自体内皮祖细胞移植修复兔动脉内皮损伤

目的观察不同数量的内皮祖细胞移植对内膜球囊损伤血管修复的影响。方法密度梯度离心法分离兔外周血单个核细胞,以EGM-2培养基培养7天,获得兔外周血内皮祖细胞。分高细胞数量移植组(5×105个细胞)和低细胞数量移植组(2×105个细胞),将相应数量的内皮祖细胞重悬于100μL生理盐水中移植至兔内膜球囊损伤血管局部,对照组仅注入100μL生理盐水。同时用CM-DiI标记内皮祖细胞移植,进行细胞示踪。4周后,处死动物,荧光显微镜下观察CM-DiI标记细胞的分布,并测量各组内膜损伤血管再生内皮覆盖率和新生内膜增生程度。结果荧光显微镜下发现荧光标记的内皮祖细胞分布在血管的中膜层、新生内膜层和内膜表面。内皮祖细胞移植可显著促进内膜损伤血管的再内皮化,以高细胞数量移植组为著,同时内皮祖细胞移植也大大减少了新生内膜的形成。结论内皮祖细胞移植可修复内膜球囊损伤血管,高细胞数量移植有更显著的效果。     

脂蛋白(a)通过抑制内皮型一氧化氮合酶表达损伤内皮祖细胞

目的研究脂蛋白(a)[Lp(a)]是否通过抑制内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达损伤内皮祖细胞(EPC)。方法密度梯度离心结合差速贴壁法分离出人脐静脉血EPC,在EGM-2培养基中对EPC培养和诱导分化12天后,并用免疫荧光和流式细胞术鉴定。109个/L EPC种植于24孔培养板上,分别与0、10、25、50及100 mg/L Lp(a)孵育24 h进行作用量-效分析,然后EPC与10μmol/L ATP(eNOS激动剂)+50 mg/L Lp(a)处理24 h,同时设对照组。MTT法检测EPC存活率,RT-PCR和Westernblot分别检测eNOS mRNA及蛋白水平。结果 Lp(a)呈剂量依赖性降低EPC的存活率,10 mg/L Lp(a)对EPC存活率的影响不显著(P>0.05,n=3),25 mg/L Lp(a)即表现出明显的抑制作用(P<0.05,n=3),以50 mg/L Lp(a)最为显著(P<0.001,n=3);此浓度下,EPC的eNOS mRNA和蛋白水平均显著下降;10μmol/L ATP可显著拮抗Lp(a)对EPC存活的抑制作用,同时eNOS mRNA和蛋白水平均明显上调。结论 L...     

外周血内皮祖细胞数量及eNOS基因表达在动脉粥样硬化大鼠中的改变

目的:探讨外周血内皮祖细胞(EPCs)数量及动脉内皮细胞型一氧化氮合酶(eNOS)基因表达在动脉粥样硬化(AS)大鼠中的改变。方法:将70只大鼠分为3组:正常对照组20只,采用假手术+普通饲料喂养;实验对照组20只,采用假手术+高脂饲料喂养;AS组30只,采用球囊损伤主动脉内皮、维生素D33×105 U·kg-1·d-1分6次肌内注射和饲以高脂饲料喂养。90d后分别采外周血进行EPCs的分离培养,于倒置相差显微镜下计数内皮祖细胞克隆形成单位(EPC-CFU),并采用Real-time PCR法检测腹主动脉中eNOS基因的表达。结果:与正常对照组和实验对照组相比,AS组外周血EPCs数量明显减少(P<0.01),eNOS基因表达明显下调(P<0.01);EPCs数量及eNOS表达在正常对照组和实验对照组中差异无统计学意义。结论:AS时EPCs数量减少,eNOS基因表达明显下调。     

胰岛素样生长因子1通过eNOS途径调节颈动脉狭窄患者内皮祖细胞功能

目的探讨颈动脉狭窄与内皮祖细胞(EPC)的相互关系及胰岛素样生长因子1(IGF-1)对EPC的调节作用及其主要机制。方法入选脑梗死伴颈动脉狭窄患者35例为颈动脉狭窄组,同时入选健康对照者11名为对照组。根据脑血管造影结果,颈动脉狭窄组又分为轻度狭窄组、中度狭窄组、重度狭窄组。测定研究对象的血清IGF-1浓度。采用密度梯度离心法分离出单个核细胞,用内皮细胞生长培养基(EGM2)培养,双染法鉴定EPC。实验分为4组:未处理组、IGF-1组、IGF-1+氮-硝基-左旋-精氨酸甲基酯(L-NAME)组、L-NAME组,使用EGM2培养细胞2~3周,分别测定各组EPC的增殖、黏附功能。结果颈动脉狭窄程度越重,形成EPC集落数量越少(P0.05),血清IGF-1浓度也越低,并且随着狭窄程度增加,EPC增殖、黏附能力降低。功能实验显示IGF-1组EPC功能明显高于未处理组(P0.01),IGF-1+L-NAME组未见明显差异,L-NAME组低于未处理组。IGF-1组细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)明显高于未处理组,IGF-1+L-NAME组未见明显差异,L-NAME组低于未处理组。结论 EPC对颈动脉狭窄可能具有保护作用,IGF-1可能通过影响eNOS的合成增强EPC的功能。     

血管内皮细胞生长因子调动内皮祖细胞修复动脉损伤的实验研究

目的探讨血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)调动内皮祖细胞(endothelial progeni-tor cells,EPCs)修复大鼠颈总动脉损伤的作用。方法将32只大鼠切除脾脏恢复两周后随机分为两组:VEGF组和对照组,每组16只。用2F的Fogarty球囊导管损伤大鼠左颈总动脉建立动脉损伤模型。用流式细胞仪测定大鼠外周血胎儿肝脏激酶-1+(fetal liver kinase,Flk-1+)的细胞比例。动脉损伤两周后取损伤动脉段和对侧正常动脉段,采用组织学、免疫组织化学、扫描电子显微镜和图像分析技术评价各组动脉修复的效果。结果VEGF组Flk-1+的细胞比例显著高于对照组[(38.59±3.68)%vs(13.78±1.91)%,P<0.05]。两组中相同数目的外周血单个核细胞分化为EPCs的数目,VEGF组显著高于对照组[(28.25±4.23)个vs(6.88±1.34)个,P<0.05]。动脉损伤两周后,VEGF组损伤动脉的新生内膜厚度显著低于对照组[(32.38±5.58)μmvs(76.38±5.48)μm,P<0.05]。结论VEGF具有调动EPCs修复大鼠颈总动脉损伤的作用。     

流体切应力对衰老内皮祖细胞血管内皮修复能力的影响及机制研究

目的探讨体外流体切应力对老年志愿者内皮祖细胞(EPC)功能活性的影响及可能的分子机制。方法抽取老年志愿者外周血20ml,采用密度梯度离心法分离提取EPC。在体外采用生理范围(0.15mN/cm2)流体切应力处理培养后的老年志愿者EPC 24h,观察EPC体外的迁移、黏附能力的变化。通过建立裸鼠颈动脉拉脱损伤模型,观察流体切应力对老年志愿者EPC裸鼠颈动脉内皮损伤修复能力的影响。实时RT-PCR和Western blot检测EPC表面相关基因和蛋白的表达情况。结果体外切应力干预明显提高老年志愿者EPC体外的迁移、黏附能力,0.15mN/cm2体外切应力干预24h能提高EPC修复损伤血管内皮的能力[干预前:(33.1±5.9)%;干预后:(49.1±7.1)%,P0.01]。基因和蛋白水平检测显示,EPC表面的趋化生长因子受体4(CXCR4)信号通路明显上调(P0.01)。结论流体切应力干预显著改善老年志愿者EPC血管内皮损伤修复能力,其机制可能与EPC表面的CXCR4信号通路密切相关。     

内皮型一氧化氮合酶对内皮祖细胞生物学功能的影响

一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)参与调节机体多种生理活动,在心血管系统中的作用亦倍受重视.近年来,内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的又一生物学作用已引起人们的关注.本文探讨了eNOS在内皮祖细胞的动员、分化和归巢中的作用,及其促进内皮祖细胞的生物学功能.     

内皮型一氧化氮合酶对内皮祖细胞生物学功能的影响

一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)参与调节机体多种生理活动,在心血管系统中的作用亦倍受重视。近年来,内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的又一生物学作用已引起人们的关注。本文探讨了eNOS在内皮祖细胞的动员、分化和归巢中的作用,及其促进内皮祖细胞的生物学功能。     

毒死蜱下调内皮型一氧化氮合酶的表达降低了脑基底动脉内皮依赖性舒张功能

目的探讨毒死蜱对血管舒张功能的影响及其可能的机制。方法采用离体血管环灌流方法,观察不同浓度的毒死蜱预处理对新西兰兔脑基底动脉环对乙酰胆碱和硝普钠介导的舒张反应以及血管组织中一氧化氮含量的影响。同时,观察不同浓度的毒死蜱预处理对培养的人脐静脉内皮细胞培养液中一氧化氮含量和内皮型一氧化氮合酶表达的影响。结果毒死蜱(0.001~0.1 mmol/L)预处理30 min,浓度依赖性地抑制乙酰胆碱诱导的内皮依赖性舒张反应和降低了血管组中一氧化氮的含量,而对硝普钠引起的非内皮依赖性舒张反应没有影响。阿托品预处理则不影响毒死蜱的作用。毒死蜱(0.001~0.1 mmol/L)预处理30 min,浓度依赖性降低了培养液中一氧化氮的含量和内皮型一氧化氮合酶的表达。结论毒死蜱能降低血管内皮依赖性舒张反应,其机制可能与毒死蜱下调内皮型一氧化氮合酶的表达,减少一氧化氮的生成,损伤内皮细胞的功能有关。     

白藜芦醇对外周血内皮祖细胞功能的影响

目的观察不同浓度白藜芦醇对于内皮祖细胞体外功能的影响。方法密度梯度离心法获得人外周血单个核细胞,培养7 d后,采用免疫荧光和流式细胞仪进行细胞鉴定;随后加入不同浓度的白藜芦醇[0（对照）、1、5、15、60μmol/L]干预72 h,观察其对内皮祖细胞增殖、迁移和黏附能力的影响;同时采用RT-PCR和ELISA方法测定药物干预后,内皮祖细胞中内皮型一氧化氮合成酶（endothelial n itric oxide synthase,eNOS）的表达。结果与对照组相比,1μmol/L白藜芦醇促进内皮祖细胞增殖、迁移和黏附,同时上调eNOS的mRNA和蛋白水平的表达;而60μmol/L白藜芦醇抑制内皮祖细胞增殖、迁移和黏附,并且下调eNOS的mRNA和蛋白水平的表达。结论低浓度白藜芦醇可改善内皮祖细胞增殖、迁移和黏附功能,并上调eNOS表达,而高浓度白藜芦醇则抑制上述细胞功能和eNOS表达。     

改良法分离培养兔骨髓源性早晚期内皮祖细胞

目的探索简单有效分离培养兔骨髓源性内皮祖细胞的方法,并比较两种内皮祖细胞生物学性状。方法 4周龄左右的新西兰兔,于每侧胫骨取骨髓2 mL,密度梯度离心后取单个核细胞接种于培养瓶,48 h后将悬浮的细胞收集再次贴壁,血管内皮生长因子诱导其向内皮祖细胞分化。免疫细胞化学鉴定其表面标志物、免疫荧光功能学测定,对比前后两种贴壁细胞生长状况。结果早期获取的单个核细胞,半小时后就开始贴壁,3天左右即可长出长梭形的细胞,胞体较大,有血岛样克隆形成,随后培养可形成管腔样结构,10天左右即可呈漩涡状融合整个培养瓶,但这种细胞传代能力差,为早期内皮祖细胞;第2次贴壁的晚期细胞于贴壁后呈椭圆形生长,贴壁后5～7天即可出现集落,片状生长,最后呈铺路石样融合,并可连续传至10代以上,为晚期内皮祖细胞。第2次贴壁的内皮祖细胞在分化过程中明显失去CD133+,而CD34+表达有所升高,大部分第1次贴壁内皮祖细胞可以吞噬乙酰化低密度脂蛋白和荆豆凝集素l,第2次贴壁内皮祖细胞功能学鉴定结果与第1次贴壁的结果类似。结论改良后的密度梯度离心法结合差速贴壁法能有效分离培养兔骨髓源性内皮祖细胞,第2次贴壁的内皮祖细胞生长能力更强。     

高血压与内皮祖细胞

在高血压中内皮祖细胞功能受损或数量下降,其机制包括高血压对内皮祖细胞动员的抑制作用,加速其老化或凋亡,损伤血管内皮从而使内皮祖细胞需求量增加等.一些高血压治疗方式如体育锻炼、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、钙离子拮抗剂具有降压之外的改善内皮祖细胞功能或增加其数量的作用.     

氨氯地平拮抗ox-LDL损伤大鼠骨髓源性内皮祖细胞血管样结构形成及机制

目的探索氨氯地平拮抗氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)损伤大鼠骨髓源性内皮祖细胞(EPC)血管样结构形成及其作用机制。方法实验分为对照组、ox-LDL组(50 mg/L ox-LDL)和氨氯地平组(50 mg/L ox-LDL+0.5μmol/L氨氯地平)。差异贴壁法培养分离EPC,ac-LDL摄取和结合UEA-1鉴定EPC,Transwell测定细胞迁移,Matrigel法测血管生成,Western blot和RT-PCR分别检测内皮型一氧化氮合酶(e NOS)的蛋白水平和mRNA表达情况,DCFH-DA法检测活性氧(ROS)水平,Griess法测定一氧化氮(NO)含量。结果 EPC经50 mg/L的ox-LDL处理后,细胞的迁移能力下降近3倍,血管样结构形成能力明显下降,用0.5μmol/L氨氯地平干预可部分恢复EPC的迁移能力,并显著恢复EPC的血管样结构形成能力(P0.05)。机制研究发现,ox-LDL下调EPC e NOS mRNA和蛋白表达水平,显著减少NO的含量(P0.01),氨氯地平显著拮抗ox-LDL的上述作用;EPC经50 mg/L的ox-LDL处理后,细胞内ROS含量显著增加(P0.01),氨氯地平显著减少胞内ROS的水平(P0.05)。结论氨氯地平对ox-LDL损伤EPC血管样结构的形成有显著拮抗作用,其作用与上调e NOS表达和降低细胞内ROS水平有关。     

内皮祖细胞移植治疗缺血性脑血管病

一些实验研究表明，内皮祖细胞（EPC）在脑梗死后血管新生中起重要作用。EPC移植有可能为缺血性脑血管病的治疗提供一种全新的治疗策略。文章阐述了新血管形成和EPC与脑缺血的关系，并探讨了EPC移植治疗脑缺血的影响因素和应用前景。     

Concentration of Progenitor Cells Collected from Bone Marrow Fluid Using a Continuous Flow Cell Separator

Abstract: In ABO major incompatibility on bone marrow transplantation (BMT), red cells must be removed from collected marrow fluid to prevent hemolysis. We report the concentration of progenitor cells collected using a continuous flow cell separator (Cobe Spectra). The average volume of concentrated bone marrow was 132 ± 47 ml and that of red cells included was 5.1 ± 2.4 ml. The red cell removal rate was 97.6%. The recovery rate was 40.6% for total nuclear cells, 77.9% for mononuclear cells, 100% for CD34+ cells, and 93.9% for colony forming unit granulocyte‐macrophage. Eighteen patients undergoing allogeneic BMT showed no signs of fever or hemolysis during concentrated marrow fluid transfusion. The recovery rate of progenitor cells was high, indicating sufficient recovery of hemopoiesis. This technique is applicable in ABO‐incompatible BMT and in frozen‐storage stem cells.     

急性肺损伤患者骨髓内皮祖细胞生物学功能的变化及其意义

目的观察急性肺损伤患者骨髓内皮祖细胞(EPCs)生物学功能的变化。方法选择急性肺损伤患者和正常对照各20例,采用密度梯度离心法从骨髓获取单个核细胞,接种在细胞培养板内,培养7d后对贴壁细胞进行细胞鉴定和部分生物学功能检测。倒置相差显微镜下观察生长情况,采用噻唑蓝比色试验(MTT法)检测EPCs增殖能力,观察EPCs黏附能力、迁移能力和体外血管生成能力。结果急性肺损伤患者骨髓EPCs黏附细胞数增多(P<0.05),EPCs增殖能力、迁移能力、体外血管生成能力均较正常对照组增强(P<0.05)。结论急性肺损伤患者骨髓EPCs的增殖、黏附、迁移和体外血管生成能力增强。骨髓EPCs参与了急性肺损伤发生、发展,其生物学功能可作为一个生物学标志。     

血府逐瘀汤动员大鼠骨髓内皮祖细胞的实验研究

目的观察血府逐瘀汤动员大鼠骨髓内皮祖细胞迁移,参与血管新生的作用。方法SD大鼠随机分为生理盐水组（对照组）及血府逐瘀汤高、中、低剂量组,灌胃给药8d后,腹主动脉采血,分离含内皮祖细胞的单核细胞,进行细胞计数;血清中一氧化氮（NO）和血管内皮生长因子（VEGF）含量检测以及流式细胞仪分析细胞表型和细胞周期。结果虽然各组大鼠骨髓单核细胞数量、增殖能力以及VEGF受体（VEGFR）的表达无统计学意义（P〉0.05）;但药物促进NO的合成和分泌,对VEGF的影响作用正好相反,尤其中、高剂量组影响显著（P〈0.05）;且中剂量组能明显增加CD31的表达为25.20%±0.94%（P〈0.05）。结论血府逐瘀汤通过NO途径动员骨髓中内皮祖细胞释放,参与血管新生,说明药物能动员骨髓中内皮祖细胞迁移至外周血中,提高循环血中内皮祖细胞的数量。     

1型糖尿病大鼠骨髓内皮祖细胞衰老与非对称二甲基精氨酸浓度升高有关

目的研究非对称二甲基精氨酸与1型糖尿病大鼠骨髓内皮祖细胞衰老之间的关系。方法单次腹腔注射链脲佐菌素(65 mg/kg)建立1型糖尿病大鼠模型,检测血糖、骨髓内皮祖细胞衰老、血浆非对称二甲基精氨酸水平以及内皮祖细胞中二甲基精氨酸-二甲胺水解酶2和SIRT1的mRNA表达。结果与对照组比较,糖尿病大鼠血浆非对称二甲基精氨酸水平显著升高(0.67±0.06μmol/L比0.55±0.07μmol/L)、内皮祖细胞衰老率增加(39%±8%比11%±2%)、二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(0.56±0.17比1.00±0.22)和SIRT1(0.08±0.17比1.00±0.39)的mRNA表达下调。结论糖尿病大鼠内皮祖细胞衰老与非对称二甲基精氨酸水平升高有关,其机制可能涉及SIRT1/二甲基精氨酸-二甲胺水解酶2途径。     

骨髓干细胞移植再生心肌的质疑

骨髓干细胞具有多向分化潜能,可横向分化为心肌细胞,现已开展骨髓干细胞移植再生心肌治疗研究。但也有一些研究对此提出质疑,认为骨髓干细胞移植入心肌内并不能分化为心肌细胞,初步观察到的有益作用可能是促进了新生血管形成,改善心肌供血的结果。移植过程可能影响冠脉循环,而且可能具有致心律失常。     

内皮祖细胞与缺血性脑血管病的细胞治疗

内皮祖细胞(EPC)是血管内皮细胞的前体细胞,存在于骨髓、外周血和脐血中,并参与出生后的血管发生过程.内源性和外源性因素刺激可动员骨髓EPC进入外周血,参与缺血组织的血管重建和损伤血管的再内皮化过程.血液循环中的EPC数量或质量下降是缺血性卒中预后不良的重要原因之一.EPC移植有可能为缺血性脑血管病的治疗提供一种全新的治疗策略.