标记学鉴定方法。方法对市售鹿鞭进行样本处理,模板制备,采用鹿鞭特异性引物进行PCR反应,对市售鹿鞭样本采取DNA指纹鉴定。结果对市售鹿鞭中药材进行mtDNA鉴定,有三个样本为正品。结论此方法对市售鹿鞭鉴定,可准确辨别正品与伪品。重现性、稳定性好,简便准确而可行,说明鹿鞭mtDNA具有特异性指纹特征,所得鹿鞭DNA指纹特征图谱可用于市售鹿鞭的鉴定。     

金钱白花蛇及其伪品的DNA分子诊断鉴别

为建立金钱白花蛇品种的DNA分子标记鉴定方法,本文通过提取金钱白花蛇及其伪品药材和原动物样品的模板DNA,用通用引物扩增样品的Cyt b基因片断。PCR扩增所得产物纯化后直接测序,所得序列经对位排列和比较金钱白花蛇及其伪品的DNA序列,发现Cyt b基因片段的种间差异显著大于种内个体间变异,因此该基因片段是蛇类药材鉴定中一个很好的分子标记。基于所得DNA序列数据,设计了一对高度特异性的鉴别引物用于金钱白花蛇的PCR鉴定。用该对引物对金钱白花蛇进行PCR鉴定。在60℃－65℃的复性温度条件下,样品的误检和漏检率为0,能100％地正确区分出正品与伪品药材,此外该方法还能检测出混合粉末中是否含有正品金钱白花蛇成分。研究结果表明用本鉴定引物对金钱白花蛇的PCR鉴定方法简便、有效,实用性强,该方法还有可能成为中成药复方组分鉴别的一种新手段。     

鹿线粒体DNA的种属特异性片段研究

目的：寻找鹿线粒体DNA上区别于常见伪充鹿类药材来源动物的种属特异性片段。方法：根据对不同产地梅花鹿、马鹿、白唇鹿线粒体DNA进行PCR扩增和序列测定,并与亲缘关系较近的伪充药材来源动物线粒体DNA同位置序列比较,找到鹿的特征片段,经过实际检测,筛选出鹿的种属特异性片段。结果：该种属特异性片段作为PCR引物能对鹿DNA进行扩增,而不能扩增其它常见伪充药材来源动物的DNA。结论：该片段能从基因型特征上将鹿和伪充药材来源动物区分开来,而且准确可靠。     

中药材龟甲及原动物的高特异性PCR鉴定研究

目的:建立一种简便、实用的龟甲药材DNA 分子鉴定方法。方法:根据22 种亚洲产龟类的线粒体12SrRNA 基因片段序列,设计一对专用于鉴定中药材龟甲原动物乌龟的鉴别引物,用该对引物扩增从乌龟和其他18 种龟共48 个样品的DNA 模板。结果:在72℃的复性温度下进行PCR,4 个乌龟的模板DNA 均得到约180 bp 的阳性扩增带,而其他各龟的模板DNA,在同样条件下无扩增产物,用这对鉴别引物经一次PCR 反应便可准确地鉴定受试原动物是否为乌龟。同法对江苏省药品检验所提供的17 块样品龟甲进行了鉴定,结果表明只有4 块样品为正品,其余皆为伪品,与性状鉴定和DNA序列分析鉴定结果完全一致。结论:所设计的鉴别引物对乌龟有高度特异性,所配制的龟甲药材鉴定试剂盒可在龟甲药材鉴定中使用。     

鹿茸等动物生药鉴定方法的研究进展

鹿茸是传统名贵中药材。我国在2010年版《中华人民共和国药典》中规定了梅花鹿茸、马鹿茸为正品药材。由于鹿茸及产品需求量增加,使得伪品、混淆品和代用品在国内的中药源市场屡见不鲜,导致了中药材市场的混乱。这种现象也见于其它名贵中草药材,如人参、鹿鞭、龟甲以及貂心等,严重影响了中国传统药学的美誉,更制约着中国传统医药的规范化、标准化和国际化的发展。因此提供简捷、精准的鉴定方法为净化中药材市场、发扬光大我国的传统中药具有极其深远的意义。     

鹿茸多肽对骨、软骨细胞增殖的实验研究

用3H－TdR参入法观察鹿茸多肽对兔助软骨细胞、人胚关节软骨细胞及鸡胚头盖骨成骨样细胞DNA合成的影响。结果表明，10～50μg／ml鹿茸多肽能明显刺激软骨细胞和成骨样细胞的增殖，其增殖作用有明显的量效关系且无种属特异性。     

不同来源鹿茸肽对成骨细胞作用的比较

目的比较塔里木马鹿茸肽与梅花鹿茸肽对成骨细胞增殖分化的影响,并分析药材差异性。方法以相同工艺从两种鹿茸中提取不同肽段的鹿茸肽。以MTT法及PNPP法检测不同肽段鹿茸肽对原代大鼠成骨细胞的增殖分化作用。采用粉末鉴别及薄层色谱法分析塔里木马鹿茸与梅花鹿茸的结构及甘氨酸含量差异。以凝胶电泳法及HPLC法分析鹿茸肽成分差异。结果从塔里木马鹿茸中分离得到3种不同肽段的鹿茸肽,分别为相对分子质量(Mr)>30 kD组分(样A)、Mr5～10 kD组分(样B)、Mr>5 kD组分(样C);从梅花鹿茸中分离得到3种不同肽段的鹿茸肽,分别为Mr>30 kD组分(样D)、Mr5～10 kD组分(样E)、总肽组分(样F)。样B和C显著促进大鼠成骨细胞增殖并上调碱性磷酸酶活性,样F仅具有促进细胞增殖作用,其余组分作用微弱。塔里木马鹿茸与梅花鹿茸粉末形态类似,但含有更多甘氨酸成分,其鹿茸肽含更多潜在活性成分。结论塔里木马鹿茸与梅花鹿茸存在较大差异,前者包含抗骨质疏松成分。     

Molecular authentication of the animal crude drug Sailonggu (bone of Myospalax baileyi)

Two pairs of allele-specific diagnostic primers (SL1L/SL1H and SL2L/SL2H) for distinguishing the Chinese crude drug Sailonggu (bone of plateau zokor, Myospalax baileyi) from its substitutes were designed based on complete sequences of mitochondrial 12S rRNA and cytochrome b genes of the original animals of Myospalacinae, bamboo rat Rhizomys sinensis and black lipped pika Ochotona curzoniae. Total DNA was extracted from crude drug samples and original animals. Allele-specific diagnostic PCRs were performed using these primers with the total DNA as a template annealing at 65 degrees C. Positive amplifications were obtained from all DNA templates of Sailonggu and M. baileyi, whereas negative amplifications resulted from those of other zokors, the bamboo rat and black lipped pika. These results indicate that Sailonggu samples can be definitely distinguished from their substitutes by diagnostic PCR, and no incorrect discrimination was found under the same reaction conditions. Each of the two diagnostic primer pairs can be used to distinguish crude drug Sailonggu from its substitutes or adulterants. The three Sailonggu samples studied were diagnosed as genuine Sailonggu. In addition, the results of sequence alignment and phylogenetic analysis are congruent with that of the allele-specific diagnostic PCR.     

Authentication of Chinese crude drug, Gecko, by allele-specific diagnostic PCR.

Based on the sequences of the mitochondrial 12S rRNA gene fragment of 17 samples from Gekkonidae, Salamandridae, Agamidae and Hynobiidae, respectively, a pair of allele-specific primers was designed for differentiating the Chinese medicinal material Gecko from its adulterants by PCR. The results of amplification with the primers indicate that amplicons from the templates of Gekko gecko were clearly revealed by agarose gel electrophoresis, whereas no evident amplicons were found from other species. The primers were employed to identify crude drug samples from different sources. Among a total of 9 samples, 3 were diagnosed as genuine Gecko. This result is consistent with morphological identification and DNA sequence analyses.     

Authentication of an animal crude drug, Zaocys, by diagnostic PCR

A pair of diagnostic primers for distinguishing the Chinese crude drug Zaocys (Zaocys dhumandes) from its substitutes was designed based on the sequence data of the original animal of the drug and substitutes. Total DNAs were extracted from genuine crude drug and 5 of its substitutes, as well as from 12 species of original animal of the snake crude drug. Diagnostic PCRs were performed using the primers with these total DNAs as a template, annealing at 60-65 degrees C. Positive amplifications were obtained from all DNA templates of Zaocys, whereas negative amplifications were obtained from that of others. The results indicate that Zaocys samples could be definitely distinguished from its substitutes by diagnostic PCR, and no incorrect discrimination was found under the same reaction conditions. The advantages of the method in the authentication of crude drugs are also discussed in the present paper.     

用热分析技术和红外光谱法鉴别花鹿茸的研究

热分析技术可用以快速鉴定花鹿茸的组成，差热曲线显示花鹿茸的失水峰的外延起始温度为３８．９℃，其所含蛋白质的热解外延起始温度３０５℃。热重曲线显示花鹿茸含水分８．２９％，含蛋白质４０．２８％，含无机物５１．００％，应用差热分析法求花鹿茸细粉的热解活化能，未角化的内部组织的平均热解活化能为１３．１３ＫＪ／ｍｏｌ（ＳＤ＝０．１２ＫＪ／ｍｏｌｎ＝３），表皮层的平均热解活化能为４３．０９ＫＪ／ｍｏ１（ＳＤ＝６．２８ＫＪ／ｍｏｌ，ｎ＝３），表皮层的热解活化能比之未角化的内部组织的热解活化能大。红外光谱确定花鹿茸在２８０～４８０℃热解的有机物为蛋白质类，其无机物残渣为骨炭，花鹿茸在１５０℃以下有良好的稳定性。     

鹿茸多肽的纯化和鉴定(英文)

应用凝胶过虑和离子交换层析等技术,从鹿茸(pilose antler or Cervus nipponTemminck)中分离纯化出一种多肽(peptide of pilose antler,PAP)。经高效液相色谱和N-末端氨基酸分析鉴定为单一多肽,氨基酸组成分析证明,PAP是由68个氨基酸组成,分子是为7200。药理研究证明,PAP对大鼠角叉菜胶性足肿胀具有明显的抑制作用并呈现良好的量—效关系。