黄芪多糖抑制缺氧/复氧损伤乳鼠心肌细胞凋亡与自噬机制研究

目的:探讨黄芪多糖(APS)对缺氧/复氧(H/R)所致乳鼠心肌细胞凋亡与自噬抑制作用的相关机制。方法:分离并体外培养乳鼠心肌细胞3 d后制备H/R损伤细胞模型,设正常对照组、H/R组、APS低、中、高剂量(20、40、80 μmol/ml)组,各组于造模前30 min给药处理。复氧2 h后,CCK-8法检测细胞增殖抑制率,Annexin V-FITC/PI染色法检测细胞凋亡水平,Western blot法检测p-Akt、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax、p-mTOR、Beclin1、LC3、P62蛋白表达。结果:与H/R组比较,APS中、高剂量细胞增殖抑制率和凋亡率显著降低(P<0.01),p-Akt、p-mTOR、Bcl-2表达量显著升高而Cleaved Caspase-3、Bax、Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62表达量显著降低(P<0.05),Bcl-2/Bax比值显著升高、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低(P<0.01)。结论:APS可能通过激活Akt/mTOR通路调控凋亡和自噬相关蛋白表达,对H/R所致乳鼠心肌细胞凋亡与自噬起到抑制作用。     

葛根素诱导人肝癌HepG2细胞凋亡与自噬及其分子机制研究

[目的] 探索葛根素（Puerarin）诱导人肝癌HepG2细胞凋亡与自噬及其可能的分子机制。[方法] 以二甲基亚砜（DMSO，空白组）、葛根素（50、100、200 μg/mL）、顺铂20 μg/mL分别干预对数生长期人肝癌HepG2细胞。48 h后，CCK-8法检测细胞增殖抑制率，Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡水平，吖啶橙染色法观察细胞自噬状况，蛋白免疫印迹法（Western blot）检测蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）、激活型半胱氨酸蛋白酶（Cleaved Caspase-3）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）、酵母ATG6同源物（Beclin1）、微管相关蛋白1轻链3（LC3）蛋白表达。[结果] 与空白组比较，葛根素100、200 μg/mL组和顺铂20 μg/mL组HepG2细胞增殖抑制率和凋亡率显著升高（P<0.01），自噬溶酶体数量明显增多（P<0.01），p-Akt、p-mTOR、bcl-2表达明显下调而Cleaved Caspase-3、Bax、Beclin1、LC3-I、LC3-Ⅱ表达明显上调（P<0.05或P<0.01），Akt磷酸化（p-Akt/Akt比值）降低且Bax/bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高（P<0.01）。与顺铂20 μg/mL组比较，葛根素200 μg/mL组细胞增殖抑制率和凋亡率显著升高（P<0.05或P<0.01），自噬溶酶体数量明显增多（P<0.05），p-Akt、p-mTOR表达下调而Cleaved Caspase-3、Bax、Beclin1、LC3-Ⅱ明显上调（P<0.05或P<0.01），Akt磷酸化降低且Bax/Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-I比值升高（P<0.01）。[结论] 葛根素具有诱导人肝癌HepG2细胞凋亡与自噬的作用，该作用具有一定的剂量依赖性；抑制Akt/mTOR/Beclin1通路进而诱导促凋亡、促自噬相关蛋白表达和活化可能是其重要的分子机制。     

金匮肾气丸通过AMPK/mTOR途径抑制肺组织细胞凋亡和自噬在大鼠慢性阻塞性肺疾病中的作用

[目的] 探究金匮肾气丸对慢性阻塞性肺疾病（COPD）的作用及其可能的作用机制。[方法] 40只SD大鼠随机分为空白对照组、COPD组、金匮肾气丸3.7 g/kg组、金匮肾气丸7.4 g/kg组和地塞米松组,每组各8只。除空白对照组外,其余组大鼠采用烟熏联合气管内滴注脂多糖（LPS）法建立COPD大鼠模型。各组给予相应药处理AniRes2005动物肺功能分析系统检测大鼠肺功能;酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒检测白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-17（IL-17）水平;苏木精-伊红（HE）染色检测肺组织病理学变化;TUNEL染色检测肺组织细胞凋亡;蛋白质免疫印迹（Western blot）检测自噬及磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）途径相关蛋白的表达。[结果] 与空白对照组相比,COPD组大鼠肺功能降低,IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-17水平明显升高（P<0.05）,炎症评分、细胞凋亡率和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-AMPK/AMPK蛋白表达水平明显升高（P<0.05）,p62和p-mTOR/mTOR蛋白表达水平明显降低（P<0.05）;与COPD组相比,金匮肾气丸3.7 g/kg组、金匮肾气丸7.4 g/kg组和地塞米松组大鼠肺功能升高,IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-17水平明显降低（P<0.05）,炎症评分、细胞凋亡率和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-AMPK/AMPK蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,p62和p-mTOR/mTOR蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。[结论] 金匮肾气丸可能通过AMPK/mTOR途径抑制肺组织细胞凋亡和自噬,延缓大鼠慢性阻塞性肺疾病进展。     

竹节参总皂苷对脂多糖诱导的BV2细胞炎症反应的影响及机制研究

目的 观察竹节参总皂苷（TSPJ）对脂多糖诱导的小鼠小胶质细胞BV2炎症反应的影响，探讨其改善炎症的作用机制。方法 采用脂多糖诱导BV2细胞炎症模型，将细胞分为正常组、模型组和TSPJ低、中、高浓度组，分别进行干预后，ELISA检测细胞上清液一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-1β、IL-4和IL-10含量，免疫荧光染色检测小胶质细胞标志物CD86、Arginase-1及自噬蛋白LC3表达，Western blot检测自噬相关蛋白p62、Beclin1、LC3及Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达。结果 与正常组比较，模型组细胞上清液NO、TNF-α、IL-1β含量明显增加，IL-4、IL-10含量明显减少，细胞CD86表达明显升高，Arginase-1、LC3表达明显降低，Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达明显降低，p62、p-Akt、p-mTOR蛋白表达明显升高，差异均有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，TSPJ高浓度组细胞上清液NO、TNF-α、IL-1β含量明显减少，IL-4和IL-10含量明显增加，细胞CD86表达明显降...     

基于自噬/凋亡研究淫羊藿女贞子合用糖皮质激素对3-MA诱导的ASMCs自噬抑制状态的作用

目的 研究淫羊藿女贞子合用糖皮质激素对自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)抑制气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells, ASMCs)自噬的影响。方法 培养大鼠原代ASMCs,随机分为5组，即正常组(正常大鼠血清)、3-MA组(正常大鼠血清+3-MA)、激素组(正常大鼠血清+3-MA+地塞米松)、中药组(3-MA+淫羊藿女贞子含药血清)、合用组(3-MA+淫羊藿女贞子含药血清+地塞米松)。根据分组分别加入正常大鼠血清或含药大鼠血清；除正常组外，其余各组同时加入3-MA刺激ASMCs, 48h后进行检测。电镜观察细胞超微结构；MTT法检测细胞活力：免疫细胞化学法检测增殖蛋白Ki-67蛋白表达；Annexin V-FITC/PI法检测凋亡活性；Western Blot或免疫荧光法检测LC3、Bax、Bcl-2、P53、Caspase-3、Beclin-1、mTOR、p-mTOR蛋白表达。结果 与3-MA组比较，各给药组可不同程度地增加3-MA抑制的自噬活性，上调LC3 II/I比值、Beclin-1表达，下调mTOR及p-mTO...     

肝豆扶木汤对CuCl2诱导的HepG2细胞氧化损伤的保护作用和机制

目的 基于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路探讨肝豆扶木汤（GDFMD）对氯化铜（CuCl₂）诱导的人肝癌细胞（HepG2）氧化损伤的保护作用。方法 HepG2细胞分为空白组，模型组，GDFMD组，PI3K/mTOR抑制剂NVP-BEZ235（10 nmol·L^-1）组，GDFMD+NVP-BEZ235（10 nmol·L^-1）组。采用200 μmol·L^-1 CuCl₂构建模型组铜负荷HepG2细胞，酶联免疫吸附测定法（ELISA）观察细胞超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性和丙二醛（MDA）含量；免疫荧光观察细胞微管相关蛋白1轻链3（LC3）蛋白表达水平；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测细胞磷酸化PI3K（p-PI3K）/PI3K，磷酸化Akt（p-Akt）/Akt，磷酸化mTOR（p-mTOR）/mTOR，Beclin-1，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，p62表达；实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测细胞PI3K，Akt，mTOR，Beclin-1，LC3Ⅰ，LC3Ⅱ，p62 mRNA表达。结果 与空白组比较，模型组细胞SOD，GSH-Px活性下降，MDA含量显著升高（P<0.01）；与模型组比较，10% GDFMD含药血清组SOD，GSH-Px活性升高，MDA含量下降（P<0.05，P<0.01）；NVP-BEZ235组GSH-Px活性下降，MDA含量升高（P<0.05）。与空白组比较，模型组p-PI3K/PI3K，p-Akt/Akt，p-mTOR/mTOR，p62表达水平显著降低，Beclin-1，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平显著升高（P<0.01）；与模型组比较，10% GDFMD组p-PI3K/PI3K，p-Akt/Akt，p-mTOR/mTOR，p62表达水平升高，Beclin-1，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平下降（P<0.05，P<0.01）；NVP-BEZ235组p-PI3K/PI3K，p-mTOR/mTOR表达水平下调，Beclin-1，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平升高（P<0.05，P<0.01）。与10% GDFMD组比较，10% GDFMD+NVP-BEZ235组p-Akt/Akt，p-mTOR/mTOR表达水平下降，Beclin-1，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平升高（P<0.05，P<0.01）。与空白组比较，模型组LC3Ⅱ蛋白表达显著升高（P<0.01）；与模型组比较，10% GDFMD组LC3Ⅱ蛋白表达降低，与10% GDFMD组比较，10% GDFMD+NVP-BEZ235组LC3Ⅱ蛋白表达升高。各组PI3K，Akt，mTOR mRNA相对表达量差异无统计学意义，与空白组比较，模型组p62 mRNA相对表达量显著降低，Beclin-1，LC3Ⅰ，LC3Ⅱ mRNA相对表达量显著升高（P<0.01）；与模型组比较，10% GDFMD组p62 mRNA相对表达量升高，Beclin-1，LC3Ⅰ，LC3Ⅱ mRNA表达水平下调（P<0.01）；NVP-BEZ235组Beclin-1 mRNA相对表达量升高（P<0.05）。与10% GDFMD组比较，10%GDFMD+NVP-BEZ235组Beclin-1，LC3Ⅱ mRNA相对表达量升高（P<0.01）。结论 GDFMD能抑制CuCl₂诱导的HepG2细胞过度自噬，减轻细胞氧化损伤，其机制可能与激活PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。     

氧化槐定碱体内体外通过AKT/mTOR通路调控自噬抑制HBV诱发肝纤维化＊

目的 观察氧化槐定碱抑制HBV诱发肝纤维化的机制。方法 采用细胞间非接触式的共培养体系进行培养，同时建立HBV诱发肝纤维化的动物模型，四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测LX-2细胞抑制率，qRT-PCR法检测α-SMA、collagen I mRNA水平，Western blot检测细胞纤维化、自噬、AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达水平，运用AKT-siRNA、雷帕霉素、自噬抑制剂（3-MA）探讨自噬对肝纤维化的影响。结果 体外实验显示：0.5-32 mg·L^-1氧化槐定碱抑制LX-2细胞的增殖（P<0.05）；与对照组比较，氧化槐定碱4、8、16、32 mg·L^-1组α-SMA、collagen I mRNA表达水平降低，Beclin-1、LC3 II/LC3 I水平上调，p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平下调（P<0.05）；与氧化槐定碱16 mg·L^-1组比较，氧化槐定碱16 mg·L^-1+AKT-siRNA组抑制率、LC3 II/LC3 I明显增加，p-AKT/AKT、collagen I明显降低（P<0.05）；与氧化槐定碱16 mg·L^-1组比较，氧化槐定碱16 mg·L^-1+3-MA组抑制率、LC3 II/LC3 I明显降低，p-AKT/AKT、collagen I明显增加（P<0.05）。体内实验显示：与氧化槐定碱组比较，氧化槐定碱+雷帕霉素组ALT、AST、collagen I、p-mTOR/mTOR水平明显下调，LC3 II/LC3 I水平明显上调；氧化槐定碱+3-MA组LC3 II/LC3 I水平明显下调，collagen I、p-mTOR/mTOR明显上调（均P<0.05）。结论 氧化槐定碱能调控肝细胞自噬，上调细胞纤维化水平，其机制可能与调控AKT/mTOR信号通路有关。     

薯蓣皂苷元对人骨肉瘤细胞自噬的影响

目的 探讨薯蓣皂苷元对人骨肉瘤细胞自噬的影响。方法 MTT法检测薯蓣皂苷元对人骨肉瘤MG63和U2OS细胞增殖的影响,透射电镜技术观察细胞超微结构,免疫荧光法观察细胞自噬蛋白Beclin1表达,Western blot法检测细胞自噬分子标记物LC3、Beclin1和PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达。薯蓣皂苷元联合PI3K通路抑制剂LY294002处理MG63和U2OS细胞,RT-qPCR法检测细胞Beclin1 mRNA表达;联合自噬抑制剂3-methyladenine(3-MA)处理MG63和U2OS细胞,MTT法检测细胞增殖抑制率,Western blot法检测细胞cleaved-caspase3蛋白表达,RT-qPCR法检测细胞caspase3 mRNA表达。结果 薯蓣皂苷元能抑制骨肉瘤MG63和U2OS细胞增殖,促使自噬体生成,增加LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表达(P<0.05,P<0.01),降低LC3 I蛋白表达(P<0.01),可抑制PI3K/Akt/mTOR通路蛋白磷酸化水平(P<0.05,P<0.01);联合自噬抑制剂干预后...     

基于p53/AMPK信号通路观察益气扶正解毒汤对A549细胞自噬水平和生长的影响

目的 探讨益气扶正解毒汤对A549细胞自噬水平和生长的作用及机制。方法 制备益气扶正解毒汤含药血清干预A549肺癌细胞。蛋白免疫印迹法（Western blot）检测A549细胞中自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3）,自噬关键分子酵母Atg6同系物1（Beclin1）,p62,p53蛋白和腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）,磷酸化AMPK（p-AMPK）,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和磷酸化mTOR（p-mTOR）蛋白的水平,免疫荧光（IF）检测微管相关蛋白1A/1B轻链3B（MAP1LC3B）蛋白水平,5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷（EDU）染色、侵袭实验（Transwell）和β-半乳糖苷酶染色分别检测含药血清对细胞增殖、侵袭、衰老情况的影响;设置自噬抑制剂甲基腺嘌呤（3-MA,5 mmol·L^-1）干预组,即分为10%胎牛血清组（空白组）,10%正常血清组（正常组）,10%含药血清低、中、高剂量组,10%高剂量含药血清加3-MA（高剂量+3-MA）组,检测各组细胞增殖、侵袭、衰老水平;并设置p53抑制剂（PFT-α, 10 μmol·L^-1）组,即分为正常组,PFT-α组,高剂量组,高剂量+PFT-α组,检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ,Beclin1表达水平和MAP1LC3B免疫荧光强度及各组细胞增殖、侵袭、衰老的情况。结果 与空白组、正常组比较,干预A549细胞48 h,益气扶正解毒汤中、高剂量组LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白水平呈剂量依赖性升高（P<0.01）;益气扶正解毒汤低、中、高剂量组p62,p-mTOR/mTOR蛋白下降（P<0.05,P<0.01）,p53,p-AMPK/AMPK蛋白表达升高（P<0.01）;益气扶正解毒汤低、中、高剂量组A549细胞增殖、侵袭数量明显降低,细胞衰老数量显著增多（P<0.01）,同时MAP1LC3B免疫荧光强度增强,且益气扶正解毒汤高剂量组效果最佳;与益气扶正解毒汤高剂量组比较,益气扶正解毒汤高剂量+3-MA组、益气扶正解毒汤高剂量+PFT-α组发生增殖、侵袭的细胞数量均增加,而发生衰老的细胞数量明显减少（P<0.05,P<0.01）,同时,高剂量+PFT-α组的MAP1LC3B免疫荧光强度减弱及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ,Beclin1蛋白表达水平降低（P<0.05,P<0.01）。结论 益气扶正解毒汤可经p53/AMPK信号通路上调A549细胞自噬水平,进而抑制A549细胞增殖、侵袭迁移,促进细胞衰老,在抑制肺癌进展中具有重要作用。     

迷迭香酸通过AMPK/mTOR通路减轻新生大鼠缺血缺氧性脑损伤研究

目的 探讨迷迭香酸对新生大鼠缺血缺氧脑损伤（hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE）的影响,及其对单磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）通路的调控作用,初步探讨其脑保护机制。方法 取7 d龄SD新生大鼠,随机分为对照组、模型组、迷迭香酸（300 mg/kg）组、AMPK/mTOR激动剂MT6378（10 mg/kg）组、AMPK抑制剂GSK-690693（30 mg/kg）组和迷迭香酸（300 mg/kg）+MT6378（10 mg/kg）组,每组20只。建立HIE模型,给予相应药物进行干预,采用TTC染色法检测大鼠脑梗死情况;透射电镜（TEM）观察大鼠海马神经元结构损伤及自噬状况;免疫荧光法检测大鼠海马神经元自噬标记物微管相关蛋白1轻链3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3B,LC3B）阳性表达;TUNEL法检测大鼠海马神经元凋亡率;免疫组化法检测大鼠海马神经元磷酸化AMPK（p-AMPK）阳性表达;Western blotting检测大鼠海马组织活化的半胱氨酸蛋白酶3（cleaved Caspase-3）、mTOR及其磷酸化蛋白（p-mTOR）、Unc-51样自噬激活激酶1（uncoordinated-51 like autophagy activating kinase 1,Ulk1）及其磷酸化蛋白（p-Ulk1）、LC3B表达。结果 与对照组相比,模型组大鼠脑梗死严重,海马神经元结构损伤及自噬空泡形成较多,细胞自噬及凋亡水平升高,AMPK/mTOR通路活化（P<0.05）。与模型组相比,迷迭香酸组及GSK-690693组大鼠脑梗死、海马神经元结构损伤、凋亡及自噬减弱,AMPK/mTOR通路被抑制（P<0.05）;MT6378组海马组织AMPK/mTOR通路进一步激活,大鼠脑梗死、海马神经元结构损伤、凋亡及自噬进一步加重（P<0.05）;MT6378可逆转迷迭香酸的上述作用（P<0.05）。结论 迷迭香酸可能通过抑制AMPK/mTOR通路激活,降低海马神经元自噬及凋亡进程,发挥抗HIE脑损伤作用。     

降压通络方对缺氧诱导的大鼠肾小管上皮细胞TGF-β1/Smad信号通路的影响

目的探讨降压通络方对缺氧诱导的大鼠肾小管上皮（NRK-52E）细胞凋亡的相关分子机制。方法制备降压通络方（1.42g/mL灌胃大鼠）含药血清和缬沙坦（0.83mg/mL灌胃大鼠）含药血清，采用缺氧诱导大鼠NRK-52E细胞凋亡模型，分为4组：正常组、模型组、降压通络方组和缬沙坦组。采用CCK-8试剂盒检测细胞活力值，AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率，ELISA法检测细胞上清液转化生长因子β1（TGF-β1）蛋白表达，免疫荧光法检测TGF-βRⅠ、Smad2/3蛋白定位，WesternBlot法检测TGF-βRⅠ、Smad2/3蛋白表达。结果TGF-βRⅠ、Smad2/3在NRK-52E细胞上广泛表达。与正常组比较，模型组细胞活力值降低（P<0.01），凋亡率升高（P<0.01），TGF-β1、TGF-βRⅠ、Smad2/3表达升高（P<0.01）。与模型组比较，降压通络方组和缬沙坦组细胞活力值升高（P<0.01），凋亡率降低（P<0.05，P<0.01），TGF-β1、TGF-βRⅠ、Smad2/3表达降低（P<0.01，P<0.05）。与缬沙坦组比较，降压通络方组TGF-β1表达升高（P<0.05），细胞活力值、凋亡率、TGF-βRⅠ和Smad2/3表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论降压通络方能抑制缺氧诱导的NRK-52E细胞凋亡，其作用机制可能是通过抑制TGF-β1/TGF-βRⅠ/Samd2/3信号通路而实现。     

基于Akt/mTOR信号通路探讨洋地黄毒苷调控甲状腺滤泡上皮细胞自噬与凋亡的机制

目的 探究洋地黄毒苷对脂多糖刺激下的人甲状腺滤泡上皮细胞系Nthy-roi3-1凋亡与自噬的影响及其作用机制。方法 (1)将Nthy-roi3-1细胞分为对照组、脂多糖组、脂多糖+洋地黄毒苷低剂量组、脂多糖+洋地黄毒苷中剂量组及脂多糖+洋地黄毒苷高剂量组,各组进行对应处理后,CCK-8法检测各组细胞活力,免疫荧光染色观察各组细胞自噬标志物微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达情况,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot法检测各组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Bcl-2同源结构域蛋白抗体(Beclin 1)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p70S6K蛋白表达情况。(2)将Nthy-roi3-1细胞分为对照组、脂多糖组、脂多糖+洋地黄毒苷组、脂多糖+洋地黄毒苷+自噬抑制剂组,各组进行对应处理后,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot法检测各组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR及p70S6K蛋白表达情况。结果 (1...     

基于AMPK/mTOR自噬通路探讨芍药苷保护溃疡性结肠炎小鼠的作用机制

目的 探讨芍药苷通过腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）自噬通路对溃疡性结肠炎（UC）小鼠的保护作用机制研究。方法 自由饮用4%葡聚糖硫酸钠（DSS）建立UC小鼠模型，56只BALB/c雄性小鼠，随机分为模型组、AMPK抑制剂组（20 mg·kg^-1）、芍药苷（50 mg·kg^-1）+抑制剂（20 mg·kg^-1）组、芍药苷高剂量组（50 mg·kg^-1）、中剂量组（25 mg·kg^-1）、低剂量组（12.5 mg·kg^-1）药物干预7 d后，通过比较小鼠体质量、疾病活动指数（DAI）变化和苏木素-伊红（HE）染色结果判断芍药苷对UC的保护作用。酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测各组小鼠血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的水平，免疫荧光检测结肠中微管相关蛋白1轻链3（LC3）的含量，蛋白免疫印迹法（Western blot）检测结肠组织中AMPK、mTOR蛋白及其磷酸化蛋白p-AMPK、p-mTOR，实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测AMPK、mTOR、Beclin1、LC3和p62的mRNA表达水平。结果 与空白组比较，模型组小鼠体质量下降、DAI评分升高、结肠出现严重的病理学损伤，炎症因子TNF-α、IL-6在血清中含量上升（P<0.01），LC3和p-AMPK/AMPK在结肠组织中蛋白水平下调，p-mTOR/mTOR蛋白水平上调（P<0.01）；AMPK、LC3的mRNA表达水平下调，mTOR、p62的mRNA表达上调（P<0.01）。与模型组和芍药苷+抑制剂组比较，经芍药苷治疗后小鼠体质量上升、DAI评分降低、结肠组织病理损伤减轻，炎症因子TNF-α、IL-6在血清中含量下降（P<0.05），LC3和p-AMPK/AMPK在结肠组织中蛋白水平上调，p-mTOR/mTOR蛋白水平下调（P<0.01），AMPK、Beclin1、LC3的mRNA表达水平上调，mTOR、p62的mRNA表达下调（P<0.01），抑制剂组小鼠结肠组织病理损伤严重，各项指标趋势与芍药苷高剂量组完全相反。结论 芍药苷可通过激活AMPK/mTOR信号通路，增强自噬，减轻UC小鼠的炎症损伤，从而起到保护作用。     

基于AMPK/mTOR/ULK1信号通路介导的自噬探讨芪黄益气摄血方治疗免疫性血小板减少症模型小鼠的作用机制

目的 基于腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/Unc-51样激酶1（AMPK/mTOR/ULK1）信号通路介导的自噬探讨芪黄益气摄血方治疗免疫性血小板减少症（ITP）模型小鼠的作用机制。方法 50只BALB/c小鼠随机分为5组，分别为正常组、模型组、芪黄益气摄血方高、低剂量组和强的松组，每组10只。采用豚鼠抗小鼠血小板血清（APS）腹腔注射方法，建立ITP小鼠模型；注射APS后的第8天，各组分别灌胃给药，连续14 d。检测外周血血小板计数（PLT）和血红蛋白（Hb）浓度变化；分离脾脏、胸腺组织，称质量，计算脏器指数；取胸骨做骨髓涂片，显微镜下进行骨髓巨核细胞分类；酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清血小板生成素（TPO）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-β₁（TGF-β₁）、γ干扰素（IFN-γ）水平；实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测脾脏AMPK、mTOR、ULK1、微管相关蛋白1轻链3（LC3）、自噬关键分子酵母Atg6同系物（Beclin1）、p62 mRNA表达水平；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测脾脏AMPK、p-AMPK、p-mTOR、p-ULK1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p62蛋白表达水平。结果 与正常组比较，模型组小鼠外周血PLT计数、Hb及TPO水平明显下降（P<0.05，P<0.01），脾脏和胸腺指数显著升高（P<0.01），骨髓产板巨核细胞数显著减少（P<0.01），血清IL-6、TNF-α、IFN-γ水平显著升高（P<0.01），而IL-10、TGF-β₁水平显著降低（P<0.01）；与模型组比较，芪黄益气摄血方高、低剂量组及强的松组显著增加模型小鼠PLT计数、TPO水平（P<0.01），明显降低脾脏和胸腺指数（P<0.05，P<0.01），明显增加骨髓产板巨核细胞数（P<0.05，P<0.01），明显降低血清IL-6、TNF-α、IFN-γ水平（P<0.05，P<0.01），明显提高IL-10、TGF-β₁水平（P<0.05，P<0.01）；与芪黄益气摄血方低剂量组比较，芪黄益气摄血方高剂量组和强的松组在改善PLT计数、细胞炎性因子水平方面呈现不同程度的显著性差异（P<0.05，P<0.01）。Real-time PCR和Western blot结果显示，与正常组比较，模型组小鼠脾脏AMPK、LC3、Beclin1 mRNA和p-AMPK/AMPK、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表达均明显上调（P<0.05，P<0.01），mTOR、ULK1、p62 mRNA和p-mTOR、p-ULK1、p62蛋白表达水平明显下调（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，芪黄益气摄血方高、低剂量组及强的松组可明显下调脾脏AMPK、LC3、Beclin1 mRNA和p-AMPK/AMPK、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表达（P<0.05，P<0.01），同时明显上调mTOR、ULK1、p62 mRNA和p-mTOR、p-ULK1、p62蛋白表达水平（P<0.05，P<0.01）。结论 芪黄益气摄血方可能通过调控AMPK/mTOR/ULK1信号通路抑制自噬的过度发生，从而调节免疫失耐受，发挥治疗ITP作用。     

姜黄素通过β-Catenin/BCL9信号通路介导的细胞自噬调节肝癌细胞的恶性生物学行为

目的：探讨姜黄素（Cur）调控β-Catenin/BCL9通路对肝癌细胞HepG2自噬反应及生物学行为的影响。方法：将HepG2细胞分为对照组（Control组）、Cur组（20.0μmol/L）、Cur+自噬抑制剂组[Cur(20.0μmol/L)+3-MA(5.0 mmol/L)]、Cur+质粒对照组[Cur(20.0μmol/L)+VEC]、Cur+Bcl9过表达组[Cur(20.0μmol/L)+OE-BCL9]、Cur+shRNA慢病毒载体阴性对照组[Cur(20.0μmol/L)+Sh-NC]、Cur+shRNA BCL9慢病毒载体组[Cur(20.0μmol/L)+Sh-BCL9],分别检测HepG2细胞凋亡、迁移与侵袭,观察自噬体的形成与自噬体水平,Western blotting检测自噬（LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1）、上皮间质转化（Vimentin、E-cadherin）、β-Catenin/BCL9通路（BCL9、β-Catenin）相关蛋白相对表达量。结果：Cur组细胞凋亡率、LC3Ⅱ/Ⅰ及Beclin1、E-cadherin蛋白相对表达量显著高于Control...     

基于PI3K/AKT/GSK-3β信号通路探讨鳖甲煎丸调控肝癌细胞Hep3B增殖转移的机制

目的:研究鳖甲煎丸对肝癌细胞Hep3B增殖和转移的影响,探讨其抗肝细胞癌的作用机制。方法:分别使用不同浓度的鳖甲煎丸药物血清培养肝癌细胞Hep3B,采用CCK8、细胞划痕实验观察肝癌细胞增殖和转移能力的改变;采用Western Blot检测PI3K、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β、E-cadherin、N-cadherin、Snail蛋白表达的变化。结果:与NC组比较,各给药组均能显著抑制肝癌细胞Hep3B的增殖和转移(P<0.05),p-AKT、p-GSK-3β蛋白表达均显著下调,GSK-3β蛋白表达水平均显著上调(P<0.05);E-cadherin蛋白表达水平均显著上调,而N-cadherin、Snail蛋白表达水平均显著下调(P<0.05);其中,H组可显著下调PI3K蛋白表达水平(P<0.05),其他各组变化不明显。结论:鳖甲煎丸可以显著抑制肝癌细胞Hep3B的增殖和转移,其机制可能与通过PI3K/AKT/GSK-3β信号通路调控Snail转录因子来调节上皮间质转化有关。     

基于PI3K/Akt/mTOR信号通路的三七总皂苷调控自噬抗H9c2细胞缺氧/复氧损伤机制研究

目的探讨三七总皂苷(PNS)能否通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控自噬从而减轻H9c2细胞缺氧/复氧损伤机制。方法将H9c2细胞分为正常组、缺氧/复氧(A/R)组、A/R+PNS组、A/R+PNS+雷帕霉素(Rapa)组、A/R+Rapa组、A/R+羟氯喹(HCQ)组、A/R+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组。通过缺氧6 h、复氧2 h建立H9c2细胞A/R模型。CCK-8法检测细胞存活率,乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒检测细胞损伤,Western blot检测自噬相关蛋白Atg5、p62、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白PI3K、Akt、m TOR的表达,荧光法观察细胞自噬流。结果与正常组比较,A/R组H9c2细胞存活率明显下降,细胞损伤率明显升高(P0.05),自噬相关蛋白Atg5、Beclin-1表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显升高(P0.05),自噬体和自噬溶酶体数量显著增加,自噬流显著增强(P0.05);与A/R组比较,用PNS预处理后,H9c2细胞存活率明显上升,细胞损伤率明显降低(P0.05),自噬相关蛋白Atg5、Beclin-1表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显降低(P0.05),p62蛋白表达明显升高,与自噬抑制剂HCQ、3-MA作用相似,荧光结果显示,PNS对自噬流有明显抑制作用(P0.05);PNS预处理后p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达明显升高(P0.05)。结论 PNS能有效减轻H9c2细胞A/R损伤,其机制与激活PI3K/Akt/mTOR信号通路从而抑制自噬流相关。     

通窍明目汤通过p53/AMPK/mTOR信号通路介导的细胞自噬改善青光眼视网膜神经节细胞损伤的机制研究

目的 观察通窍明目汤对青光眼视网膜神经节细胞（RGC）氧化应激损伤的作用机制及其对p53/AMPK/mTOR通路所介导的RGC自噬的影响。方法 采用CCK-8法检测RGC增殖率,流式细胞术检测RGC凋亡率,免疫荧光检测RGC内活性氧（ROS）表达,ELISA法检测丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）含量及活性,Western blot检测RGC中Beclin-1、p62表达、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及p53/AMPK/mTOR信号通路相关蛋白表达情况。结果 与空白组比较,模型组RGC增殖率下降,RGC凋亡率升高;ROS阳性细胞数量增加,SOD活性、MDA和GSH-PX含量升高,模型组细胞Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、细胞核p53、p-AMPK及mTORC1表达升高,p62、细胞质p53、AMPK及p-mTORC1蛋白表达降低（P<0.05）;与模型组比较,各浓度通窍明目汤组RGC增殖率升高,RGC凋亡率下降;RGC中ROS阳性细胞数量减少;SOD活性,MDA和GSH-PX含量降低,与模型组相比,各剂量通窍明目汤组及PFT-ɑ组细胞...     

葛根素通过调控AMPK/GSK-3β/β-catenin信号通路缓解糖尿病大鼠心肌损伤北大核心

目的:观察葛根素对糖尿病大鼠心肌损伤的影响,并探讨葛根素对腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/糖原合成酶激酶-3(GSK-3β)/β-连环蛋白(β-catenin)通路的调控作用。方法:雄性SD大鼠分为正常对照组、模型组、葛根素低剂量(20 mg/kg)组、葛根素高剂量(40 mg/kg)组、葛根素高剂量+Compound C(AMPK抑制剂,1 mg/kg)组,每组15只,除正常对照组外其余各组大鼠均采用1%链脲佐菌素构造糖尿病模型,测定大鼠左心室LVESD、LVEDD、EF、FS;检测大鼠FBG、FINS、HbA1c水平,并计算HOMA-IR;检测大鼠血清CK-MB、cTnⅠ水平;对大鼠心肌组织进行HE染色及Masson染色观察大鼠心肌病理学变化;TUNEL法观察大鼠心肌细胞凋亡;Western Blot法检测大鼠AMPK/GSK-3β/β-catenin通路相关蛋白表达。结果:与正常对照组比较,模型组大鼠心肌细胞形态不规则、排列紊乱、局部肌纤维横纹消失,可见心肌细胞水肿,纤维增生明显,少量心肌细胞变性、坏死,FBG、FINS、HOMA-IR、HbA1c、LVESD、LVEDD、心肌细胞凋亡率及血清CK-MB、cTnⅠ水平显著升高,EF、FS及心肌组织p-AMPK/AMPK、p-GSK-3β/GSK-3β水平和核β-catenin蛋白表达显著降低(P<0.05)。与模型组比较,葛根素各剂量组大鼠心肌损伤现象好转,FBG、FINS、HOMA-IR、HbA1c、LVESD、LVEDD、心肌细胞凋亡率及血清CK-MB、cTnⅠ水平显著降低,EF、FS及心肌组织p-AMPK/AMPK、p-GSK-3β/GSK-3β水平和核β-catenin蛋白表达显著升高(P<0.05)。与葛根素高剂量组比较,葛根素高剂量+Compound C组大鼠心肌损伤加重,FBG、FINS、HOMA-IR、HbA1c、LVESD、LVEDD、心肌细胞凋亡率及血清CK-MB、cTnⅠ水平显著升高,EF、FS和心肌组织p-AMPK/AMPK、p-GSK-3β/GSK-3β水平及核β-catenin蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论:葛根素可通过激活AMPK/GSK-3β/β-catenin信号通路改善糖尿病大鼠胰岛素抵抗与心肌损伤。     

萜类化合物Telekin通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导HGC-27细胞自噬

目的:研究从天名精中分离得到的萜类化合物Telekin诱导的胃癌细胞HGC-27自噬并探讨其分子作用机制。方法:MTT法研究Telekin对不同肿瘤细胞的细胞毒活性;透射电镜观察Telekin诱导的HGC-27细胞自噬;用mRFP-GFP-LC3点状聚集物的形成,评价HGC-27细胞内自噬流的变化;MTT法研究用不同自噬抑制剂氯喹(CQ)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)和mTOR抑制剂雷帕霉素(Rapamycin)预处理时,Telekin对HGC-27细胞的细胞毒活性,研究自噬与细胞死亡的关系。Western blot检测PI3K/Akt/mTOR信号通路关键蛋白PI3K、Akt、mTOR、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、p-ULK1、ULK1、Beclin1、p-Beclin1、p62、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白的表达。结果:MTT实验结果表明Telekin对胃癌细胞HGC-27具有较好的细胞毒活性和一定的选择性;透射电镜和激光共聚焦显微镜观察到Telekin诱导HGC-27细胞发生了明显的自噬和显著的自噬流变化;用Rapamycin预处理时增强了Telekin的细胞毒性,IC_(50)值由22.78μM降为14.4μM。用3-MA和CQ预处理后降低了Telekin的细胞毒性,IC_(50)值从22.78μM增加为30.06μM和29.46μM,说明自噬促进了细胞死亡;Western blot结果显示Telekin降低了p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、p62、LC3Ⅰ的表达,增强了p-ULK1、p-Beclin1、LC3Ⅱ的表达,而对PI3K、Akt、mTOR、ULK1、Beclin1总蛋白没有明显影响。结论:Telekin通过降低p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、p62、LC3Ⅰ的表达水平,增强p-ULK1、p-Beclin1、LC3Ⅱ的表达水平,来诱导HGC-27细胞发生自噬,从而促进细胞死亡。