HCV p7蛋白反式调节基因p7TP2的克隆化及生物信息学分析

目的:克隆HCV p7蛋白反式调节未知功能新基因p7TP2,构建其真核表达载体,并应用生物信息学初步探讨其结构及功能．方法:应用PCR技术从HepG2细胞提取的 cDNA扩增p7TP2基因,选用pGEM-T载体进行TA克隆,通过PCR,限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到真核表达载体 pcDNATM3．1／myc-His A,通过PCR,限制酶切分析进行鉴定,并应用生物信息学初步分析其物理化学性质、蛋白质结构域、功能及染色体定位．结果:成功从HepG2细胞提取的cDNA中扩增出p7TP2基因,编码区为495核苷酸(nt),编码产物为164氨基酸残基(aa),经核苷酸序列数据库(GenBank)同源序列的搜寻,与已知基因序列和蛋白序列之间没有显著同源性,属于未知功能新基因,并成功进行TA克隆,酶切、测序均正确,并进一步亚克隆至pcDNATM3．1／ myc-His A真核表达载体,生物信息学分析此基因位于8q24．3,Mr17 146．5,理论pI:9．26,半衰期为30 h(体外哺乳类网状细胞),属于不稳定蛋白,疏水指数较高,含有潜在的三个螺旋区域,四个β折叠,四个蛋白激酶C磷酸化位点, 一个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,5个N-肉豆蔻酰位点,预测可能为具有不紧密的球蛋白结构,具有信号肽及两个跨膜结构域．结论:发现了HCV p7反式调节新的靶基因, 构建了pcDNATM3．1／myc-HisA真核表达载体．     

乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4基因剪切体HBeBP4A的克隆与原核表达

目的:克隆乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白未知功能新基因HBeBP4的剪切体基因HBeBP4A,构建其原核表达载体,诱导在大肠埃希菌中表达。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术及生物信息学(bioinformat-ics)技术从HepG2细胞提取的cDNA模板中扩增获得HBeBP4基因的剪切体基因HBeBP4A,选用pGEM-T-easy载体进行TA克隆,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到原核表达载体pET-32a( )中,转化进BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导HBeBP4A融合蛋白的表达,表达产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,考马斯亮蓝染色,以抗-His的单克隆抗体进行Western blotting免疫印迹分析鉴定证实表达蛋白的特异性。结果:成功扩增出HBeBP4剪切体基因HBeBP4A,并将其插入pET-32a( )原核表达载体,经BL21(DE3)受体菌转化、IPTG诱导、SDS-PAGE分析获得了HBeBP4A重组蛋白的表达,Western blotting证实了重组蛋白表达的特异性。结论:发现了乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4(HBeBP4)基因的剪切体HBeBP4A,构建了pET-32a( )-HBeBP4A原核表达载体,并利用大肠埃希菌原核表达系统成功获得了pET-32a( )-HBeBP4A重组蛋白的表达。     

HBeAg真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的 克隆HBeAg基因,构建重组HBeAg真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中进行表达.方法 采用PCR法从HBeAg阳性乙型肝炎患者血清HBV DNA中扩增HBeAg基因,克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体中,构建重组pcDNA-HBeAg真核表达载体,经PCR、双酶切、测序鉴定后,将其转染入CHO细胞,G418筛选,用PCR、免疫斑点、Western Blot、免疫细胞化学方法检测HBeAg在CHO细胞中的表达.结果 成功克隆到HBeAg基因,并构建了重组pcDNA-HBeAg真核表达载体;基因测序证实克隆的HBeAg基因中共有12个位点发生单碱基置换突变(C1819G,A2007T,C2046T,C2061G,G2106A,C2109A,C2146T,T2172C,C2203T,A2235G,G2253A,C2298T),1个位点发生缺失突变(2346 del T);成熟HBeAg蛋白中149位缬氨酸(valine,V)突变为苯丙氨酸(phenylalanine,F)(V149F),在HBeAg蛋白羧基端融合有一段长11个氨基酸的多肽(RLESRGPVZTR).PCR、免疫斑点、Western Blot和免疫细胞化学方法证实重组pcDNA-HBeAg真核表达载体可在CHO细胞中表达分泌型HBeAg蛋白.结论 重组HBeAg真核表达载体的构建和表达为HBeAg的临床诊断和深入研究提供了条件.     

日本血吸虫酪氨酸羟化酶基因的克隆、真核表达及鉴定

目的扩增日本血吸虫的酪氨酸羟化酶（Schistosoma japonicum Tyrosine Hydroxylase,SjTH）编码基因,构建pcDNA3.1(+) SjTH真核表达载体,并检测其在COS 7细胞中的表达情况。方法以日本血吸虫成虫cDNA为模板,RACE PCR扩增SjTH编码基因,并与pGEM T连接进行亚克隆,双酶切后回收目的基因,并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,PCR和双酶切初步鉴定后测序,纯化无内毒素重组质粒pcDNA3.1(+) SjTH,转染入COS 7细胞,G418筛选阳性克隆,RT PCR和Western blot鉴定重组SjTH蛋白的表达。结果RACE PCR 扩增出SjTH编码基因,大小约1 392bp,经双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组真核质粒构建成功。脂质体介导无内毒重组真核质粒pcDNA3.1(+) SjTH转染入COS 7细胞,G418筛选出阳性克隆,RT PCR证实阳性单克隆细胞带有SjTH编码基因,Western blot鉴定单克隆细胞表达重组SjTH蛋白,大小约54kD。结论真核表达载体pcDNA3.1(+) SjTH构建成功,G418筛选出阳性克隆,真核表达重组SjTH蛋白,为后续研究SjTH蛋白功能奠定基础。     

人T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3基因及其融合蛋白真核表达载体的构建和生物信息学分析

目的：构建T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3基因及其融合蛋白真核表达载体,并对TIM-3基因进行生物信息学分析。方法：采用Trizol法从人外周血单个核细胞提取总mRNA,利用两步法RT-PCR技术扩增TIM-3及其胞外（结构）域基因片段和人IgG1Fc基因片段。并将他们分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,通过PCR及测序进行鉴定。序列分析后将TIM-3胞外（结构）域基因片段亚克隆到已经克隆了人IgG1Fc基因片段真核表达载体pcDAN3.1（＋）上;并通过PCR及双酶切进行鉴定。应用生物信息学初步分析TIM-3基因的物理化学性质、蛋白质结构域、功能。结果：成功从PBMC中提取并逆转录的cDNA扩增出TIM-3及其胞外（结构）域基因和人IgG1Fc基因;经PCR、酶切鉴定、测序分析表明它们与GenBank提供的序列信息完全相同。生物信息学分析结果表明TIM-3蛋白为稳定亲水性蛋白,有1个跨膜螺旋结构,相对分子量是33.4KD,等电点pI为5.54。该蛋白含约32.56%的α-螺旋,8.27%的延伸链,49.17%的不规则卷曲,1段21个氨基酸组成的信号肽。TIM-3蛋白亚细胞定位于内质网、高尔基体、液泡、细胞膜上。功能分析预测TIM-3蛋白具有受体和信号转导功能。结论：成功构建TIM-3基因及其融合蛋白真核表达载体,并利用生物分析软件对其进行生物信息学分析。了解TIM-3基因的性质特征,为进一步研究该基因奠定基础。     

人硫氧还蛋白基因分子克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人硫氧还蛋白（hTRX）cDNA序列并进行真核表达载体的构建。方法应用RT-PCR技术,以胎肝组织细胞总RNA为模板,扩增出hTRX成熟蛋白的cDNA基因,并克隆至pUCm-T载体中;经PCR和测序鉴定正确后,再构建重组真核表达载体pcDNA3.0-hTRX,采用PCR、双酶切和基因测序鉴定。结果将所得序列与GenBank（J04026）提供的序列比较,其酶活性中心（Trp-Cys-Gly-Pro-Cys）和基序与已知序列一致;PCR、酶切及测序鉴定表明真核表达载体构建正确。结论成功克隆编码hTRX成熟蛋白的cDNA基因,并构建其真核表达载体pcDNA3.0-hTRX。     

MMP-9反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建MMP-9反义RNA真核表达载体。方法提取胃癌组织总RNA,按照GenBank中检索的MMP-9基因cDNA序列,设计并合成反义MMP-9基因片段引物．进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)．先将扩增产物克隆至pGEM—T载体,再将其反向亚克隆到真核表达质粒pcDNA3．1中．然后对阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析。结果PCR扩增出的反义片段与预期长度相符。构建的MMP-9反义RNA表达质粒pcDNA3．1-MMP-9分别作PCR及双酶切(BamHⅠ和HindⅡ)鉴定．证实其中有目的片段完整插入．插入片段测序结果与反义MMP-9序列设计完全一致。结论成功构建了MMP-9反义RNA真核表达载体pcDNA3．1-MMP-9,为进一步研究MMP-9蛋白分子的生物学功能和以MMP-9为靶点的恶性肿瘤的基因治疗研究奠定了基础。     

Ⅱ型胶原蛋白基因cDNA序列分析及其真核表达载体的构建

目的构建人Ⅱ型胶原蛋白(hCⅡ)基因真核表达载体PcDNA3.1(+)/hCⅡ。方法提取患者关节软骨组织总RNA,应用RT-PCR方法扩增出CⅡ基因片段,测序鉴定正确后,插入真核表达载体PcDNA3.1(+)中构建hCⅡ基因真核表达载体PcDNA3.1(+)/hCⅡ,并进行PCR鉴定、酶切鉴定和序列分析。结果 PCR鉴定、酶切鉴定和序列分析表明CⅡ成功插入表达载体PcDNA3.1(+)。结论本研究成功构建了hCⅡ基因真核表达载体PcDNA3.1(+)/hCⅡ。     

构建不同筛选特性的HBV X基因真核表达载体

目的:构建不同筛选特性的两个HBV X基因真核表达载体.方法:从质粒pEcob6中PCR扩增HBV X全基因,利用pCEP4和pcDNA3.1( )两者多克隆位点的特点,选用pGEM(R)-T Easy Vector构建中间载体pEasy-X,分别酶切后连接特异性片段构建载体pCEP4-X和pcDNA3.1( )-X.结果:从质粒pEcob6成功PCR扩增出HBV X全基因并克隆至质粒pEasy-X,酶切、PCR及测序均证实真核表达载体质粒pCEP4-X和pcDNA3.1( )-X构建成功.结论:具有不同筛选特性的两个HBVX基因真核表达载体业已成功构建.     

尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛fimH基因真核表达载体pcDNA3.0-fimH的构建及鉴定

目的构建尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛的fimH基因真核表达载体,为尿路致病性大肠埃希菌的核酸疫苗研制奠定基础。方法通过PCR扩增尿路致病性大肠埃希菌临床分离株的fimH全基因序列,克隆至pMD19-T载体,PCR、酶切及测序鉴定后,将fimH基因片段克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-fimH重组质粒,并进行PCR和酶切鉴定。结果 PCR扩增尿路致病性大肠埃希菌fimH基因片段为910 bp;构建的pcDNA3.0-fimH重组质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,产生1个与fimH基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-fimH重组质粒的大片段,表明fimH基因已成功插入pcDNA3.0质粒中。结论成功构建尿路致病性大肠埃希菌fimH基因真核表达载体pcDNA3.0-fimH。     

HCV p7蛋白反式调节新基因3及其剪切体克隆化和生物信息学分析

目的:筛选HCV p7病毒蛋白反式调节的新靶基因p7TP3,克隆p7TP3基因及其不同剪切体基因序列,并进行功能分析,探讨丙型肝炎病毒(HCV)p7病毒蛋白在HCV致病过程中的作用．方法:依据我们构建的真核表达载体pcDNA 3．1(-)-p7转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总RNA,逆转录为cDNA后进行基因表达谱芯片分析,利用生物信息学技术获得新基因 p7TP3及其可变剪切体的编码序列,设计特异性引物,并对其进行克隆化研究. 结果:经测序鉴定获得新基因p7TP3的编码序列,并发现了p7TP3的不同剪切体,对 D7TP3基因组进行分析,获得剪切体的编码序列,并进行了克隆化研究及生物信息学分析．p7TP3(416 bp)编码蛋白质序列比 p7TP3(477 bp)少TQNTDVYPGLAVFFQNAL IFFSTLIY 26个氨基酸残基,其余序列相同．结论:HCV p7蛋白是一种典型的病毒基因组编码的具有反式调节作用的蛋白．利用分子生物学技术与生物信息学分析,发现并鉴定了HCV p7TP3反式调节作用的新的靶基因 p7TP3及其剪切体,为阐明HCV p7蛋白的反式调节作用及其机制开辟了新的研究方向．     

基因表达谱芯片技术筛选XTP4基因转染细胞差异表达基因

目的 应用基因芯片技术,检测乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)反式激活基因XTP4的表达对肝母细胞瘤细胞系HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明XTP4蛋白可能的分子生物学功能。方法 设计并合成XTP4基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增XTP4基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的XTP4编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-XTP4。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误。提取高质量的mRNA,逆转录为cDNA,进行cDNA芯片分析。在1152个基因表达谱的筛选中,发现有21个基因表达水平显著上调,38个基因表达水平显著下调。结论 应用基因表达谱芯片成功筛选了XTP4转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明XTP4蛋白可能的生物学功能提供依据。     

人HNF4α基因真核表达载体的构建与鉴定*

目的体外构建人肝细胞核因子4α（HNF4α）基因真核表达载体,并初步鉴定其在HepG2细胞的表达。方法从肝癌手术患者获得肝组织,分离得到肝组织总RNA,将其逆转录合成cDNA,经特异性引物扩增HNF4α基因片段,将其定向连接到pcDNA3.1(+）真核表达载体,经抗生素筛选后,酶切及测序鉴定其序列正确。提取质粒,转染HepG2细胞,48 h后裂解细胞,应用抗HNF4α行Western blot检测目的蛋白。结果从临床肝癌患者肝组织中成功分离得到总RNA,扩增出HNF4α基因,经筛选、酶切鉴定和测序,确认pcDNA3.1-4α真核表达载体构建成功。在转染HepG2细胞48 h后,检测显示53 kDa位置有明显融合蛋白条带。结论我们成功构建了HNF4α基因真核表达载体,体外转染HepG2细胞成功表达HNF4α蛋白,为后续研究奠定了基础。     

日本血吸虫再感染相关蛋白基因的克隆和原核表达

目的　从日本血吸虫 (S .japonicum )尾蚴文库扩增S .japonicum再感染相关蛋白 (RIRP)基因 ,进行克隆并原核表达出RIRP ,为进一步的功能研究奠定基础。　方法　根据已登陆的S .japonicum成虫期RIRP基因的序列设计两条特异引物 ,以S .japonicum尾蚴cDNA文库为模板扩增RIRP基因cDNA ,将该基因的cDNA克隆入原核表达载体 pGEX 4T 1和真核载体 pcD NA3 .1。转化的克隆通过氨苄青霉素的筛选、PCR扩增、双酶切和最后的测序鉴定。重组的 pGEX 4T 1/RIRP在大肠埃希菌BL2 1(DE3 )中进行表达。SDS PAGE鉴定其在大肠埃希菌中的表达情况和分子质量。用抗 2 6kuGST单抗作western杂交进一步鉴定融合蛋白的表达。　结果　从S .japonicum尾蚴文库中扩增出一条长为 462bp的cDNA片段 ,经测序证实其为RIRP基因的全长cDNA。它编码含 15 3个氨基酸的蛋白质—RIRP ,预测其分子质量单位为 17.5 45ku。RIRPcDNA已被成功克隆入 pGEX 4T 1和pcDNA3 .1载体 ,大肠埃希菌BL2 1(DE3 )编码一个约 17ku的蛋白质。　结论　RIRP基因首次从S .japonicum尾蚴文库中扩增出来 ,并成功构建了原核和真核表达载体 ,而且 ,它首次由大肠埃希菌表达 ,表达蛋白的分子质量单位约 17ku。     

La蛋白结合位点缺失的HBeAg mRNA在细胞内的稳定性

目的观察乙型肝炎病毒e抗原mRNA（HBeAg mRNA）上La蛋白结合位点的缺失对其细胞内稳定性的影响,从而进一步研究这个位点在乙肝病毒生命周期中的作用。方法针对HBeAg mRNA上La蛋白结合位点,在HBV DNA水平上利用PCR定点突变技术,构建突变型HBV载体,使其转录出来的HBeAg mRNA缺失La蛋白结合位点,将其命名为pHBV-mLa;应用脂质体将突变型HBV载体瞬时转染HepG2细胞,同时将转染了野生型HBV载体的细胞作为对照组;在各组中,用半定量逆转录PCR（RT-PCR）检测HBeAg mRNA,同时酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞培养上清中HBeAg。结果酶切鉴定和碱基测序证明,成功构建了La蛋白结合相关位点部分碱基缺失的突变型HBV载体—pHBV-mLa。转染后半定量RT-PCR检测发现,突变后HBeAg mRNA水平明显低于未突变的对照组,ELISA检测发现突变组中HBeAg表达下调。结论HBV-DNA上引入的突变可以破坏HBeAg mR-NA上La蛋白结合位点,影响HBeAg mRNA在细胞内的稳定性。HBeAg mRNA上La蛋白结合位点对乙肝病毒生命周期至关重要。     

乙型肝炎病毒e抗原与核心抗原调节靶基因的比较

目的利用基因表达谱芯片技术筛选、比较乙型肝炎病毒e抗原和核心抗原调节靶基因。方法利用分子生物学技术和生物信息学技术相结合,克隆HBeAg和HBcAg的编码基因,常规分子生物学技术构建相应的真核细胞表达载体pcDNA3.1-HBeAg和pcDNA3.1-HBcAg脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,利用基因表达谱芯片技术筛选转染细胞的差异表达cDNA的类型。结果对于2个基因转染细胞系差异表达基因谱的分析,HBeAg和HBcAg共同上调的基因1条;HBeAg和HBcAg共同下调的基因1条;未发现HBeAg上调,而HBcAg下调;或HBeAg下调,而HBcAg上调的基因类型;还有一些靶基因,或只受到HBeAg的调节,或只受到HBcAg的调节。结论应用基因表达谱芯片技术对于HBeAg和HBcAg反式调节的靶基因进行分析,可以发现HBeAg和HBcAg可引起体内多个系统相关的基因表达改变,两者在体内所调节的基因种类方面还有很大差异。     

人促血管生成素-2基因真核表达载体的构建及测序分析

目的克隆促血管生成素-2（Ang-2）基因,构建携带Ang-2基因的真核表达质粒peDNA3．1-HA2-Ang-2,鉴定并分析其基因序列。方法从人胎盘组织中提取组织总RNA,用RT-PCR方法扩增出Ang-2基因的全长eDNA,并克隆于含有HA2-标签（tag）的真核表达载体peDNA3．1上,酶切鉴定,质粒双向测序鉴定克隆的Ang-2基因。结果扩增出人Ang-2基因的全长eDNA,电泳结果显示扩增的Ang-2eDNA大小约1．5kb,双酶切鉴定和DNA双向测序证实获得正确的重组质粒peDNA3．1-HA2-Ang-2。结论正确克隆Ang-2基因,成功构建其真核表达质粒peDNA3．1-HA2-Ang-2,为进一步深人研究人的肿瘤血管生成机制及抗肿瘤血管生成治疗奠定了坚实的基础。     

HBV A83点变异真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

研究A83点突变的生物学意义。采用分子生物学方法，设计引入KpnⅠ和HindⅢ酶切位点的引物扩增乙型肝炎病毒（HBV）ayw亚型的PcP10标准株中的Pre-C/C片段（1814-2452），经KpnⅠ和HindⅢ双酶切后，在T4DNA连接酶的作用下连于EB病毒真核表达载体。利用定点突变技术对连接载体进行1896点的定点诱变，经错配PCR-RFLP和测序分析。确定突变的克隆，提取突变前后的质粒转染HepG2细胞。突变后在Pre-1C/C第28位氨基酸形成终止密码。HBVA83点突变真核表达载体的构建为体外研究该点突变对HBeAg表达的影响以及HBeAg阴性的乙型肝炎病毒感染的致病机理奠定基础。     

HIV-1B亚型核心蛋白gag基因真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型核心蛋白gag基因,构建真核表达载体,并在真核细胞中表达,为进一步制备自行设计的以λ噬菌体作为载体的HIV核酸疫苗奠定基础。方法以克隆好的HIV1B亚型U26942全基因质粒DNA作为模板,根据Genbank中gag基因的核苷酸序列设计引物,并在引物的5’端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点,特异性的扩增gag基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含gag编码基因的真核表达载体,并进行酶切鉴定分析pcDNA3.1(+)/gag。在脂质体介导下转染HepG2细胞,经G418压力筛选建立稳定转染gag基因的细胞系,用RT PCR及Western印迹检测其在HepG2细胞中的表达。结果重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切成5.4kb与1.5kb的片断,表明表达载体pcDNA3.1(+)中插入了gag基因片断,测序结果表明编码框正确。RT PCR及Western印迹证实稳定转染gag基因的HepG2细胞系中有该基因的表达。结论成功构建了HIV1B亚型核心蛋白gag基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/gag,并在HepG2细胞中获得稳定表达。