SIRT1基因shRNA慢病毒载体构建及干扰效应检测

背景:SIRT1基因在细胞能量代谢、凋亡及衰老过程中发挥极重要的作用,另有研究发现SIRT1可能在炎症反应方面起着调控作用。目的:构建SIRT1特异性的shRNA慢病毒载体,并初步检测其对THP-1细胞SIRT1基因的抑制效应。方法:设计SIRT1靶点特异性的寡核苷酸序列,连接到经AgeⅠ和EcoRⅠ酶切线性化的pGCSIL-GFP载体,包装293T细胞产生慢病毒,再转染THP-1细胞,通过实时荧光定量PCR实验及WesternBlot检测对SIRT1靶基因的抑制情况。结果与结论:阳性克隆PCR及测序证实SIRT1基因shRNA慢病毒载体构建成功,实时荧光定量PCR及Western Blot检测该载体在mRNA和蛋白水平能抑制THP-1细胞的SIRT1表达。     

兔膜联蛋白A1基因短发夹RNA慢病毒载体构建与RNA干扰效率的鉴定

背景:膜联蛋白A1参与细胞凋亡的调控。目的:针对兔膜联蛋白A1基因构建短发夹RNA慢病毒载体,并检测其对成骨细胞的沉默效率。方法:针对兔膜联蛋白A1基因设计RNA干扰靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与BamHI和EcoRI双酶切后的pGLV/H1/GFP载体连接成pGLV-shANXA1,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。pGLV-shANXA1和pGLV/helper-1、pGLV/helper-2、pGLV/helper-3共转染293FT细胞包装产生慢病毒颗粒LV-shANXA1,并测定其滴度,随后将LV-shANXA1感染兔成骨细胞。结果与结论:经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目标序列一致,shANXA1片段完全正确插入慢病毒载体pGLV/H1/GFP中。包装浓缩慢病毒颗粒LV-shANXA1的滴度为3.8×108TU/L。经嘌呤霉素筛选后,感染复数为50时,LV-shANXA1对成骨细胞感染效率为80%;感染复数为100时,感染效率为95%。Real-time PCR和Western blot检测显示,LV-shANXA1-901对膜联蛋白A1基因的沉默效率最高,在感染复数为50时,沉默效率可达71.2%。表明实验成功构建的兔膜联蛋白A1基因短发夹RNA慢病毒载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

Kir2ds4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

本研究旨在构建kir2ds4基因RNAi慢病毒载体。针对已经筛选确定的kff2ds4基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的OligoDNA，退火形成双链DNA，与经HpaI和XhoI酶切后的pSicoR-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白（GFP）]连接产生LV-shkir2ds4慢病毒载体，应用PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定。用LV-shkir2ds4，包装系统质粒共转染包装细胞293T细胞，产生慢病毒颗粒，以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果表明，PCR和测序结果证实成功地构建了kir2ds4shRNA的慢病毒载体LV-shkir2ds4。293T细胞测定病毒滴度为6×10^8TU／ml。结论：成功地构建了人kff2ds4基因RNAi慢病喜载体．     

慢病毒载体在RNA干扰中的应用进展

小分子RNA干扰技术是一种新兴的特异性地阻断某些基因表达的研究手段,在肿瘤、病毒感染,遗传病及其它疾病的治疗中均有广泛应用。慢病毒载体是一类来源于重组逆转录病毒的载体,由于具有可以感染非分裂期与分裂期细胞,容纳大的外源性目的基因片段,免疫反应小等特点,现已成为转移目的基因进入哺乳动物细胞的理想载体。将慢病毒载体应用于RNA干扰当中,可以特异性抑制哺乳动物的各类细胞中基因的表达,成为基因功能研究和基因治疗的有力手段。本文将试图对近期慢病毒载体在RNA干扰当中的应用的最新进展进行综述。     

Tet-on调控的人HOXB4慢病毒载体构建

目的构建Tet-on调控的人HOXB4慢病毒载体,为体外扩增造血干细胞并保持其干细胞特性提供实验材料基础。方法应用PCR技术从质粒TAT-HA-HOXB4-Full中扩增编码人HOXB4的cDNA,用限制性内切酶EcoRI分别酶切HOXB4基因片段和带有Tet-on开关的可调控慢病毒载体,经T4DNA连接酶连接获得慢病毒载体Teto-Fuw-hHOXB4。对构建的HOXB4慢病毒载体进行酶切片段凝胶电泳及DNA测序分析。结果酶切片段电泳分析和DNA测序分析证明Tet-on调控的人HOXB4慢病毒载体构建成功。结论正确构建了Tet-on调控的人HOXB4慢病毒载体,为后续的体外扩增造血干细胞及相关研究提供材料。     

小鼠CDK4基因RNAi慢病毒载体的构建及体外研究

目的:探讨CDK4在神经系统变性疾病中的作用,并构建携带小鼠CDK4-siRNA的慢病毒载体进行体外研究。方法:设计3个CDK4-siRNA序列和1个无关对照序列,化学合成后退火形成双链,克隆到酶切的pSIH1-H1-copGFP siRNA载体。重组质粒经PCR和测序鉴定后,脂质体介导下转染BV-2细胞,Western blot检测CDK4的表达,筛选出干扰效果最佳的pSIH1-siRNA2。将对照序列和pSIH-siRNA2分别与慢病毒包装质粒共转染293T细胞生成病毒,收集病毒上清并浓缩,测定浓度。结果:慢病毒感染BV-2细胞后可表达GFP,RT-PCR和Western blot检测CDK4的表达明显下降。结论:成功构建携带CDK4-siRNA的慢病毒载体,体外研究显示其能明显下调CDK4的表达。     

慢病毒载体及其在RNA干扰技术中的应用与发展

慢病毒载体是一类逆转录病毒载体,以其转染效率高,可感染分裂期和非分裂期细胞,可容纳较大的基因片段等优点,现已被作为转移目的基因的理想载体。而RNA干扰技术是近年来迅速发展起来可以特异性地剔除特定基因或者抑制特定基因表达的一种新技术,在病毒感染、心血管疾病、肿瘤等疾病的治疗中被广泛应用。通过慢病毒载体与RNA干扰技术的结合应用,有望为特定基因的功能以及相关疾病的治疗研究提供新的手段和方法。     

ALRsiRNA慢病毒载体最佳干扰序列的筛选及构建

目的筛选并构建肝再生增强因子(ALR)基因的最佳RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体,为研究ALR基因表达下调后对肝癌细胞生物学特性的影响提供依据。方法针对ALR基因序列设计并合成4个siRNA靶点,酶切连接GV118-GFP载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定;在包含ALR基因的质粒中以PCR法扩增出ALR基因,克隆至慢病毒载体GV143,构建ALR基因的过表达质粒,将RNAi重组慢病毒载体和ALR的基因表达质粒共转染293T细胞,用western blot检测其对目的基因ALR的敲减效率。结果酶切鉴定证实成功构建了ALR RNAi慢病毒载体及ALR基因过表达载体。不同浓度干扰质粒(0.4μg和0.8μg)的western blot结果显示,相较于阴性对照组,KD1组ALR蛋白的表达水平(0.51±0.02,0.36±0.09)、KD2组ALR蛋白的表达水平(0.65±0.04,0.49±0.02)、KD3组ALR蛋白的表达水平(0.62±0.07,0.52±0.02)均降低(P均0.05),而以KD1组蛋白表达量最低。结论成功筛选并构建了能有效沉默ALR基因的最佳RNAi重组慢病毒载体,为后续实验奠定基础。     

核干细胞因子RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建核干细胞因子基因RNA干扰（RNA interference,RNAi）慢病毒表达载体并对其在白血病细胞株中的干扰效果进行鉴定,为后期研究奠定基础.方法 针对核干细胞因子基因的序列设计RNAi有效靶点,合成含RNA干扰序列、Loop环、Age I和EcoR I酶切位点,以及终止信号的单链DNA oligo,经退火形成双链DNA,与双酶切线性化的带有GFP荧光标记和嘌呤霉素抗性标记的GV248慢病毒空载体进行连接产生重组慢病毒载体,转化感受态细菌,挑取重组阳性转化子进行菌落PCR反应,并对PCR阳性克隆进行测序.将重组慢病毒载体及其两种辅助包装原件载体质粒pHelper1.0和pHelper2.0共转染293T细胞进行病毒的包装,收集、浓缩病毒液后测定其滴度,并转染HL-60、NB4以及K562等三种人白血病细胞株,倒置荧光显微镜下观察其转染效率,real-time PCR检测核干细胞因子基因的敲减效率.结果 经测序证实正确构建出了核干细胞因子基因的RNAi重组慢病毒载体,包装、浓缩后其滴度为4×108 TU/ml,荧光显微镜下显示其能有效转染进入HL-60、NB4及K562等白血病细胞株中,转染效率均在80％以上;real-time PCR显示转染后核干细胞因子基因mRNA表达水平较阴性对照组显著下降（P＜0.05）,在HL-60、NB4和K562细胞中核干细胞因子基因的抑制效率分别为52.3％、80.5％、62.3％.结论 成功构建出了核干细胞因子基因的RNAi慢病毒载体,其能有效干扰人白血病细胞株HL-60、NB4及K562中的核干细胞因子基因表达.     

小鼠单核巨噬细胞Ufm1基因shRNA慢病毒载体构建及鉴定

目的 构建小鼠Ufm1基因RNA干扰慢病毒载体,并实现该基因在小鼠单核巨噬细胞系（RAW264.7）中的稳定表达抑制.方法 根据小鼠Ufm1基因设计两条RNA干扰序列,合成靶序列双链DNA,与pFU-GW-RNAi载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.pFU-GW-RNAi载体、pHelper 1.0载体及pHelper 2.0载体共转染293T细胞包装产生慢病毒颗粒,并测定其滴度,随后感染RAW264.7细胞,建立稳定转染细胞株.将RAW264.7细胞分为空白组、阴性对照组及RNA干扰慢病毒感染组,用Real-time PCR检测Ufm1基因mRNA的表达量.结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,shRNA片段完全正确插入慢病毒载体pFU-GW-RNAi中.在荧光显微镜下观察可见,293T细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为9×105 TU/μl.重组慢病毒感染RAW264.7后,用Real-time PCR检测到Ufm1基因mRNA的表达受到抑制.结论 成功构建了小鼠RNA干扰慢病毒载体,并能够在RAW264.7细胞中有效沉默靶基因.     

人同源盒基因HOXB4慢病毒载体的构建及其在人脐带间充质干细胞中的表达(英文)

本研究构建人同源盒基因(homeobox gene)HOXB4的慢病毒载体,探讨慢病毒介导的HOXB4感染人脐带间充质干细胞后的变化。利用PCR扩增获得HOXB4,并克隆入慢病毒穿梭载体lenti-shuttle;运用4质粒慢病毒包装系统转染HEK293T细胞,48 h收获慢病毒lenti-HOXB4,并测定慢病毒滴度;将lenti-HOXB4感染人脐带间充质干细胞,在倒置荧光显微镜下观察细胞感染效果,确定最佳的病毒感染复数(MOI);同时,利用RT-PCR、免疫荧光染色、CCK-8、流式细胞术检测HOXB4的表达情况及对细胞生长的影响。结果表明:利用四质粒共转染293T细胞,成功获得lenti-HOXB4,测定的病毒滴度为3×108TU/ml;当MOI为20时,lenti-HOXB4对人脐带间充质干细胞具有较高的转染效率,达80%以上;感染lenti-HOXB4的人脐带间充质干细胞,在mRNA和蛋白水平上均检测到了目的基因的表达,其能促进脐带间充质干细胞的增殖;流式细胞术检测结果显示,HOXB4基因并未明显影响间充质干细胞的表面标志。结论:成功获得带有HOXB4基因的慢病毒并实现在脐带间充质干细胞中表达,HOXB4基因能促进脐带间充质干细胞的大量增殖,并未明显影响脐带间充质干细胞表面标志的表达。     

小鼠Stra8基因慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的探讨GV341质粒构建小鼠Stra8基因的慢病毒表达载体的方法。方法应用PCR技术扩增目的基因,将扩增产物插入慢病毒质粒GV341,通过PCR筛选及测序对阳性克隆进行鉴定。将慢病毒表达载体转染至293T细胞后,提取转染细胞的总蛋白,用Western Blot法检测细胞中Stra8蛋白的表达情况。结果成功构建了GV341-Stra8慢病毒表达载体。结论 Stra8慢病毒表达载体的构建为体外研究Stra8基因的功能奠定了基础。     

携带CXCR4基因慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的体外实验

背景：间充质干细胞在体内归巢主要调控因子是CXCR4,如何提高干细胞自身CXCR4的表达量是调节干细胞体内靶器官归巢能力的关键。
　　目的：构建CXCR4或GFP基因慢病毒表达载体,并观察其对骨髓间充质干细胞自身生长特性及分泌功能的影响。
　　方法：骨髓间充质干细胞应用慢病毒载体转染系统转染CXCR4基因达到过表达,同时单独转GFP基因作为对照。通过荧光显微镜、RT-PCR、免疫蛋白印迹方法验证病毒转染效率;流式细胞技术测定骨髓间充质干细胞的增殖、凋亡情况;Western Blot法测定间充质干细胞培养基上清中分泌蛋白及细胞因子变化。
　　结果与结论：慢病毒转染系统可以安全、有效地转染CXCR4基因或GFP基因到骨髓间充质干细胞。流式细胞仪检测显示过表达CXCR4的骨髓间充质干细胞增殖能力、生存能力加强,凋亡细胞减少(P<0.05);细胞上清蛋白分析提示过表达CXCR4后,骨髓间充质干细胞培养上清内出现很多的蛋白因子升高(P<0.05),其中大多数对细胞自身复制及免疫调节有益。结果表明慢病毒转染是一种安全高效的基因修饰手段,可以通过CXCR4基因修饰的方法提高骨髓间充质干细胞的生存能力、降低凋亡率,调节细胞保护性因子及免疫调节因子的分泌功能。     

慢病毒感染稳定敲减eIF4E基因的鼻咽癌CNE2细胞系的建立

目的构建稳定干扰真核起始因子4E(eIF4E)基因的鼻咽癌CNE2细胞系。方法设计针对eIF4E基因mRNA序列的RNA干扰序列,以慢病毒载体pGC-LV为基础构建感染体系。慢病毒感染CNE2细胞后,经嘌呤霉素压力筛选稳定敲减eIF4E基因的CNE2细胞株。采用定量聚合酶链反应和免疫印迹法检测eIF4EmRNA和蛋白的表达水平;采用细胞增殖和迁徙实验验证eIF4E敲减对CNE2细胞的影响。结果成功构建并筛选获得带有eIF4E特异性短发夹RNA的慢病毒颗粒;将慢病毒颗粒转入CNE2细胞,经抗菌药物压力筛选获得稳定敲减eIF4E基因的CNE2细胞(CNE2siEp)及阴性对照细胞(CNE2siNC)。与CNE2siNC细胞相比,CNE2siEp细胞eIF4EmRNA表达水平下调76.0%,蛋白表达水平下调50.0%,细胞增殖活性下调85.0%,运动活性下调59.0%。结论成功构建稳定敲减eIF4E的CNE2细胞系,其eIF4E基因表达水平与功能明显受抑。     

靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体质粒，为利用RNA干扰技术探索HIWI基因的作用的研究做准备。方法根据HIWI mRNA序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段，退火形成双链并连接入pGenesil-2载体，并进行酶切鉴定和测序。结果酶切证明构建的shRNA已插入载体中，经测序证明与设计相同。结论成功构靶向HIWI基因的shRNA真核表达载体，为进一步研究HIWI基因在干细胞和肿瘤细胞中的作用机制及后续的体内外RNAi实验研究奠定了基础。     

靶向AATF基因shRNA表达载体的构建及其稳定表达的白血病U937细胞系的建立

本研究旨在构建靶向AATF基因的短发夹RNA（shRNA）真核表达载体,获得干扰质粒稳定转染的人白血病U937细胞系。根据GenBank数据库提供的AATF mRNA序列,以228～249、303～324、443～464位序列作为RNA干扰位点,排除同源可能,合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆至经BamHⅠ、HindⅢ双酶切线性化的pSilencer 3.1人H1启动子干扰载体中,利用测序鉴定所构建的重组载体是否正确,经电穿孔将3个重组载体（pSA-1、pSA-2、pSA-3）转染人白血病U937细胞系,G418（500 mg/L）有限稀释法持续筛选8周后,扩增获得稳定表达的细胞系;RT-PCR、Western blot分别检测稳定转染细胞系的AATF mRNA和AATF蛋白表达。结果表明,AATF干扰序列及读码框完全正确。稳定转染细胞AATF mRNA表达下调,AATF蛋白表达量下降（P〈0.05）。结论：成功地构建AATF shRNA真核表达载体及AATF表达稳定抑制的白血病U937细胞系,为以AATF基因为靶点的人白血病进一步研究奠定了实验基础。     

HABP1基因慢病毒干扰和表达载体的构建及表达

摘要：目的：构建慢病毒介导的透明质酸结合蛋白1基因（HABP1）干扰载体及表达载体,建立HABP1降表达及过表达的稳定肾癌细胞系786-0。 方法：合成人HABP1基因短发夹RNA(shRNA)干扰序列,与慢病毒载体pLKO.1-TRC连接产生重组质粒pLKO.1-shHABP1;双酶切质粒pCDNA3.1(-)-HABP1-Flag,将目的基因片段连接到pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体上,组成重组表达载体pCDH-HABP1;酶切鉴定及DNA测序后,转染293T细胞,收集慢病毒颗粒感染786-0细胞,嘌呤霉素筛选稳定细胞系,western blot验证HABP1蛋白的表达水平。 结果：构建成干扰载体pLKO.1-shHABP1及表达载体pCDH-HABP1;与随机序列对照组比较pLKO.1-shHABP1转染的786-0细胞HABP1表达水平(0.30±0.01)明显降低(t=25.98,P<0.05),pCDH-HABP1转染786-0细胞后,HABP1的表达水平（3.20±0.40）明显升高(t=10.34,P<0.05)。 结论：成功构建HABP1基因的干扰载体及表达载体,且786-0细胞可稳定降表达及过表达HABP1。     

慢病毒介导的RNA干扰抑制PAR2表达影响结肠癌细胞SW620增殖与迁移

目的构建人蛋白酶激活受体2(protease-activated receptor 2,PAR2)RNA干扰(RNAi)的重组慢病毒表达载体,探讨PAR2在结肠癌细胞SW620增殖与迁移中的作用。方法根据PAR2基因信息,设计4条PAR2 RNAi片段及1条阴性对照片段,western blotting筛选有效干扰片段,于293T细胞进行病毒包装,采用real-time PCR及western blotting检测干扰效率。PAR2激动剂(PAR2-AP)刺激感染后的SW620细胞,通过流式细胞仪、Transwell试验分别检测细胞周期及细胞迁移能力。结果构建的PAR2-RNAi慢病毒颗粒感染SW620细胞后,PAR2 mRNA及蛋白表达均被明显抑制。与对照相比,PAR2-AP不能促进感染后的SW620细胞增殖,细胞各周期比率未见明显差异,迁移试验结果显示穿膜细胞数也未见明显增多。结论成功构建的PAR2-RNAi慢病毒颗粒能显著抑制结肠癌细胞SW620的PAR2表达,进而阻断PAR2-AP对细胞增殖与迁移的促进效应,证明PAR2在SW620细胞增殖与迁移过程中发挥重要作用。     

klf4反义基因腺病毒载体的构建和鉴定

本研究针对klf4基因,利用AdEasy腺病毒载体系统构建人klf4反义基因重组腺病毒载体。klf4基因片段反向克隆到穿梭质粒pShuttle—CMV,利用同源重组技术在大肠杆菌BJ5183内构建重组腺病毒Ad-反义klf4,酶切线性化重组载体,并在293细胞中扩增、制备重组病毒。经限制性酶切、PCR扩增和测序检测鉴定,证明Ad-反义klf4重组腺病毒基因正确插入后,将Ad-反义klf4转染人原代脐静脉内皮细胞,采用real—timePCR、Western blot方法观察其对内皮细胞中KLF4表达的抑制效果。结果表明：成功构建了重组klf4反义基因腺病毒载体,重组腺病毒可明显降低细胞内klf4mRNA和KLF4蛋白表达。结论：成功构建了Ad-反义klf4重组腺病毒载体,这为进一步研究klf4的生物学功能及应用提供物质基础。     

靶向特定细胞PI3K基因shRNA表达载体的构建及鉴定

目的 构建靶向血管平滑肌细胞和内皮细胞磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）基因的短发卡干扰RNA（short hair-pin RNA,shRNA）表达载体,研究其对上述细胞PI3K基因的靶向沉默作用,探索抑制移植血管狭窄的基因防治手段.方法 根据Genbank中大鼠PI3K p110β亚单位编码基因Pik3cb序列设计并合成两条shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链并克隆导入载体pGenesil-10,经荧光定量PCR方法筛选一条较合适的shRNA转录模板;合成血管平滑肌细胞特异性SMHC增强子/SM22α启动子序列和血管内皮细胞特异性KDR增强子/启动子序列,将该增强子/启动子片段亚克隆至pGenesil-10-Pik3cbshRNA上,构建并鉴定重组质粒载体SMHCe/SM22α p-pGenesil-10-Pik3cb-shRNA（简称SM22α e/p shRNA）和KDRe/p-pGenesil-10-Pik3 cb-shRNA（简称KDR e/p shRNA）;将重组质粒载体转染血管平滑肌细胞,分别于转染24h、48h、72 h后,采用实时荧光定量PCR检测Pik3cb基因mRNA的相对表达量.结果 荧光定量PCR检测转染Pik3cb-shRNA-1组与转染Pik3cb-shRNA-2组比较,前者细胞Pik3cb mRNA相对表达量降低更为明显,且两组均较对照组mRNA表达明显减少（P＜0.05）;酶切鉴定重组质粒载体SM22α e/p shRNA和KDR e/p shRNA构建成功;质粒转染细胞后,Pik3cb基因mRNA相对表达量SM22α e/p质粒组较阴性对照组均有所降低,且转染24h后,SM22α e/p质粒组与空白对照、CMV质粒组比较Pik3cb基因mRNA相对表达量明显降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）.结论 选择Pik3cb-shRNA-1作为转录模板,能够成功构建SM22α e/p shRNA和KDR e/p shRNA质粒载体,且特异性启动子SM22α介导的靶向大鼠Pik3cb基因的shRNA质粒载体可有效沉默靶基因在血管平滑肌细胞中的表达.