细粒棘球蚴95抗原基因的克隆及原核表达质粒的构建

目的：克隆细粒棘球蚴95（Eg95)抗原基因，构建携带目的基因的原核表达载体，为细粒棘球蚴抗原的免疫保护机制研究提供材料。方法：应用PCR方法从细粒棘球蚴cDNA文库中克隆获得Eg95抗原基因，将其克隆至pUCm-T载体，测序确定其正确性。利用定向克隆技术将Eg95抗原基因片段克隆至原核表达质粒pET28上，根据选择标记的卡那霉素抗性基因筛选到阳性克隆，通过酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆，测序确定序列。结果：测序表明所有pET28-Eg95阳性克隆均为正确连接95抗原基因的重组质粒。结论：pET28-Eg95可以进一步用于重组蛋白的表达及抗细粒棘球蚴感染的实验研究。     

细粒棘球蚴Eg95全长基因的克隆与在甲醇酵母中的表达

目的 了解我国新疆细粒棘球绦虫表膜蛋白Eg95的全长基因结构及尝试其在甲醇酵母中表达。方法 PCR从细粒棘球蚴头节DNA中扩增含有全长编码区序列(cds)的基因，克隆到T载体中测序。再亚克隆到pMETαA中，构建不带6个组氨酸标签的重组质粒，转化甲醇酵母，分析Eg95全长基因的表达。结果 成功扩增了细粒棘球蚴绦虫1262bp的Eg95全长基因，含有两个内含子，外显子核苷酸序列与Genbank中细粒棘球绦虫Eg95 cds完全—致，但扩增的基因与已知的其他Eg95全长基因存在差别。1μg重组质粒的表达盒转化甲酵酵母PMD16，获得了Eg95基因重组工程酵母10个，其中非同源重组子3个。甲酵诱导非同源重组酵母特异表达出了分子量约为17kDa与Eg95cds编码蛋白接近的蛋白。酵母培养上清SDS-PAGE未见该蛋白条带出现，表达的蛋白可能主要位于酵母表面。结论 克隆到Eg95属于—个基因家族的成员之—，其基因编码区高度保守，含有内含子的全长基因同样可在酵母中进行表达。     

细粒棘球蚴AgB亚单位抗原基因的克隆和表达系统的优化

目的从我国细粒棘球绦虫分离株（新疆源和甘肃源）中克隆AgB1和AgB2两个亚单位基因,并试用不同的表达载体对两个AgB亚单位基因的表达情况进行比较观察。方法设计特异性引物,扩增AgB1和AgB2亚单位抗原基因,分别用pET28a（＋）、pET32a（＋）和pGEX4T-13种表达载体构建重组质粒,对AgB亚单位基因在不同载体中的表达情况进行比较。结果从我国细粒棘球绦虫分离株中克隆的AgB1和AgB2抗原基因与GenBank中的序列比对,AgB1与德国人源、巴西羊源、意大利牛源均有一定的核苷酸和氨基酸差异;AgB2与乌拉圭羊源序列完全一致。在3种载体中表达重组蛋白的结果显示,不同载体和表达系统对重组表达蛋白的生物活性和可溶性有较大的影响。结论成功地克隆了细粒棘球蚴AgB亚单位基因,AgB1和AgB2基因在3种不同表达载体中的表达情况及对融合标签蛋白的血清基础反应性的比较分析表明,两个重组抗原在pET32a载体中的表达优于pET28a和pGEX4T-1载体。     

包虫疫苗候选抗原基因FABP的克隆与序列分析

目的 获得细粒棘球蚴脂肪酸结合蛋白（FABP）基因序列资料，并进行序列分析。方法 从包虫包囊内获取细粒棘球蚴原头蚴（protocloex)，提取RNA和DNA，分别以cDNA和基因组DNA为模板扩增出FABP基因；并将其分别克隆到T载体后进行序列测定和分析；同时将从cDNA扩增得到的FABP基因亚克隆到原核表达载体（pTGEX-4T)。结果 获得长度分别为402bp和482bp两个FABP基因，序列分析表明内含子区域在349…427bp，同源性比较结果FABP基因ORF内一个碱基突变。结论 获得了FABP基因，为研究其免疫效果奠定了基础。     

细粒棘球蚴抗原B亚单位基因序列分析

【目的】获得细粒棘球蚴抗原B亚单位基因序列 ,并进行序列分析。【方法】从包虫病羊体内获取细粒棘球蚴原头节 ,使用TRIZOL试剂提取总RNA ,逆转录成cDNA。根据E .granulosus抗原B亚单位基因的已知序列设计一对引物 ,采用RT PCR技术扩增出抗原B亚单位基因 ;将PCR产物纯化后用双脱氧链末端终止法进行序列测定 ,并进行序列分析。【结果】用RT PCR成功扩增出细粒棘球蚴抗原B亚单位基因序列 ,测序表明该基因ORF为 2 70bp ,和已发表基因核苷酸序列相比 ,缺失 3个碱基 ,同源性为 84 2 % ,推导编码氨基酸序列同源性为 77 8%。【结论】从E .granulosuscDNA扩增出抗原B亚单位基因 ,该基因编码 8ku亚单位前体蛋白。     

细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因的克隆和序列分析

目的获得细粒棘球蚴（E.granulosus）诊断抗原（diagnostic antigen）P-29基因并进行序列分析。方法从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA,根据GenBank公共数据库检索出细粒棘球蚴诊断抗原P-29基因的已知序列设计一对引物,通过RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因,将其重组到pGEM-T载体后进行序列测定和分析。结果成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因,测序表明该片段由717bp组成,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为100％,推导编码氨基酸序列同源性为100％。结论成功克隆细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因序列,可做为包虫病重组抗原的候选基因。     

细粒棘球蚴病及其免疫预防

<正>细粒棘球蚴病是一种地方流行性的人畜共患寄生虫病,极大地危害着人们的身体健康和畜牧业的发展,是全球性重要的经济和公共卫生问题。免疫预防是控制细粒棘球蚴病流行的有效手段,用疫苗预防可以节约大量的人力和财力,也能够彻底控制包虫病的流行,是有效的防治措施。研究发现各种     

新疆细粒棘球蚴免疫诊断抗原B亚单位3基因的克隆及序列分析

目的确定细粒棘球蚴抗原B亚单位3(EgAgB8/3)的特性并为研究其免疫功能奠定基础。方法根据已报道的编码EgAgB8/3的基因序列(AF362442)设计引物,进行基因扩增,利用DNAstarProtean软件对该抗原进行分析。结果成功克隆到EgAgB8/3基因,扩增片段为207 bp;序列比对结果显示,新疆细粒棘球蚴EgAgB8/3基因与GenBank登录号为AF362442序列完全一致,同源性为100%。对该抗原分析认为具有潜在的抗原表位位点。结论细粒棘球蚴EgAgB8/3在对包虫病的免疫诊断上是较好的候选抗原,并为研究该蛋白的免疫功能及建立以EgAgB8/3抗原为主的包虫病终末宿主免疫诊断方法奠定了基础。     

细粒棘球绦虫原头蚴抗原对犬的免疫效果和抗原组份分析

分别用细粒棘球绦虫活原头蚴匀浆抗原和分泌抗原２ｍｌ，加完全佐剂和不完全佐剂，免疫犬２次，每次间隔２１天，可使犬获得不完全抗攻击感染的能力。匀浆抗原的免疫优于分泌抗原，感染率为２５％，与对照组９０％比有显著差异，并对体现人虫体的发育有明显抑制作用，孕卵率为０；分泌抗原的感染率、孕卵率与对照组相比差异不大，经抗原蛋白组份分析，原头匀浆抗原显示１４条蛋白组份，分别为２２．５、３１．０、３６．０、４０．０     

细粒棘球蚴中国大陆株Eg10基因片段的分子克隆和序列分析

目的 获得细粒棘球蚴（E．granulosus）Eg10基因片段，并进行序列分析。方法 从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴，提取总RNA，根据GeneBank公布的细粒棘球蚴Eg10基因片段已知序列，设计一对引物，采用RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆株Eg10基因片段，将纯化后的PCR产物克隆到pGEM-T载体，进行序列测定和分析。结果 成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株k10基因片段，测序为938bp，该基因序列与检索基因核苷酸序列同源性为100％，推导编码氨基酸序列同源性亦为100％。结论 测序的k10基因序列有完整的编码框（765bp），对于进一步研究其结构和功能及对包虫病的免疫预防具有重要意义。     

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗诱导小鼠脾细胞增殖变化的研究

目的 探讨细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95-EgA31疫苗免疫和Eg原头节攻击后小鼠的囊重抑制率及脾细胞增殖的变化.方法 将细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗分别采用皮下注射、肌肉注射、鼻腔内接种和口服灌胃4种途径免疫BALB/c小鼠,免疫后8周每鼠用50个Eg原头节攻击感染,感染后25周剖杀小鼠,分离细粒棘球蚴包囊并称重,计算囊重抑制率;取脾,分离脾细胞,用Eg粗抗原(EgAg)或刀豆素A(ConA)刺激培养,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测免疫小鼠脾细胞增殖反应,同时设有空载体、Bb和MRS对照.结果 以上4种疫苗接种组小鼠的囊重抑制率分别为45.33%、41.33%、70.67%和62.67%;疫苗接种组的脾细胞明显增殖:鼻腔内接种和口服免疫组的脾细胞增殖显著高于皮下和肌肉注射组.结论 细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗可诱导小鼠产生特异性的细胞免疫反应.     

转细粒棘球绦虫Eg95-EgA31融合基因苜蓿的培育及鉴定

目的培育并鉴定转细粒棘球绦虫Eg95-EgA31融合基因苜蓿,为进一步研究转基因苜蓿疫苗提供依据。方法将构建好的pBI-Eg95-EgA31质粒电穿孔转化根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,At)LBA4404株,利用重组根瘤农杆菌(rAt)侵染苜蓿(alfalfa)叶片,卡那霉素抗性筛选伤愈组织体胚,培育转基因苜蓿,用SDS-PAGE、Western-blot、PCR和RT-PCR鉴定转基因苜蓿。结果SDS-PAGE和Western-blot证实Eg95-EgA31融合基因在苜蓿中得到表达,表达产物分子质量约为37500Mr,表达效率约占苜蓿叶总蛋白的0.05%,且能被感染细粒棘球蚴的鼠血清特异识别。PCR和RT-PCR均扩增出1016 bp Eg95-EgA31融合基因片段。结论成功培育了转细粒棘球绦虫Eg95-EgA31融合基因苜蓿,为进一步研究细粒棘球绦虫转基因苜蓿疫苗奠定了基础。     

细粒棘球蚴95抗原在真核昆虫表达系统中表达、纯化及免疫原性初步分析

目的 采用真核昆虫表达系统表达细粒棘球蚴95(Eg95)抗原,探讨其免疫原性.方法 从GeneBank 获取Eg95基因序列(序列编号:EU595937.1),合成开放读码框(CDS)全长基因;利用杆状病毒表达系统Bac-to-Bac symtem在昆虫细胞中表达目的基因Eg95,亲和层析纯化,Western blot鉴定;对Balb/c小鼠分别免疫接种重组昆虫表达目的蛋白Eg95(简称eu rEg95)、原核重组表达Eg95(简称pro rEg95)、阴性对照PBS,制备免疫血清,间接法ELISA对各组特异性IgG抗体进行分析.结果 合成Eg95基因CDS全长471 bp,经测序与理论完全一致;Western blot证实目的蛋白通过重组杆状病毒在昆虫细胞内实现可溶性表达;ELISA结果表明:eu rEg95能够诱导产生原头蚴特异性IgG抗体,抗体水平高于pro rEg95组(P＜0.05).结论 利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达出具有良好免疫原性的Eg95抗原,为优化细粒棘球蚴疫苗奠定基础.     

细粒棘球绦虫烯醇酶(EgEnolase)基因的克隆和序列分析

目的 细粒棘球绦虫烯醇酶基因(EgEnolase)的克隆和所编码的蛋白质的结构、功能以及应用前景分析.方法 利用美国国家生物技术信息中心(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的在线分析工具BLASTx和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPaSy.http://ca.expasy.org/),以及CBS Prediction Servers提供的蛋白序列在线分析工具,结合Vector NTI suite生物信息学分析软件,从GenBank中细粒棘球绦虫的表达序列标签(EST)数据库中发现烯醇酶的5'端和3'端的EST序列,根据预测的编码区两端序列设计引物,从细粒棘球绦虫青海绵羊分离株中用多聚酶链式反应(PCR)方法扩增其基凶组序列,PCR产物克隆到T载体,测序并分析序列中的内含子,以内含子两侧序列的合并序列为引物.采用不对称PCR方法去除其中的内含子序列,预测编码蛋白的结构和功能特征,并分析其应用前景.结果 细粒棘球绦虫青海绵羊株烯醇酶基因的基因组序列长为1 449 bp,含有两个长度分别为78 bp和69 bp的小内含子.该基因编码433个氨基酸;预测其氨基酸序列中含有一段跨膜区(aa104-124),N端在膜外,C端在膜内,恰好分为两个不同的功能域,膜内区是执行酶催化功能的主体,Swiss-Model模建的3D结构显示,膜内区由α螺旋和β折叠相间排列形成桶样结构,底物结合位点、催化中心、Mg2+结合位点等关键位点在空间上紧密靠近,位于桶形结构的中心.该蛋白还有一个潜在的核定位序列aa190-199 .该蛋白含有多个T、B细胞表位,且膜外的aa49-57.和膜内的aa228-236兼性的T、B细胞表位,线性B细胞表位aa206-213中包含了催化位点Glu210.结论 细粒棘球绦虫烯醇酶可能是一个位于虫体皮层表膜具有较好的免疫诊断和疫苗应用前景的膜蛋白,同时还可能进入细胞核调节基因表达.     

细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗免疫小鼠后IgG及其亚类和IgE的动态观察

目的:动态观察细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗免疫小鼠后IgG及其亚类和IgG的变化.方法:将疫苗分别采用鼻腔内接种和口服灌胃免疫BALB/C鼠,在免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16和18周各剖杀4只小鼠,眼球取血,常规ELISA测定血清中IgG及其亚类和IgG水平,同时设有PBS对照.结果:鼻腔内接种组的血清IgG、IgG2a和IgG2b水平均在免疫后2～18周升高,分别在免疫后10、4和6周达最高水平;血清IgG1、IgG3和IgE水平均在免疫后2～18周降低,分别在免疫后8、12和10～12周达最低水平.口服免疫组的血清IgG、IgG2a和IgG2b水平均在免疫后2～18周增加,分别在免疫后14、8和8周达峰值;血清IgG1、IgG3和IgE水平均在免疫后2～18周下降,分别在免疫后8、6和16～18周达最低水平.结论:细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗在免疫早期即可诱导小鼠产生一个TH1型保护性免疫反应.