shRNA干扰NLRP3对晚期糖基化终末产物诱导的心肌细胞炎症反应的影响

目的  探讨沉默NOD 样受体家族pyrin域3 (NOD-like receptor family,pyrin domain containing 3, NLRP3)炎性小体对晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs)诱导的心肌细胞损伤的调节作用及机制。 方法  H9c2心肌细胞分为4组:对照组、 AGEs组、AGEs+sh-Ctrl组、 AGEs+sh-NLRP3组,后两组细胞首先将短发夹RNA（shRNA）对照（sh-Ctrl）和shRNA干扰NLRP3（sh-NLRP3）质粒分别转染入H9c2细胞,然后后3组细胞用100 mg/L AGEs处理24 h,建立H9c2损伤模型,对照组细胞用溶剂处理24 h。Western blot检测NLRP3、凋亡相关微粒蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)、 Caspase-3、 Caspase-9、核转录因子κB(nuclear factor κB, NF-κB) P65和磷酸化P65（p-P65）的表达,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测白细胞介素(interleukin, IL)-6、IL-18和IL-1β的水平,流式细胞术检测细胞凋亡,免疫荧光染色检测细胞核中NF-κB P65的水平。结果  AGEs组和AGEs+sh-Ctrl组NLRP3、 ASC、Caspase-3和Caspase-9的表达均高于对照组( P<0.05)。与AGEs组相比,AGEs+sh-NLRP3组NLRP3、ASC、Caspase-3和Caspase-9的表达均下降( P<0.05)。与对照组相比,AGEs组和AGEs+sh-Ctrl组IL-6、IL-18、IL-1β水平升高,细胞凋亡率上升(P<0.05)。AGEs+sh-NLRP3组IL-6、IL-18、IL-1β水平和细胞凋亡率低于AGEs组( P<0.05)。AGEs组和AGEs+sh-Ctrl组NF-κB P65磷酸化水平及细胞核的NF-κB P65水平高于对照组(P<0.05)。与AGEs组相比,AGEs+sh-NLRP3组NF-κB P65磷酸化水平及细胞核的NF-κB P65水平降低( P<0.05)。结论  沉默NLRP3可通过抑制NF-κB P65的活化减轻AGEs诱导的心肌细胞凋亡及炎症反应。     

基于TLR4/MyD88/NF-κB通路异甘草素对大鼠颅脑外伤后炎症反应及Th1/Th2失衡的影响

【摘要】 目的 探讨异甘草素（ISL)通过介导Toll样受体4（TLR4）/髓样分化因子88（MyD88）/核转录因子-κB (NF-κB)通路对大鼠颅脑外伤 （TBI)炎症反应及Th1/Th2细胞失衡的影响。方法将SPF级大鼠随机分为模型组、ISL低剂量组（20 mg·kg-1）、ISL高剂量组（40 mg·kg-1）、阳性药物组（甘油果糖氯化钠,40 mg·kg-1）,每组10只,另设对照组。HE染色观察大鼠脑组织病理学变化;比较血清白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-4（IL-4）、γ干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平,脑组织TLR4、My D88、NF-κB p65 mRNA及TLR4、My D88、NF-κB p65、磷酸化核转录因子-κB p65（p-NF-κB p65）蛋白表达。结果与对照组比较,模型组血清IL-1β、IL-4、TNF-α水平,脑组织TLR4、My D88 mRNA及TLR4、My D88、p-NF-κB p65蛋白水平升高,血清IFN-γ水平降低（均P＜0.05）;与模型组比较,ISL低剂量组、ISL高剂量组、阳性药物组血清IFN-γ水平升高,IL-1β、IL-4、TNF-α水平降低,脑组织TLR4、My D88 mRNA及TLR4、My D88、p-NF-κB p65蛋白水平降低（均P＜0.05）;与ISL低剂量组比较,ISL高剂量组、阳性药物组血清IFN-γ水平升高,IL-1β、IL-4、TNF-α水平降低,脑组织TLR4、My D88 mRNA及TLR4、My D88、p-NF-κB p65蛋白水平降低（均P＜0.05）;与ISL高剂量组比较,阳性药物组血清IFN-γ水平升高,IL-1β、IL-4、TNF-α水平降低,脑组织TLR4、My D88 mRNA及TLR4、My D88、p-NF-κB p65蛋白水平降低（均P＜0.05）。HE结果显示,ISL低剂量组、ISL高剂量组、阳性药物组脑组织病变较模型组出现不同程度改善,ISL高剂量组和阳性药物组改善尤为明显。结论ISL能有效改善大鼠TBI炎性反应、调节Th1/Th2细胞平衡,可能基于调控TLR4/MyD88/NF-κB通路相关mRNA和蛋白表达发挥作用。     

神经肽P物质诱导高糖条件下人皮肤成纤维细胞分泌MCP-1的分子机制

目的 探讨神经肽P物质(SP)诱导高糖培养环境中的人皮肤成纤维细胞分泌单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)的分子机制.方法 采用高糖DMEM培养基培养人皮肤成纤维细胞,加入同一浓度(10 nmol/L) SP孵育不同时间,Western blotting检测细胞中核因子κB(NF-κB)抑制蛋白α(IκBα)、磷酸化IκBα(p-IκBα)和磷酸化NF-κB亚单位p65 (p-NF-κBp65)的表达,免疫荧光方法观测细胞p-NF-κBp65表达和转位情况.将高糖DMEM培养基培养人皮肤成纤维细胞分为对照组、SP组和SP+ NF-κB抑制剂(MG132)组(以MG132预处理细胞60 min),Western blotting检测各组细胞内p-NF-κBp65的表达,ELISA方法测定细胞培养上清液中MCP-1的浓度.结果 随着SP作用时间的延长,成纤维细胞IκBα的表达量显著减少,p-IkBα的表达量显著增加(P＜0.05);同时p-NF-κBp65的表达量在SP作用后显著增加(P＜0.05),并保持递增趋势;免疫荧光染色激光共聚焦显微镜观察证实SP作用后细胞胞核内p-NF-κBp65表达增强.与SP组比较,SP+ MG132组细胞p-NF-κBp65表达及细胞培养上清液中MCP-1浓度均显著降低(P＜0.05).结论 SP促进人皮肤成纤维细胞分泌MCP-1的作用机制可能与NF-κB信号通路激活有关.     

孟鲁司特钠通过抑制TLR4/NF-κB信号通路影响哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖和凋亡

目的：探讨孟鲁司特钠（Mon）对哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖和凋亡及炎症因子分泌的影响,阐明哮喘大鼠气道重塑及炎症反应的分子机制。方法：采用卵清蛋白致敏和激发构建急性哮喘大鼠模型,原代培养大鼠气道平滑肌细胞,取第5代细胞用于实验。实验分为对照组（正常气道平滑肌细胞）、模型组（哮喘模型大鼠气道平滑肌细胞）和治疗组（哮喘模型大鼠气道平滑肌细胞+Mon干预）。采用噻唑蓝（MTT）法检测各组细胞增殖活性,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测各组细胞上清液中白细胞介素6（IL-6）和转化生长因子β1（TGF-β1）水平,Western blotting法检测各组细胞中增殖细胞核抗原（PCNA）、细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、Toll样受体4（TLR4）和核因子κB（NF-κB）p65蛋白表达水平,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测各组细胞中TLR4和NF-κB p65 mRNA表达水平。结果：与对照组比较,模型组和治疗组细胞活性明显升高（P<0.05）,细胞凋亡率明显降低（P<0.05）,IL-6和TGF-β1水平升高（P<0.05）,PCNA、CyclinD1、Bcl-2、TLR4和NF-κB p65蛋白表达水平及TLR4和NF-κB p65 mRNA表达水平均明显升高（P<0.05）,而Bax蛋白表达水平明显降低（P<0.05）;与模型组比较,治疗组细胞增殖活性明显降低（P<0.05）,细胞凋亡率明显升高（P<0.05）,IL-6和TGF-β1水平降低（P<0.05）,PCNA、CyclinD1、Bcl-2、TLR4和NF-κB p65蛋白表达水平及TLR4和NF-κB p65 mRNA表达水平均明显降低（P<0.05）,而Bax蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。结论：Mon可抑制哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖,促进细胞凋亡,减轻哮喘气道炎症反应,其作用机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路有关。     

miR-16-5p通过调控PD-L1表达影响肝星状细胞炎症反应的研究

目的分析miR-16-5p在肝星状细胞中对程序性死亡受体-1（PD-1）表达的影响,并探讨其在肝纤维化及炎症反应中的作用机制。方法以大鼠肝星状细胞HSC-T6为研究对象,用5ng/ml转化生长因子β1（TGF-β1）处理细胞0、24、48、72h后,光镜下观察细胞形态,RT-qPCR法检测细胞TNF-α和IFN-γ表达水平,筛选出TGF-β1最佳作用时间。将细胞分为6组：对照组、模型组、miR-16-5p超表达组、miR-16-5p抑制组、超表达-空载组、抑制-空载组,采用RT-qPCR法检测miR-16-5p表达水平以验证转染效果;光镜下观察细胞形态变化;采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力;采用Westernblot法检测细胞PD-1配体（PD-L1）、NF-κB、p-NF-κB蛋白表达水平;采用RT-qPCR法检测细胞miR-16-5p、PD-L1以及炎症因子TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-10mRNA表达水平。结果5ng/mlTGF-β1处理细胞0、24、48、72h后,细胞增殖且形态发生改变;炎症因子TNF-α、IFN-γ在TGF-β1处理48h时后表达水平均明显增高（均P＜0.05）。与模型组相比,对照组和miR-16-5p超表达组细胞miR-16-5p的mRNA表达水平以及PD-L1和IL-10蛋白表达水平均明显升高（均P＜0.05）,p-NF-κB/NF-κB的蛋白表达水平以及TNF-α、IFN-γ和IL-6的mRNA表达水平均降低（均P＜0.05）,miR-16-5p超表达组细胞增殖能力降低（P＜0.05）;miR-16-5p抑制组miR-16-5p、PD-L1、IL-10的mRNA表达水平均降低（均P＜0.05）,p-NF-κB/NF-κB的蛋白表达水平以及TNF-α、IFN-γ、IL-6的mRNA表达水平均升高（均P＜0.05）,细胞增殖能力增强（P＜0.05）。结论miR-16-5p在肝星状细胞中通过调控PD-L1表达降低肝细胞炎症水平,抑制细胞增殖,其机制可能参与抑制肝纤维化发生。     

大麻素受体2在脓毒症大鼠急性肺损伤中的作用及其机制

目的 探讨大麻素受体2 (CB2R)对脓毒症大鼠急性肺损伤的作用及其机制。方法 将SD大鼠随机分为对照组、模型组、CB2R激动剂（JWH133）组和CB2R拮抗剂（AM630）组。模型组腹腔注射脂多糖（LPS）构建脓毒症模型;JWH133组和AM630组在注射LPS前30 min注射JWH133和AM630。6 h后光镜和电镜下观察肺组织结构改变;检测肺组织含水率以及支气管肺泡灌洗液（BALF）中TNF-α、IL-1β的含量;实时定量PCR检测肺组织ERK1/2及NF-κB p65 mRNA的表达;Western blotting检测肺组织TNF-α、IL-1β、ERK、p-ERK、NF-κB p65、p-NF-κBp65的蛋白表达。结果 与对照组比较,模型组肺泡结构破坏,大量炎症细胞浸润,超微结构破坏;肺组织含水率升高;BALF中TNF-α、IL-1β水平升高（P <0.05）;肺组织ERK1/2、NF-κB p65 mRNA表达及TNF-α、IL-1β、p-ERK1/2、p-NF-κB p65蛋白表达水平升高（P <0.05）。与模型组相比,JWH133组病理改变及超微...     

蒲黄总黄酮抑制棕榈酸培养下C2C12骨骼肌细胞白细胞介素6的表达

目的：观察蒲黄总黄酮（Pollen Typhae total flavones，PTF）对棕榈酸培养下C2C12骨骼肌细胞白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）表达的影响，探讨PTF改善骨骼肌胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）的可能机制。 方法：0．25mmol／L棕榈酸培养建立骨骼肌细胞IR模型。根据处理方法不同，设对照组、模型组、核转录因子κB（nuclear factor-kappaB，NF-κB）抑制剂PDTC组、罗格列酮（rosiglitazone，ROS）组、ROS＋PDTC组、PTF组和PTF4-PDTC抑制剂组。处理16h后，^3H-脱氧葡萄糖摄入法观察细胞对葡萄糖的转运率，实时定量多聚酶联反应检测IL-6 mRNA的表达，酶联免疫吸附测定法检测细胞培养上清中IL-6蛋白水平。 结果：0．25mmol／L棕榈酸培养16h，C2C12细胞葡萄糖摄取率下降30．43％，IR模型建立；PTF可使IR模型细胞葡萄糖转运率增加32．39％。IL-6 mRNA表达及细胞培养上清液中IL-6蛋白水平均显著下降，差异有统计学意义（P＜0．05）；加入PDTC后，细胞IL-6 mRNA表达及细胞培养上清液中IL-6蛋白水平上升（P〈0．05）。 结论：PTF通过抑制NF-κB通路而抑制C2C12骨骼肌细胞IL-6 mRNA表达及蛋白分泌，可能是其减轻骨骼肌炎症状态和改善IR的机制之一。     

黄芪汤调节TLR4/NF-κB信号通路改善高糖诱导足细胞损伤的研究

  目的  探讨黄芪汤对高糖诱导足细胞损伤的作用及机制。  方法  体外培养人足细胞, 采用30 mmol·L-1葡萄糖干预24 h诱导足细胞损伤, 分别设置对照组、模型组、黄芪汤低浓度组(10 μg·mL-1)、黄芪汤中浓度组(30 μg·mL-1)和黄芪汤高浓度组(100 μg·mL-1)。采用CCK-8法检测细胞增殖能力, 划痕实验检测细胞迁移能力,qPCR法检测TNF-α、IL-6等炎症因子mRNA表达, ELISA法检测足细胞上清TNF-α、IL-6的含量,Western blot法检测足细胞TLR4、NF-κB、p-NF-κB、TNF-α及IL-6蛋白表达。  结果  与对照组比较, 模型组细胞划痕愈合率明显降低(P < 0.01),足细胞中TNF-α、IL-6、CCL24 mRNA表达水平,上清液中TNF-α、IL-6的含量和TLR4、p-NF-κB/NF-κB、TNF-α及IL-6蛋白表达均显著增加(P < 0.05,P < 0.01)。与模型组相比, 黄芪汤组细胞划痕率明显升高(P < 0.01),足细胞中TNF-α、IL-6的含量和mRNA表达,以及TLR4、p-NF-κB/NF-κB、TNF-α、IL-6蛋白表达均显著减少(P < 0.05, P < 0.01)。  结论  黄芪汤能有效减轻高糖对人足细胞的炎症损伤, 增强细胞增殖、迁移能力, 抑制细胞凋亡, 其机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路、下调炎症因子的表达有关。      

去甲斑蝥素抗骨髓瘤作用及其机制研究

目的 探讨去甲斑蝥素（norcantharidin,NCTD）抗骨髓瘤作用及其相关机制。方法 MTT法检测NCTD对人骨髓瘤细胞株RPMI 8226增殖的抑制作用,并观察其对荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用;流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blotting检测核因子-κB（NF-κB）p65、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、NF-κB抑制因子IkBα、磷酸化IkBα（p-IkBα）、IkB激酶α（IKKα）以及Survivin、Bcl-2、Bax蛋白表达水平,分光光度法检测Caspase-3活性,RT-PCR检测NF-κB mRNA表达。结果 NCTD抑制RPMI 8226细胞增殖,促进其凋亡;其剂量为20、40 mg/kg时对荷瘤小鼠的抑瘤率分别为29.8%、53.5%。NCTD抑制胞核NF-κB p65、p-NF-κB p65以及胞浆p-IkBα、IKKα的表达,增加胞浆IkBα的表达,对胞浆NF-κB p65的表达无显著影响。NCTD还抑制Survivin、Bcl-2蛋白的表达,促进Bax的表达和RPMI 8226细胞Caspase-3的活化,Caspase-3抑制剂能部分拮抗NCTD引起的RPMI 8226细胞凋亡（P＜0.05）。结论 NCTD对RPMI 8226细胞有抗增殖和促凋亡作用,其机制可能与NF-κB信号通路有关。     

三七皂苷FC通过MAPK/NF-κB途径抑制RAW264.7细胞炎症及凋亡的机制研究

目的:基于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核转录因子-κB(NF-κB)途径探讨三七皂苷FC对RAW264.7巨噬细胞炎症及凋亡的作用机制。方法:(1)采用不同浓度的三七皂苷FC(0、1、10、20、50、100μmol/L)分别干预RAW264.7细胞和脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞,CCK8法检测细胞活力,筛选合适的药物浓度。(2)将RAW264.7细胞分为对照组、LPS组、LPS+三七皂苷FC低剂量(20μmol/L)组和LPS+三七皂苷FC高剂量(50μmol/L)组。先给予相应剂量的三七皂苷FC预处理6 h,再加入1μg/ml LPS。干预24 h后,PCR检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、白介素-1β(IL-1β)mRNA表达;Western blot检测TNF-α、iNOS、p38MAPK、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡;免疫荧光检测NF-κB核转位;Transwell实验检测细胞迁移。结果:(1)20、50μmol/L三七皂苷FC干预24 h后,LPS诱导的RAW264.7细胞活力较对照组无显著差异(P0.05),用于后续实验。(2)与LPS组相比,低、高剂量的三七皂苷FC作用后,TNF-α、IL-6、iNOS、IL-1β的mRNA表达显著降低(P0.05,P0.01);TNF-α、iNOS蛋白表达明显降低(P0.05),p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-p38MAPK/p38MAPK蛋白表达比值显著下调(P0.05,P0.01);细胞凋亡率显著降低(P0.05,P0.01);细胞核内NF-κB p65蛋白表达减少,阳性表达细胞数占比显著降低(P0.05);细胞迁移数显著减少(P0.01)。结论:三七皂苷FC能够显著改善LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应,减少炎症因子的释放,抑制巨噬细胞凋亡和迁移,其作用机制可能与下调MAPK/NF-κB通路磷酸化水平及抑制NF-κB核转位有关。