重组质粒pUC-CK在大肠杆菌中表达条件的优化

目的：优化含PKCε催化功能域基因的重组质粒pUC-CK在大肠杆菌中表达的最佳条件，方法：含重组质粒大肠杆菌培养、表达产物的SDS-PAGE电泳及Westernblot检测，结果：PKCε催化功能域在大肠杆菌中表达的最佳条件为：含重组质粒大肠杆菌过夜培养时加入0．1％的葡萄糖增加质粒拷贝数；诱导剂(IPTG)的最适工作浓度为0．5mmol／L；诱导最适培养温度为30E；诱导培养时间为2～3h用于检测，6～24h用于分离纯化，结论：PKCε催化功能域在大肠杆菌中成功表达，为今后大量表达、纯化该酶蛋白作了前期铺垫。     

莱姆病螺旋体重组质粒pBX1的DNA序列分析及其在大肠杆菌中的诱导表达

目的 为莱姆病血清学诊断和基因工程亚单位疫苗研制提供靶抗原。方法 采用377型DNA自动测序仪对莱姆病螺旋体重组质粒pBX1的插入片段进行DNA序列测定,并通过计算机软件对其进行限制性内切酶酶谱分析。然后将重组质粒pBX1在大肠杆菌中进行诱导表达,并对其表达产物进行免疫印迹分析。结果 （1）重组质粒pBX1插入片段大小为477bp,其核酸序列与文献报道的p83基因全序列相应区段相比较仅有一个碱基的变异,（2）成功绘制了该插入片段的限制性内切酶酶谱;（3）重组质粒在大肠杆菌中诱导表达后获得了29kd的融合蛋白;（4）Western-blotting分析表明该融合蛋白能与莱姆病多价抗血清呈强阳性印迹反应。结论 该研究成功地对莱姆病螺旋体83kd抗原蛋白特异性区段进行了基因重组和表达,为进一步研究其在莱姆病血清学诊断和基因工程亚单位疫苗研制中的应用奠定了基础。     

大肠杆菌JM103温度敏感突变型的分离及其对质粒拷贝数的影响

通过紫外线诱变，得到３２个在４２℃不能生长的Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０３温度敏感突变子。用ＰＤＴＡＩＬ－２△质粒转化１６个突变菌株，分别得到１６个不同的转化株。当从３０℃转到４２℃时，突变子和转化子均停止生长，而野生型则能继续生长。比较不同转化子在３０℃和４２℃培养条件下所携带的拷贝数表明：１６株中有株质粒拷贝数提高５倍以上。本结果的ＤＮＡ重组中有一定的应用价值。     

温度对重组大肠杆菌生长及外源蛋白表达的影响

对重组大肠杆菌（E.coli）BL21（DE3）发酵生产rhCu/Zn-SOD的诱导温度进行了优化，考察了37℃和30℃下重组菌的生长规律及产物表达。在5L自控发酵罐中的发酵结果表明：较低温度时菌体的比生长速率较低，菌体活性与质粒稳定性有很大程度的改善，外源蛋白稳定性与可溶性也有一定的提高；30℃诱导时rhCu/Zn-SOD的酶活性最高，每毫升发酵液的酶活力为4757U，约为37℃诱导时的2.7倍。     

大肠杆菌JM1O3温度敏感突变型的分离及其对质粒拷贝数的影响

通过紫外线诱变，得到32个在42℃不能生长的E.coliJM103温度敏感突变子。用PDTAIL-2△质粒转化16个突变菌株，分别得到16个不同的转化株。当从30℃转到42℃时，突变子和转化子均停止生长，而野生型则能继续生长。比较不同转化子在30℃和42℃培养条件下所携带质粒的拷贝数表明：16株中有6株质粒拷贝数提高5倍以上。本结果在DNA重组中有一定的应用价值。     

医务人员粪便中大肠杆菌R质粒指纹图分析

本文通过对115株大肠杆菌碉耐药谱、R质粒接合传递、质粒凝胶电泳图及内切酶图谱等综合分析，探讨了指纹图谱分析在R质粒流行病学研究中的意义。115株大肠杆菌中有105株为耐药株，其中75株为多重耐药、30株为单一耐药、接合性R质粒检出率在多重耐药株中占70．66％，在单一耐药株中为36．7％。质粒凝胶电泳结果表明，所有耐药株都带有可传递的接合性质粒，酶切图结果显示，耐药性相同的R质粒径内切酶作用后出现相同的质粒DNA片段，表明具有高度同源性。     

医务人员粪便中大肠杆菌R质粒指纹图分析

本文通过对115株大肠杆菌碉耐药谱、R质粒接合传递、质粒凝胶电泳图及内切酶图谱等综合分析,探讨了指纹图谱分析在R质粒流行病学研究中的意义。115株大肠杆菌中有105株为耐药株,其中75株为多重耐药、30株为单一耐药。接合性R质粒检出率在多重耐药株中占70.66％,在单一耐药株中为36.7％。质粒凝胶电泳结果表明,所有耐药株都带有可传递的接合性质粒,酶切图结果显示,耐药性相同的R质粒经内切酶作用后出现相同的质粒DAN片段,表明具有高度同源性。     

225株正常人大肠杆菌药敏及R质粒的检测

本文报告了从长春市健康成人分离的225株大肠杆菌的药敏性及接合性R质粒的检测结果。     

莱姆病螺旋体重组质粒pBX1的DNA序列分析及其在大肠杆菌中的诱导表达

目的　为莱姆病血清学诊断和基因工程亚单位疫苗研制提供靶抗原。方法　采用 377型 DNA自动测序仪对莱姆病螺旋体重组质粒 p BX1的插入片段进行 DNA序列测定 ,并通过计算机软件对其进行限制性内切酶酶谱分析。然后将重组质粒 p BX1在大肠杆菌中进行诱导表达 ,并对其表达产物进行免疫印迹分析。结果　1重组质粒 p BX1插入片段大小为 477bp,其核苷酸序列与文献报道的 p83基因全序列相应区段相比较仅有一个碱基的变异 ,2成功绘制了该插入片段的限制性内切酶酶谱 ;3重组质粒在大肠杆菌中诱导表达后获得了 2 9kd的融合蛋白 ;4Western- blotting分析表明该融合蛋白能与莱姆病多价抗血清呈强阳性印迹反应。结论　该研究成功地对莱姆病螺旋体 83kd抗原蛋白特异性区段进行了基因重组和表达 ,为进一步研究其在莱姆病血清学诊断和基因工程亚单位疫苗研制中的应用奠定了基础。     

重组人酸性成纤维细胞生长因子改构体在大肠杆菌中

目的:提高重组人成纤维细胞生长因子改构体在大肠杆菌工程菌表达体系E.coli BL21(DE3)/pET3c-haFGF中的表达水平.方法:从菌种和培养基筛选做起,选择了全合成的YH培养基做大肠杆菌表达体系E.coli BL21(DE3)/pET3c-haFGF的发酵培养基,并从多角度研究了其质粒的稳定性,设计了生长期不添加抗生素、诱导前离心去除β-内酰胺酶同时添加氨苄青霉素的方法,通过密码子偏爱性和定点PCR突变技术改变β-内酰胺酶的表达强度.结果:经50代传代试验,质粒分配稳定性在90%以上,PstI酶切图谱显示结构稳定性达100%,表达水平维持在25%～28%.LBAmp平板揭示了诱导过程中工程菌丧失表达能力的部分原因,诱导前离心的实验使表达水平提高13.68%,在IPTG浓度0.3 mmol/L、氨苄青霉素添加量50 μg/ml时,表达效率提高了25%.结论:本研究建立的工艺操作较为简便易行,易于放大,具有较大的经济意义.     

大肠埃希菌质粒氨基糖苷类耐药基因分布及多态性研究

目的 通过大规模测序研究临床分离的大肠埃希菌的质粒基因组所携带的氨基糖苷类耐药基因分布及其多态性.方法 收集4年临床分离非重复的320株大肠埃希菌.菌株分为两个部分,碱裂解法提取全部质粒,Solexa测序获得大规模的短序列.采用比较基因组学和分子进化方法分析两个样本所含的氨基糖苷类耐药基因类型及丰度的差异,研究氨基糖苷类耐药基因存在的核苷酸多态位点.结果 测序法获得两批数据,E1短序列总数为11 077 768,可以定位到参照序列上为71 528（0.646%）.E2短序列总数为9 377 792,可以定位到参照序列上是49 944（0.532%）.两个样本中共有9个氨基糖苷类耐药基因型,strB基因最多,其次是strA、aacC2.两个样本中9个氨基糖苷类耐药基因共发现67个单核苷酸多态性（SNPs）位点,约50%为非同义突变.同一个位点的A、G二核苷酸多态现象常见.结论 此次样本中大肠埃希菌质粒上分布多种氨基糖苷类耐药基因.存在着大量的SNPs.     

健康人肠道大肠埃希菌耐药性与质粒图谱的研究

目的 研究深圳市健康人肠道大肠埃希菌携带的质粒与其耐药性之间的关系.方法 分离健康人肠道大肠埃希菌,K-B法测定细菌对16种抗菌素的耐药性,分析细菌的质粒图谱,对耐药菌株进行质粒分子分型.结果 健康人肠道大肠埃希菌对四环素、萘啶酸、磺胺甲基异恶唑、氨苄西林、复方新诺明和链霉素的耐药率分别为63.33%、49.33%、40.67%、38.67%、35.33%、35.33%,全部菌株对头孢美唑和氨曲南敏感.122株菌(81.33%)耐一种以上抗菌素,88株菌(58.67%)耐2种以上抗菌素,44株菌(29.33%)耐5种以上抗菌素,2株菌耐10种抗菌素.结论 深圳市健康人肠道大肠埃希菌耐药性较严重,其耐药性与所携带质粒的数量和大小并无直接联系.     

大肠埃希菌质粒型AmpC酶基因的检测分析

目的 调查大肠埃希菌质粒型Ampc酶基因的存在状况。方法 采用MH药敏平板对40株临床分离的大肠埃希菌进行抗菌药物敏感试验和ESBLs纸片法确诊,PcR方法检测DHA和ACT-1型Ampc酶基因。结果 40株大肠埃希菌呈多重耐药,20株ESBLs阳性菌AmpCM基因阳性率90％,20株ESBLs性菌Ampc酶基因阳性率45％,40株大肠埃希菌ACT-1和DHA基因阳性率分别为57．5％,40．0％,有12株大肠埃希菌同时携带ACT-1和DHA基因。结论 临床分离的大肠埃希菌多重耐药严重,质粒型AmpC酶基因携带率高。     

细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95的构建及其在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达

目的构建细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95,并研究该质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达。方法超声粉碎细粒棘球蚴组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增Eg95抗原编码基因;克隆至原核表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-Eg95;转化大肠杆菌BL21,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行分析和鉴定。结果RT-PCR扩增出471 bp的Eg95抗原编码基因;双酶切证实Eg95抗原编码基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约42 500的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的21%;Western blot鉴定显示重组蛋白能被细粒棘球蚴感染鼠血清识别。结论成功构建了细粒棘球绦虫重组质粒pGEX-Eg95,该质粒在大肠杆菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性。     

一种高效、快速的大肠杆菌感受态细胞制备及质粒转化方法

目的：建立一种高效、快速的大肠杆菌感受态细胞制备及质粒转化的方法。方法：质粒DNA加入感受态细胞，经短暂冰浴和热休克后，直接涂布预热至37℃的平板。以大肠杆菌DH5α为受体菌，研究CaCl2溶液浓度、感受态细胞的存放时间、转化时间及转化后的培养时间等对质粒转化效率的影响。结果：以100mmol／L CaCl2溶液制备感受态细胞，冰浴转化5min，经42℃热休克作用908后直接涂平板筛选转化子，获得与常规转化方法相当的转化效率。CaCl2溶液浓度和感受态细胞的存放时间对转化效率有明显的影响，而转化时间和转化后的振荡培养时间对转化效率的影响不明显。结论：成功地建立了一种高效、快速的感受态细胞制备及质粒转化的方法。     

致病性大肠杆菌和出血性大肠杆菌的研究进展

致病性大肠杆菌(EPEC)是导致婴幼儿腹泻的主要病原菌，特别在发展中国家。近期研究表明，EPEC病原与宿主细胞的作用可视为三个阶段。第一阶段，局限性的粘附在上皮细胞；第二阶段，产生分泌蛋白：第三个阶段，紧密粘附和受体蛋白的作用。一些出血性大肠杆菌侵袭人的肠上皮细胞也靠粘附和损伤作用。     

从大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中检出质粒介导的AmpC DHA-1型β内酰胺酶基因

目的 了解产质粒介导AmpC酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的耐药性和基因型.方法 收集2002年1月-2004年5月间我院呼吸科临床标本中分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌共110株,用酶提取物三维试验检测AmpC酶;用等电聚焦电泳、耐药质粒电转化试验、聚合酶链反应(PCR)及测序确定AmpC酶基因型.结果 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中AmpC酶检出率分剐为9.30%和4.48%.药敏试验显示产酶株对头孢西丁全部耐药,对第三代头孢菌素、酶抑制剂、氨曲南、阿米卡星及环丙沙星均有不同程度耐药,对头孢吡肟及亚胺培南较敏感.7株产AmpC酶菌株中有5株通过电转化试验可将头孢西丁耐药性传递给受体菌,经PCR扩增和测序证实为质粒介导DHA-1型AmpC酶.结论 我院临床分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中已经出现产质粒介导AmpC酶菌株,其耐药性能够水平传播,给临床抗感染治疗带来重大威胁.     

大肠杆菌yigP基因启动子的定位

在已知大肠杆菌yigP基因的最小功能片段为yigPP4P2基础上,将该片段装载于无外源启动子的载体质粒上,通过功能回补yigP基因缺陷株JDP14,发现其可以代替温敏质粒,保证大肠杆菌正常生长,推断其包含完整转录单元。RTPCR结果显示该片段内部有转录产物,即yigPP4P2片段具有转录独立性。将不同长度的yigPP4P2亚片段克隆到启动子探针质粒pSPZ上,通过对重组菌进行蓝白斑筛选及β半乳糖苷酶活性测定,结果显示pP40V3Z/JM83和pP40V4Z/JM83可观测到蓝色菌斑,并检测到较弱的β半乳糖苷酶活性,由此表明大肠杆菌yigP基因启动子位于该片段上游,下游边界位于引物V4区域内。     

萝卜硫素对大肠杆菌抑菌机制的研究

目的研究萝卜硫素(SFN)对大肠杆菌的抑菌机制。方法通过电导率、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶(AKP)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)的变化检测细胞通透性改变;Bradford法、DNP法和DNS法分别检测可溶性蛋白、还原糖、丙酮酸等代谢相关物质的含量变化;4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光染色法结合电泳研究SFN对核酸的影响。结果 SFN导致大肠杆菌的离子及小分子等物质漏出;菌体对还原糖的利用下降,丙酮酸含量上升;SFN作用16h后菌体和菌液中可溶性蛋白总量分别减少了42.5%和17.6%,DNA和RNA荧光强度分别减少了34.8%和48.5%。结论 SFN通过影响细胞膜通透性、细胞物质和能量代谢以及抑制核酸和蛋白合成速率三方面共同完成抑菌功能,其中影响菌体核酸和蛋白的合成是其主要抑菌机制。