人Gfil基因克隆及重组Gfil慢病毒表达载体的构建

目的 克隆人Gill基因的全长cDNA,构建用于真核细胞表达的含有Gfil基因ORF区的重组慢病毒表达载体pLOX-Gfil,为研究Gfil基因的功能打下基础.方法 应用RT-PCR从人K562细胞系中扩增出Gfil cDNA片段·经回收纯化与pGEM-T载体连接并转化感受态菌DH5a,通过蓝白筛选酶切鉴定出阳性菌落,质粒提取,BamH I限制性内切酶酶切获得目的 基因,插入慢病毒载体pLOX中并转化感受态细菌DH5a.质粒提取后进行酶切及PCR鉴定,对阳性克隆进行DNA序列分析.结果 RT-PCR扩增获得含有约1.2 kb的DNA片段,酶切及PCR鉴定证实pLOX-Gfil含有大小正确的正向Gfil cDNA,DNA序列分析的结果 与发表于GenBank上的序列(NM005263)完全一致.结论 成功克隆人Gfil基因并构建用于真核细胞表达的重组慢病毒载体pLOX-Gfil.     

pET21b-HPV16E4重组质粒的构建及鉴定

目的 构建HPV16 E4重组表达质粒,以获得HPV16 E4活性蛋白,为进一步研究打基础.方法 从宫颈癌组织中提取DNA,用PCR方法扩增HPV16E4 DNA片段,定向克隆到原核表达载体pET21b质粒中,利用菌液PCR方法筛选重组阳性菌株.提取重组质粒,利用酶切图谱分析方法和核酸序列测定验证重组质粒pET21b-HPV16E4构建的正确性.结果 用PCR方法从宫颈癌组织中扩增出HPV16 E4片段,大小为0.3kb.从PCR筛选的重组菌株中提取重组质粒pET21b-HPV16E4,经单酶切得到5.7kb的片断,HindⅢ和BamHⅠ双酶切得到5.4kb和0.3kb两个片段,并且测序结果与已知序列相符,证实了重组质粒构建的正确性.结论 pET21b-HPV16E4重组质粒构建成功.     

pIRES2-HPV18E2-EGFP质粒重组及其在HeLa细胞中的表达

目的构建人乳头瘤病毒18型E2基因片段(HPV18E2)重组表达质粒并予以表达,为进一步研制HPV18相关疾病提供材料.方法以重组质粒(pBR322-HPV18)为模板,PCR方法扩增HPV18E2DNA片段,将HPV18E2DNA与加强绿色荧光质粒(pIRES2-EGFP)重组构建重组质粒(pIRES2-HPV18E2- EGFP).用酶切电泳及测序检查质粒重组后序列正确性.重组质粒转染Hela细胞.RT-PCR鉴定转染细胞中E2基因.结果 PCR扩增DNA片段约为1 kb,与预期结果相同.克隆重组质粒pIRES2-HPV18E2- EGFP酶切后显示的酶切图谱与预期相同,而且测序验证插入片段全序列无改变.转染并用G418筛选后,在荧光显微镜下可见绿色荧光细胞的表达.转染细胞RT-PCR出现特异性条带.结论成功构建表达HPV18 E2蛋白的靶细胞模型.     

Math1基因重组慢病毒的构建及其在293T细胞中的表达

目的 构建携带Math1基因的重组慢病毒载体,检测其滴度,检测其在293T细胞中的表达.方法 PCR扩增Math1基因,将其连入慢病毒栽体pLenti-GFP中;在感受态细胞DH5α中培养扩增,并行Math1基因的测序鉴定;将重组的慢病毒四质粒共转染293T细胞,收获并浓缩病毒;感染293T细胞和提取细胞DNA后用实时定量PCR法检测病毒滴度.用逆转录PCR和westem blot法检测Mathl基因在感染病毒的293T细胞中的表达.结果 构建的慢病毒载体pLenti-Math1-GFP经测序分析证实基因序列正确.四质粒共转染293T细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光.包装后慢病毒测定滴度约为3X10"Tu/L.逆转录PCR和Western blot法均能检测Math1基因在感染病毒的293T细胞中的表达.结论 成功构建携带Math1基因的重组慢病毒,并能在293T细胞中表达.     

耐拉米夫定乙型肝炎病毒变异株全基因组克隆及鉴定

目的:扩增并克隆耐拉米夫定乙型肝炎病毒(HBV)变异株全基因组DNA,为构建含双体HBV YMDDDNA质粒和HBV YMDD变异株细胞模型及研究药物筛选奠定基础。方法:从一名耐拉米夫定的慢性乙型肝炎病人血清中提取HBV病毒DNA,用错配PCR结合限制性片段长度多态性(RFLP)进行变异分析,然后采用PCR方法在HBV负链开环缺口处及基因组中单一酶切点(SpeⅠ)处,设计两对引物从两个方向分别扩增1.15 kb和2.05 kb的单链及双链DNA区,利用基因重组技术,将两片连接后克隆至质粒pcDNA3.1-中,再进行DNA序列测定。结果:错配PCR结合RFLP分析证实该病毒存在YVDD变异,通过两段法克隆出HBV全基因组,经序列分析所得为HBV YMDD变异株全基因组。结论:成功克隆出HBV YMDD变异株全基因组。     

PCR技术在猴免疫缺陷病毒(SIV)感染模型中的应用

目的(1)建立RT PCR方法,定性测定SIV感染猴血浆中病毒RNA,比较其与传统血浆病毒分离方法的敏感性;(2)建立DNA PCR方法,检测SIV感染猴外周血淋巴细胞(PBMCs)中的前病毒DNA。(3)检验DNA PCR和RNA PCR方法在猴SAIDS模型应用中的实用性和可操作性。方法用SIVmac251静脉感染恒河猴,定期采血,从血浆中提取病毒RNA,以RNA为模板通过RT PCR法扩增,凝胶电泳定性;从感染猴PBMC中提取带有整合的SIV前病毒DNA的细胞基因组DNA,巢式PCR扩增,凝胶电泳定性。结果DNA PCR和RNA PCR经两轮扩增后均得到一长度为477bp的特异条带,测序鉴定确为目的片段。9只实验猴感染SIV后7d,RNA PCR结果为79阳性,DNA PCR结果为100%阳性,而血浆病毒分离只有59阳性;此后一直到感染后的42d,RNA PCR和DNA PCR的结果一直为100%阳性,而血浆病毒分离阳性率在感染后35d下降到49,到42d时下降为零。结论PCR方法比病毒分离方法的敏感性高。尤其是DNA PCR,既可检测具有活跃病毒复制的受感染细胞,又可检测那些携带病毒处于转录休眠期的细胞,所以在感染的早期和中后期———血浆病毒水平较低的情况下或病毒处于潜伏感染的阶段,它作为猴艾滋病(SAIDS)模型病毒学指标之一有其必要性和重要性。这个指标的检测方法应该是较血浆病毒RNA检测更为敏感。     

骨桥蛋白基因质粒的构建及慢病毒包装的实验研究

目的:构建骨桥蛋白(OPN)基因的重组质粒,并包装慢病毒。方法:从C57BL/6野生型小鼠肾脏组织提取总RNA,逆转录为cDNA经特定引物扩增出OPN基因片段,并大量扩增,利用基因重组技术该基因片段与慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-T2A-Puro连接形成重组质粒,该重组质粒转染293T细胞进行慢病毒包装后测定滴度。结果:DNA测序证实提取的基因为OPN片段,慢病毒滴度达2.5×108 TU/ml。结论:成功包装了含有OPN基因片段的慢病毒,为进一步研究OPN对各种细胞的生物学功能的影响奠定了基础。     

大鼠Smad7基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建大鼠Smad7慢病毒载体。方法:提取大鼠大脑皮质及肾脏的总RNA,逆转录PCR扩增获得Smad7目的基因片段,EcoRI及BamHI酶切连接慢病毒载体质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP,构建融合copGFP共表达的Smad7重组质粒。转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经PCR扩增及测序鉴定正确后,Smad7重组质粒与慢病毒包装质粒共转染至包装细胞293TN,包装产生病毒液,转染H1299细胞株测定病毒滴度。结果:通过扩增获得1.3kb Smad7 cDNA片段,测序结果证实目的基因与Genebank序列完全一致,Smad7重组质粒慢病毒包装后获得Smad7慢病毒载体,病毒滴度为1.0×107ifu/ml。结论:成功构建大鼠Smad7慢病毒载体,为进一步研究Smad7基因的相关功能提供了适合的转染载体。     

癌胚抗原慢病毒表达载体的制备及鉴定

目的:构建人癌胚抗原(CEA)慢病毒表达载体,以期在哺乳动物细胞中高效、稳定表达。方法:提取CEA阳性的人结肠癌组织总RNA,逆转录获得cDNA序列,CEA全基因引物进行PCR扩增,对所扩增出的大小约2100bp的基因片段胶回收纯化,与pGEM-T Easy载体连接得到重组质粒pGEM-T-CEA。分别用XhoL和HindⅢ双酶切重组质粒pGEM-T-CEA和慢病毒载体pLentiGFP,将双粘CEA片段与羟化后的双粘线形载体pLentiGFP连接得重组载体pLentiGFP-CEA。pLentiGFP-CEA与慢病毒辅助包装载体pΔ8.2和pVSVG共转染293FT细胞,Western Blot验证CEA在转染293FT细胞中表达,72h后收集病毒上清。结果:通过PCR扩增获得了CEA基因,将CEA正向克隆到慢病毒转移质粒pLentiGFP中,并在293FT细胞中包装产生慢病毒颗粒。结论:成功构建了CEA慢病毒表达载体,为进一步从分子水平探讨CEA功能奠定了基础。     

携带全长人极低密度脂蛋白受体基因的重组腺相关病毒的构建

目的构建携带全长人极低密度脂蛋白受体(very low-density lipoprotein receptor,VLDLR)基因的重组腺相关病毒。方法通过设计含有特定酶切位点的引物,从人的骨骼肌中提取RNA,合成cDNA,扩增人VLDLR全长基因5′端约1 000 bp的DNA,并以含人VLDLR基因片段的质粒为模板,合成人VLDLR全长基因近3′端约1 600 bp的DNA,通过粘端连接将2片段连接成全长VLDLR后,再将其连接到重组腺相关病毒包装系统的特定载体raav-UF1上,用293细胞作为包装细胞,配合重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)相关质粒:辅助质粒(phelp-er)和包装质粒(Pxx2),包装大量携带人VLDLR基因的重组腺相关病毒(raav-VLDLR-UF1),以含绿色荧光蛋白(greenfluorescence protein,GFP)基因的重组腺相关病毒(raav-GFP-UF1)为对照,测定raav-VLDLR-UF1及raav-GFP-UF1的滴度。结果raav-GFP-UF1和raav-VLDLR-UF1的滴度均为4×1011pfu/ml,达到实验要求。结论成功构建携带全长人VLDLR基因的重组腺相关病毒,有望为2型糖尿病高脂血症的基因治疗提供一种新的方法。     

白血病病毒感染的SRSV/3T3细胞系DNA转化机制探讨

将SRSV/3T3细胞DNA转染NIH/3T3细胞,转染后17d,实验组出现18个集落,对照组出现4个集落。将实验组集落细胞接种于3只BALB/C裸鼠皮下,全部长成纤维肉瘤。将SRSV/3T3细胞DNA用EcoRI和BamHI酶切电泳,分别应用5种癌基因(v-myc、KJ-ras、v-src、v-sis和e-fos)作Southern印迹和分子杂交。发现SRSV/3T3细胞DNA的BamHI酶切片段与c-fos探针杂交后,在2.2～3.0 kb处出现阳性杂交带。应用c-fos单抗检测转化细胞,细胞核内呈阳性反应。表明SRSV/3T3细胞DNA含有fos样转化基因,在转化细胞内有此基因的过度表达。     

重组质粒pEGFP-C3-caveolin-1构建及在小鼠足细胞中的表达

目的:构建真核表达重组质粒pEGFP-C3-caveolin-1及稳定转染小鼠足细胞.方法:用RT-PCR法扩增小鼠肾脏caveolin-1的开放阅读框(ORF),构建TA克隆,用EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ酶切位点亚克隆至真核表达质粒pEGFP-C3中,酶切和测序鉴定.脂质体转染法转染小鼠足细胞,荧光显微镜下动态观察转...     

t-PA基因克隆及pcDNA3.1t-PA真核表达质粒的构建

目的利用基因工程技术克隆组织纤溶酶原激活物(t-PA)基因并构建一种无细胞毒性、不激活原癌基因的真核表达的pcDNA3.1t-PA质粒载体.方法采用高效Trizol试剂快速从人肺组织中提取RNA,RT-PCR获得t-PA cDNA,扩增、纯化、回收t-PA基因片段并将质粒pcDNA3.1和t-PA基因片段分别双酶切,前者纯化回收大片段,后者纯化回收1.9kb片段,再将回收的pcDNA3.1大片段与t-PA基因片段(1.9kb)重组.对重组pcDNA3.1t-PA质粒进行单酶切和双酶切鉴定,并测序.结果成功地从胎儿肺组织中克隆了t-PA基因,并构建了以pcDNA3.1为载体的真核表达质粒载体.结论含t-PA基因新型表达质粒构建的成功将为基因防治血管重建术中局部血栓形成奠定基础.     

人脑髓鞘碱性蛋白cDNA重组质粒pRK41转化及全长编码区体外扩增

作者将含人脑髓鞘碱性蛋白(MBP)编码区和3’端非翻译区(1.2kb)的重组质粒pRK41—1.2转化宿主菌E.coli JM109,用非同位素标记鼠MBP cDNA克隆片段作探针,经菌落原位杂交筛选出阳性克隆并以此为模板,采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增出含21.5kd MBP全长编码序列(600bp),又经限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ消化,电泳结果进一步证实该PCR产物的特异性,为人MBP全长编码序列。     

表达UGT1A1重组腺相关病毒载体的构建

目的 获得表达胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸酶（UGT1A1）基因；构建UGT1A1重组腺相关病毒载体，制备腺相关病毒。方法 设计、合成引物，通过逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）从HepG2细胞总RNA中扩增UGT1A1基因，最终连接于pAAV—MCS．双酶切、PCR鉴定阳性重组质粒。并在HEK293T细胞表达，制备高滴度重组腺相关病毒。结果 成功扩增了人类UGT1A1基因．构建表达UGT1A1基因重组腺相关病毒载体。并成功表达于HEK293T细胞。结论 本实验构建的人类UGT1A1重组腺相关病毒将为因UGT1A1活性不足导致的高胆红素血症的基因治疗奠定基础。     

小鼠白血病病毒感染细胞的DNA提取及其转染作用的初步研究

从感染SRS白血病病毒的SRSV/3T3细胞系提取的DNA,在体外感染小鼠NIH/3T3细胞,在第3周出现转化细胞和呈集落性生长的转化灶。将转化细胞接种SW-1近交系新生乳鼠或裸鼠(BALB/c),在局部产生纤维肉瘤。实验结果提示,在SRSV/3T3细胞的DNA中可能含有转化基因片段。     

人BPI活性片段基因真核表达载体的构建及其在COS-7 细胞中的表达

目的构建人杀菌/通透性增加蛋白(BPI)N端活性片段cDNA序列的真核表达载体并了解其在COS-7细胞中的表达. 方法提取人外周血多形核白细胞(PMN)总 RNA进行逆转录反应,经套式PCR扩增出BPI N端基因片段,将其克隆入pUC19载体中并进行酶切鉴定和序列测定,然后亚克隆入质粒pcDNA3构建真核表达载体pcDNA-BPI;重组载体通过脂质体转染 COS-7细胞,免疫荧光法鉴定BPI的表达. 结果酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有包括信号肽在内的BPI活性片段编码序列,转染实验表明重组质粒能在COS-7中表达出具有活性的 BPI片段. 结论 BPI活性片段真核表达载体构建及表达成功,为下一步BPI功能的研究奠定了基础.     

沙眼衣原体ompA基因克隆及其在真核细胞中的表达

目的克隆D型沙眼衣原体(Ct)ompA基因,构建真核表达重组质粒,转染真核细胞,为核酸疫苗的研制作准备.方法用PCR技术从D型Ct基因组DNA中扩增ompA基因片段,重组入pUCm-T克隆载体.将pUCm-T/ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,进行序列分析和酶切鉴定后,运用脂质体将重组体pcDNA3.1/ompA转染HeLa细胞,免疫组化法观察目的的基因的表达.结果从D型Ct基因组DNA中扩增出特异的ompA基因片段;序列测定证实与GenBank登陆的D型Ct一致;重组质粒pcDNA3.1/ompA在HeLa中获得表达.结论Ct ompA基因能够在体外真核细胞表达,为进一步研究Ct致病机制及DNA疫苗的研究提供理论依据.     

hKCNE5基因克隆及其重组腺病毒表达载体的构建

目的本研究旨在克隆人KCNE5(hKCNE5)基因,构建其重组腺病毒表达载体,以便研究hKCNE5基因过度表达对心房颤动的防治作用。方法首先利用PCR技术克隆hKCNE5基因,并将hKCNE5基因亚克隆到腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV;然后将该重组质粒线性化后电转化含有复制缺陷型腺病毒pAdEasy-1(Ad)的BJ5183-AD-1细胞,经过同源重组,获得复制缺陷型重组腺病毒hKCNE5-Ad,并经酶切鉴定、序列分析证实无误;接着将其转染超级感受态细胞XL10-Gold扩增、纯化、线性化,再感染AD-293细胞进行包装便可获得大量复制的重组腺病毒hKCNE5-Ad。结果hKCNE5基因被成功克隆后正确插入腺病毒载体Ad,其序列与GenBank公布的一致;hKCNE5-Ad可感染AD-293细胞并能在AD-293细胞内进行高效复制;收集含有hKCNE5-Ad的AD-293细胞悬液,-80℃保存备用。结论本研究成功地克隆了hKCNE5基因,构建了hKCNE5基因重组腺病毒表达载体,为进一步研究hKCNE5基因过度表达对心房颤动的防治作用奠定了基础。