siRNA联合顺铂抑制骨肉瘤细胞增殖的研究

目的构建人Survivin基因的siRNA真核表达载体,探讨其对骨肉瘤细胞MG63凋亡及顺铂化疗的增敏作用。方法应用pSilencer 3.0-H1 neo,构建Survivin特异性的RNA干涉载体,转染MG63细胞,G418筛选稳定转染的细胞系。半定量PCR和免疫荧光染色分别检测Survivin mRNA与蛋白的水平变化。Annexin V法检测细胞凋亡。MTT法检测顺铂对细胞的杀伤作用。结果构建Survivin基因siRNA真核表达载体PsiS。获得了稳定转染的细胞系。与MG63、阴性对照细胞比较,MG63/PsiS生长曲线则十分平缓。MG63/PsiS细胞中Survivin的mRNA及蛋白表达明显减少。MG63/PsiS凋亡率增加为17.8%(P<0.01)。1 mg/L顺铂作用下,MG63/PsiS死亡率是其他各组的2.3倍(P<0.01)。结论特异性siRNA能够明显阻断Survivin基因的表达促进MG63细胞凋亡,提高细胞对顺铂的敏感性。     

促凋亡因子Omi/HtrA2对凋亡抑制蛋白表达及A549细胞凋亡的影响

目的观察Omi／HtrA2对凋亡抑制蛋白（XIAP）表达的影响和对肺癌A549细胞凋亡的影响。方法将构建的携带绿色荧光蛋白（GFP）和Omi／HtrA2基因的表达载体（PEGFP-N1-Omi）转染至人肺腺癌A549细胞中，用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot检测Omi／HtrA2对XIAP转录和表达的影响，流式细胞仪检测Oml／HtrA2协同顺铂作用于A549细胞后该细胞的凋亡变化。结果Omi／HtrA2基因转染组XIAP的mRNA表达水平下降37％（P〈0．05），XIAP的蛋白表达水平下降69％（P〈0．05），顺铂诱导后，基因转染组细胞凋亡率为（36．00±1．95）％，显著高于对照组的细胞凋亡率（17．00±1．12）％（P〈0．05）。结论Omi／HtrA2通过抑制XIAP的抗凋亡作用可协同顺铂促进A549细胞凋亡。     

顺铂联合唑来膦酸对肺癌A549细胞增殖的影响及其机制

目的 观察顺铂联合唑来膦酸对肺癌A-549细胞增殖的影响并探讨其作用机制.方法 以噻唑蓝(MTT)比色法观察顺铂联合唑来膦酸对A549细胞增殖的影响,以Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测DNA损伤检查点蛋白调节因子1(MDC1)mRNA的表达.结果 顺铂联合唑来膦酸对A549细胞增殖的抑制率(39.16±4.94)％高于顺铂(16.87±2.50)％、唑来膦酸(19.66±4.57)％;联合用药诱导A549细胞的凋亡率(32.30±0.50)％较顺铂(23.90±2.46)％、唑来膦酸(18.87±3.04)％上升;联合用药后A549细胞MDC1 mRNA的相对表达水平(0.134 ±0.037)较顺铂(0.356±0.033)、唑来膦酸(0.208 ±0.040)下降,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 顺铂、唑来膦酸可抑制肺癌A549细胞的增殖,诱导其凋亡;顺铂联合唑来膦酸抑制A549细胞的增殖具有协同作用;其协同作用可能与下调MDCl mRNA表达有关.     

siRNA沉默survivin基因对肺癌细胞凋亡的影响

目的观察siRNA（Small interference RNA,siRNA）介导survivin基因对肺癌细胞凋亡作用。方法设计、合成针对survivin的siRNA并构建相应载体,转染对数生长期肺癌细胞A549,对比阴性对照组和空白对照组;半定量RT-PCR检测survivin mRNA的表达,MTT法检测细胞生长,流式细胞仪检测肺癌细胞的凋亡。结果转染siRNA组survivin mRNA表达明显低于阴性对照组和空白对照组（P〈0.05）。MTT法检测各组细胞生长曲线阴性对照组与空白对照组相比,转染后24,48,96小时及1周时细胞生长未受影响,siRNA组在转染后24,48小时细胞生长未受明显影响,而96小时及一周时明显抑制。转染siRNA组的细胞的凋亡率与阴性对照组与空白对照组相比显著增加（14.94%±1.60%vs 3.23%±0.46%,4.22%±0.34%,P〈0.05）。结论本实验提示siRNA沉默survivin基因能促进肺癌细胞的凋亡,survivin siRNA基因治疗有可能成为肺癌治疗的新靶点。     

靶向Survivin的小分子干扰RNA对骨肉瘤细胞的体内外抑制作用

目的 观察靶向Survivin基因的小分子干扰RNA(siRNA)表达载体对人骨肉瘤细胞MG-63的体内外抑制作用.方法 体外构建Survivin siRNA表达载体pSilence2.1-neo-Survivin,转染骨肉瘤细胞株MG-63、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组织化学(SP)法检测转染前后Survivin mRNA及蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞周期分布,吖啶橙荧光染色法观察细胞凋亡,建立裸鼠移植瘤模型,记录瘤体形成时间及肿瘤生长.结果 转染后MG-63细胞Survivin基因mRNA水平和蛋白表达显著下降,转染后mRAN表达抑制率为85.08%,增殖指数为空白组的28.20%;细胞周期分析显示:shRNA组G0/G1期细胞明显增多,而G2/M期、S期细胞数目减少;吖啶橙染色显示转染组细胞出现明显核碎裂等凋亡改变,转染组凋亡率为24.54%;稳定转染组细胞裸鼠体内致瘤能力降低,转染组成瘤时间为(13.2±2.0)d,空白组为(6.5±1.6)d,两者比较差异有统计学意义(P＜0.01).4周时同空白组相比转染组瘤体体积小62.89%(P＜0.01),重量轻59.07%(P＜0.01).结论 靶向Survivin基因的siRNA表达载体可以显著抑制骨肉瘤细胞MG-63增殖,促进细胞凋亡;明显抑制人骨肉瘤细胞的致瘤活性及裸鼠移植瘤的生长.     

小干扰RNA对肾癌786-O细胞Survivin表达及其增殖的抑制作用

目的 观察小分子干扰RNA(siRNA)对人肾癌细胞Survivin基因表达及其增殖、凋亡的影响.方法 设计、合成1对Survivin编码基因序列特异的siRNA,用脂质体包裹转染人肾癌786-O细胞,分不同浓度组(10、50、100 nmol/L),采用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot技术检测Survivin mRNA及蛋白表达,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖,免疫组织化学TUNEL法榆测细胞凋亡.结果 Survivin siRNA能有效下调Survivin基因表达水平,抑制了细胞生长,促进其凋亡.并呈剂量依赖性(3组的mRNA 88.3%、62.4%、43.8%,蛋白87.7%、62.4%、46.5%,增殖抑制率11.6%、41.2%、57.5%,凋亡率14.2%、29.4%、38.1%),差异有统计学意义(P<0.05).结论 Survivin基因siRNA能抑制人肾癌786-O细胞Survivin基因表达,进而抑制其增殖,促进其凋亡.     

小干扰RNA对肾癌786-O细胞Survivin表达及其增殖的抑制作用

目的 观察小分子干扰RNA(siRNA)对人肾癌细胞Survivin基因表达及其增殖、凋亡的影响.方法 设计、合成1对Survivin编码基因序列特异的siRNA,用脂质体包裹转染人肾癌786-O细胞,分不同浓度组(10、50、100 nmol/L),采用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot技术检测Survivin mRNA及蛋白表达,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖,免疫组织化学TUNEL法榆测细胞凋亡.结果 Survivin siRNA能有效下调Survivin基因表达水平,抑制了细胞生长,促进其凋亡.并呈剂量依赖性(3组的mRNA 88.3%、62.4%、43.8%,蛋白87.7%、62.4%、46.5%,增殖抑制率11.6%、41.2%、57.5%,凋亡率14.2%、29.4%、38.1%),差异有统计学意义(P<0.05).结论 Survivin基因siRNA能抑制人肾癌786-O细胞Survivin基因表达,进而抑制其增殖,促进其凋亡.     

小干扰RNA对肾癌786-O细胞Survivin表达及其增殖的抑制作用

目的 观察小分子干扰RNA(siRNA)对人肾癌细胞Survivin基因表达及其增殖、凋亡的影响.方法 设计、合成1对Survivin编码基因序列特异的siRNA,用脂质体包裹转染人肾癌786-O细胞,分不同浓度组(10、50、100 nmol/L),采用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot技术检测Survivin mRNA及蛋白表达,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖,免疫组织化学TUNEL法榆测细胞凋亡.结果 Survivin siRNA能有效下调Survivin基因表达水平,抑制了细胞生长,促进其凋亡.并呈剂量依赖性(3组的mRNA 88.3%、62.4%、43.8%,蛋白87.7%、62.4%、46.5%,增殖抑制率11.6%、41.2%、57.5%,凋亡率14.2%、29.4%、38.1%),差异有统计学意义(P<0.05).结论 Survivin基因siRNA能抑制人肾癌786-O细胞Survivin基因表达,进而抑制其增殖,促进其凋亡.     

靶向Survivin的siRNA联合吉西他滨抑制胰腺癌细胞增殖

目的 构建靶向Survivin基因的siRNA真核表达载体,观察其对吉西他滨化疗抑制胰腺癌Pane-1细胞增殖的影响.方法 构建靶向Survivin基因的siRNA真核表达载体psiRNA-Survivin,行酶切和测序鉴定.用重组质粒转染Pane-1细胞并筛选稳定转染的细胞株,绘制细胞生长曲线.采用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测Survivin的mRNA和蛋白表达变化.以吉西他滨分别作用于对照组和转染组Panc-1细胞24 h,噻唑蓝(MTY)比色法检测细胞的增殖,流式细胞仪检测细胞的凋亡.结果 酶切和测序鉴定表明,成功构建了psiRNA-Survivin重组质粒.重组质粒稳定转染胰腺癌细胞株后,Survivin的mRNA和蛋白表达分别下调了79.2%和83.6%(P<0.05),生长曲线明显变平缓,并能显著增强吉西他滨对Panc-1细胞的增殖抑制[(24.6±4.5)%/(38.7±5.2)%]和凋亡诱导作用[(16.7±2.5)%/(26.8±3.4)%,P<0.05).结论 构建Survivin的siRNA表达载体可明显下调Survivin的表达,抑制Panc-1细胞增殖,并能提高细胞对吉西他滨的化疗敏感性.     

血管内皮生长因子-C和人表皮因子受体2共沉默对人肺腺癌细胞生物学行为的影响

目的 观察靶向血管内皮生长因子-C(VEGF-C)、人表皮因子受体2(HER2/neu)基因的小干扰RNA(siRNA)转染对肺腺癌细胞株A549生物学行为的影响.方法 构建靶向VEGF-C、HER2/neu的siRNA表达质粒,转染A549细胞,Transwell小室检测细胞体外侵袭能力,噻唑蓝(MTY)比色法检测细胞增殖活性,流式细胞术测定凋亡率.结果 siVEGF-C组、siHER2/neu组、共转染组的细胞侵袭数分别为(42.76±2.87)、(47.10±3.63)、(40.50±3.21),显著低于阴性对照组(61.00±2.48,P＜0.01);转染48 h生长抑制率分别为(19.77±1.15)%、(22.98±2.13)%、(41.27±0.51)%,显著高于阴性对照组(4.99±0.14)%(P＜0.01);转染48 h肿瘤细胞凋亡率分别为(10.8±1.8)%、(11.7±1.5)%、(20.2±3.4)%,显著高于阴性对照组(2.6±0.7)%(P＜0.01).与单独一种siRNA转染比较,联合转染肿瘤细胞生长抑制率增加(P＜0.01),凋亡率增加(P＜0.01).结论 靶向VEGF-C、HER2/neu的siRNA转染后可以显著降低A549细胞侵袭能力,抑制增殖,诱导细胞凋亡,共转染后对增殖和凋亡影响更显著.     

Livin基因和Survivin基因联合靶向siRNA诱导结肠癌细胞凋亡的作用

目的探讨Livin基因和Survivin基因联合靶向小干扰（si）RNA对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响。方法构建Livin和Survivin联合靶向的siRNA重组表达载体并转染结肠癌细胞．通过RT—PCR和蛋白质印迹方法分别检测Livin和Survivin的表达．通过MTT法检测siRNA对细胞增殖的抑制作用．利用流式细胞仪检测处理后细胞的凋亡效应。结果经酶切鉴定和测序分析证实Livin和Survivin联合靶向的siRNA重组表达载体构建成功。这种联合靶向SiRNA对Livin mRNA及蛋白表达的抑制率分别为27．9％和22．3％．对Survivin mRNA及蛋白表达的抑制率分别为32．2％和40．9％。与对照组相比,联合靶向siRNA可降低肿瘤细胞增殖率．增加细胞凋亡率,但其细胞生长抑制作用和促细胞凋亡作用均弱于单独干扰Livin或Survivin基因．结论Livin和Survivin基因联合靶向siRNA能降低结肠癌细胞中Livin和survivin基因的表达．抑制结肠癌细胞的增殖．并诱导结肠癌细胞的凋亡．但此协同抑制作用较单独干扰Livin或survivin基因为弱。     

胆囊癌GBC-SD细胞经顺铂处理后的survivin表达及意义

目的: 探讨经顺铂（DDP）处理胆囊癌细胞后survivin表达及其与肿瘤细胞耐药之间的关系。 方法:采用MTT比色法测定胆囊癌细胞对4种化疗药物的敏感性。RT-PCR检测survivin mRNA的表达。Western blot检测survivin蛋白表达的变化。结果:GBC-SD细胞对化疗药物的敏感性从高到低依次为DDP>ADM>5-FU>MMC。化学药物处理后的第1天，3组胆囊癌细胞的survivin mRNA表达水平均降低;其中0.5μg/mL DDP＋GBC-SD组下降了10%，3μg /mL DDP＋GBC-SD组下降36%，6μg /mL DDP＋GBC-SD组下降了28%。第3天，0.5μg/mL DDP组和3μg/mL DDP组GBC-SD细胞的survivin mRNA表达与第1天比较，分别上升22%和64%，但6μg/mL DDP组仍持续降低，仅为第1天的66%。0.5μg/mL DDP组和3μg/mL DDP组作用3d后的GBC-SD细胞中survivin蛋白含量分别升高了15%和12%，而6μg/mL DDP组则下降了80%。 结论:低浓度的DDP即能诱导胆囊癌细胞内survivin的表达增加，这可能是胆囊癌细胞对化疗药物产生耐药性的因素之一。     

Survivin基因siRNA对胃癌细胞生长的抑制作用

目的构建携带沉寂Survivin基因的特异性siRNA的表达质粒，鉴定其在胃癌细胞内对Survivin基因表达的沉寂以及对肿瘤细胞生长的抑制。方法合成Survivin基因特异性siRNA，插入到表达载体pAdGFP中构建成pAdGFP—siRNA。培养人胃癌细胞SGC-7901，转染pAdGFP—siRNA，研究该载体在人胃癌细胞内对Survivin基因表达的抑制作用以及对肿瘤细胞生长的抑制作用。结果转染pAdGFP—siRNA后，胃癌细胞SGC-7901的生长受到明显抑制，抑制率为68．2％。免疫组化检查显示，特异siRNA显著降低了癌细胞Survivin基因的表达。结论siRNA技术能够沉寂Survivin基因的表达，抑制癌细胞的生长，改善治疗效果。