核心蛋白聚糖协同白细胞介素24对人外周血单个核细胞作用的体外研究

目的 探讨核心蛋白聚糖(decorin,DCN)联合白细胞介素24(interleukin-24,IL-24)对人外周血单个核细胞(human peripheral blood mononuclear cell,PBMC)增殖及分泌干扰素γ(Interferon-γ,IFN-γ)的影响.方法 构建重组质粒pcDNA3.1(+)-DCN和pcDNA3.1(+)-IL-24,并利用脂质体将两种质粒转染PBMC.根据转染质粒的不同将PBMC分为空白对照组、脂质体组、空质粒组、DCN组、IL-24组、DCN与IL-24联合组.采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测PBMC的增殖,ELISA测定细胞培养上清中IFN-γ的表达,流式细胞技术检测PBMC表面程序性死亡分子1(PD-1)的表达.采用LSD-t检验进行统计学分析.结果 重组质粒pcDNA3.1(+)-IL-24构建成功.与其他组相比,DCN与IL-24联合能显著提高PBMC增殖率和IFN-γ分泌量,同时也能上调PD-1的表达水平.结论 DCN与IL-24双基因联合在体外能促进PBMC的增殖,并能增强PBMC的功能.     

人白细胞介素24真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的 构建人白细胞介素24(human interleukin-24,hIL-24)真核表达载体,并在HepG2细胞中稳定表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),从植物血凝素活化的人外周血单个核细胞中克隆得到hIL-24基因目的 片段.应用DNA重组技术将IL-24PCR产物双酶切后定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),转化大肠杆菌DHSα获得重组载体,进行PCR、酶切及测序鉴定.应用脂质体将鉴定正确的重组质粒转染至HepG2细胞,用G418筛选稳定转染细胞株.采用RT-PCR检测稳定转染细胞HepG2中IL-24 mRNA的表达.结果 通过RT-PCR获得与预期大小一致约600 bp的IL-24基因片段;重组载体pcDNA3.1(+)-IL-24经PCR、双酶切及测序证实,IL-24 eDNA片段已正确插入真核表达载体中;在稳定转染的HepG2细胞株中可见到IL-24 mRNA表达.结论 成功构建了hIL-24真核表达载体pcDNA3.1(+)-IL-24,并获得了稳定转染该重组质粒的HepG2细胞株.     

黄芩醇提液对甲型流感病毒核蛋白基因表达的影响

目的：探讨黄芩醇提液对甲型流感病毒核蛋白（NP）的作用。方法本实验设HeLa细胞组、pcDNA3.1（＋）/empty组、pcDNA3.1（＋）/NP 组、TFSB 组,其中pcDNA3.1（＋）/empty 组、pcDNA3.1（＋）/NP 组分别通过瞬时转染将重组质粒 pcDNA3.1（＋）/empty、pcDNA3.1（＋）/NP转染到HeLa细胞中;黄芩醇提液组在将重组质粒pcDNA3.1（＋）/NP转染到HeLa细胞的同时使用黄芩醇提液进行药物干预。结果与真核重组质粒pcDNA3.1（＋）/NP组比较,黄芩醇提液组NP基因起始拷贝数具有统计学意义,P＜0.05。结论黄芩醇提液能够下调甲型流感病毒NP基因的表达。     

真核表达载体介导白细胞介素24在HepG2细胞的表达及其体外抗肿瘤效应研究

目的  研究真核表达载体pcDNA3.1(+) 介导白细胞介素（interleukin, IL）24在肝癌细胞系HepG2细胞中表达的可行性,以及IL-24体外对HepG2细胞的抗瘤效应和可能机制。方法 采用脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.1(+)-IL-24 及空质粒分组转染HepG2细胞,在倒置显微镜下观察细胞形态变化。用噻唑蓝比色方法测量细胞增殖指数,流式细胞仪研究细胞早期凋亡率及其细胞周期分布。结果  IL-24 mRNA成功表达于HepG2细胞中。重组质粒转染组可见明显的凋亡细胞形态,48 h增殖抑制率（F=27.058,P<0.01）、72 h增殖抑制率( F=63.481,P<0.01)和早期细胞凋亡率( F=326.220,P<0.01)与对照组的差异均有统计学意义。细胞分布呈明显的G2/M周期阻滞。结论 真核表达载体pcDNA3.1(+)可以有效地介导IL-24在HepG2细胞的表达。IL-24对HepG2细胞有明显的增殖阻滞和凋亡诱导效应,G2/M细胞周期阻滞或许是IL-24抗瘤效应的机制。       

MDM2基因真核表达质粒构建及对人乳腺癌MCF-7细胞运动与侵袭能力的影响

目的 构建MDM2的pcDNA3.1真核表达质粒(pcDNA3.1-MDM2),并将其转染至人乳腺癌MCF-7中,考察MDM2蛋白过表达对乳腺癌转移的影响。方法 采用PCR方法体外克隆MDM2基因全序列,并将其用同源重组技术连接到真核pcDNA3.1质粒载体上,构建真核表达质粒,并进行测序鉴定,利用脂质体法转染至MCF-7细胞中。通过G418抗生素筛选出单克隆高表达细胞系,使用免疫印迹法考察MDM2蛋白表达。同时,通过划痕试验及transwell法来检测细胞的运动与侵袭能力。结果 测序结果表明pcDNA3.1-MDM2基因序列准确无误,免疫印迹法表明稳定转染细胞系构建成功,划痕试验及transwell试验表明MDM2高表达细胞系的运动与侵袭能力增加。结论 成功构建了pcDNA3.1-MDM2真核表达质粒,转染MCF-7细胞后,可稳定表达,并促进了MCF-7细胞的运动及侵袭,为研究MDM2蛋白表达对人乳腺癌转移的分子机制及作为诊疗的生物标志物奠定了基础。     

真核表达质粒pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6的构建和鉴定

目的构建含人/鼠嵌合粘附分子CD44拼接变异体6(chimeric human and mouse CD44 splice variant 6,h/mCD44v6)基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6,并进行表达。方法通过PCR扩增h/mCD44v6的全基因cDNA,将扩增的cDNA克隆至PGM-Teasy,测序后插入pcD-NA3.1(+)真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcD-NA3.1(+)-h/mCD44v6,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染B16细胞,通过RT-PCR扩增出B16/pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6细胞株中h/mCD44v6全段基因cDNA。结果经4轮PCR,成功扩增出h/mCD44v6的cD-NA全长基因,成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6,通过RT-PCR方法证实该质粒能在B16真核细胞中正确表达;建立了稳定的细胞株B16/pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6。结论成功克隆和构建了h/mCD44v6的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-h/mCD44v6,为进一步研究h/mCD44v6的新功能和免疫治疗奠定了基础。     

周期蛋白D1正反义表达质粒的构建鉴定及其对哮喘大鼠气道平滑肌增殖的影响

观察哮喘大鼠气道平滑肌周期蛋白D1的表达，并构建大鼠周期蛋白D1 (CyclinD1)正反义表达质粒，转染支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)，探讨CyclinD1在哮喘大鼠ASMC增殖过程中的影响。大鼠雾化吸入卵清蛋白建立哮喘模型，免疫荧光检测CyclinD1的表达。以气道平滑肌条总RNA为模板，通过RT-PCR获取大鼠CyclinD1全长cDNA，插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)上，构建CyclinD1正义表达质粒(pcDNA3.1-CyclinD1)和反义表达质粒(pcDNA3.1-asCyclinD1)。用脂质体介导的基因转染方法，将正反义重组体和空质粒(vector)分别转染哮喘大鼠和正常大鼠ASMC，用Western blotting方法鉴定CyclinD1基因的表达。采用流式细胞术、四甲基偶氮唑盐(MTT)法、增殖细胞核抗原(PCNA)染色等方法观察构建质粒对哮喘大鼠ASMC增殖的影响。结果表明：(1)与对照组相比，哮喘组CyclinD1表达显著增高；(2)酶切鉴定和测序分析证实，试验成功构建了CyclinD1正反义表达质粒。与转染pcDNA3.1-CyclinD1组和vector组相比，转染pcDNA3.1-asCyclinD1组大鼠ASMC中CyclinD1表达水平下降(P<0.01)；(3)与vector组S+G₂M期比例、吸收度(A)值、PCNA阳性表达率相比，转染pcDNA3.1-CyclinD1组增殖指标均明显增加(P<0.01)。转染pcDNA3.1-asCyclinD1组增殖指标均明显下降(P<0.01)。正常组大鼠转染质粒后各组间变化趋势与哮喘组一致。pcDNA3.1-CyclinD1可促进哮喘大鼠ASMC增殖，pcDNA3.1-asCyclinD1可抑制哮喘大鼠ASMC增殖，提示CyclinD1在哮喘ASMC增殖的信号转导中具有重要作用。     

线性化聚乙烯亚胺介导的高效瞬时转染条件的优化

目的优化线性化聚乙烯亚胺(polyethylenimine linear, PEI)介导的高效瞬时转染条件, 提高重组蛋白在人胚胎肾(human embryonic kidney, HEK)293F悬浮细胞中的瞬时表达效率。方法构建和鉴定重组质粒增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)/pcDNA3.1+, 通过瞬时转染的方式将质粒转入HEK293F细胞中进行表达。对转染试剂PEI与重组质粒的比例以及收获时间进行优化, 通过倒置显微镜观察、SDS-PAGE和流式细胞仪检测目标蛋白的表达量, 确定目标蛋白在HEK293F细胞中的最佳表达条件。采用优化后的条件在T500摇瓶(工作体积120 ml)中进行扩大表达。结果构建的重组质粒EGFP/pcDNA3.1+序列正确, 在重组质粒浓度为3.0 μg/ml、DNA∶PEI为2∶1、转染后24 h添加终浓度为2 mmol/L的丙戊酸钠、转染后4 d收获条件下, 目的蛋白的表达量最高。此条件也适用于放大培养体积至T500的瞬时转染。结论优化了一种快速有效的基于PEI的瞬时转染方法来高水...     

人乳腺癌转移抑制基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建乳腺癌转移抑制基因(BRMS 1)的真核表达载体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS1,为进一步研究恶性肿瘤的转移机制及基因治疗提供物质基础.方法 常规方法培养人乳腺癌细胞株MCF-7,Trizol法提取细胞株总RNA;设计一对特异性引物,经过逆转录反应获得BRMS1 cDNA的CDS序列,连接到质粒pcDNA3.1/myc-His(-)B上,构建BRMS 1的真核表达载体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS1,行基因测序鉴定正确后转染人胚肾细胞HEK-293,行Western blot验证其是否表达.结果 重组质粒pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS 1经双酶切及基因测序分析,验证了克隆的人BRMS 1基因cDNA序列与GenBank[AF159141]公布的人BRMS 1基因的cDNA序列吻合,重组体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS 1中插入的目的 基因BRMS 1是正向、单倍插入.结论 成功构建了BRMS 1真核表达载体pcDNA3.1(-)B/myc-BRMS 1,为深入研究BRMS 1基因功能和BRMS 1基因治疗奠定了物质基础.     

副黏病毒Tianjin株NP蛋白的稳定表达及其检测

目的:构建副黏病毒Tianjin株NP基因的真核表达载体,转染HEK293细胞,经G418筛选出稳定表达NP蛋白的细胞.方法:应用RT-PCR技术克隆副黏病毒Tianjin株NP基因,插入真核表达载体pcDNA3.1(+).经PCR、酶切和测序鉴定后,将构建的pcDNA3.1(+)-NP用LipofectaminenTM2000转染试剂转染HEK293细胞.应用免疫荧光法及Western Blot检测NP蛋白的瞬时和稳定表达.结果:RT-PCR扩增得到NP基因,重组质粒pcDNA3.1(+)-NP转染HEK293细胞后,经免疫荧光法检测到目的蛋白的瞬时和稳定表达.Western Blot法可见NP蛋白瞬时和稳定表达的条带.结论:副黏病毒Tianjin株NP基因在HEK293细胞可以瞬时和稳定表达,为研究副黏病毒Tianjin株NP蛋白功能与病毒致病性、宿主亲嗜性奠定了基础.     

人β_3-AR和PPAR-γ2基因真核表达载体及β_3-AR稳定表达细胞株的构建

目的构建高效表达人β3-肾上腺素受体(hβ3-AR)的真核细胞表达载体,为进一步研究hβ3-AR的功能以及与过氧化物酶体增殖体激活受体-γ2(PPAR-γ2)调控基因之间的相互影响奠定基础。方法从人肾旁脂肪组织提取总RNA,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增hPPAR-γ2、hβ3-AR cDNA全长序列。将EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后的hβ3-AR cDNA与同样进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的pcDNA3·1(+)载体连接形成重组载体pcDNA3·1(+)/hβ3-AR。将XbaⅠ和AflⅡ双酶切后的hPPAR-γ2cDNA与同样进行XbaⅠ和AflⅡ双酶切的pcDNA3·1(+)载体连接形成重组载体pcDNA3·1(+)/hPPAR-γ2。通过限制性内切酶酶切鉴定后对DNA序列进行测序,鉴定重组质粒中hβ3-AR和hPPAR-γ2基因的完整性和可靠性。运用定点诱变方法,对野生型hPPAR-γ2和hβ3-AR质粒进行定点诱变,构建Pro12Ala突变的hPPAR-γ2和Trp64Arg突变的hβ3-AR的pcDNA3·1(+)载体,电穿孔法将人hβ3-AR重组表达载体pcDNA3·1(+)/hβ3-AR(突变型和野生型)转染到SH-SY5Y细胞中,用G418筛选获取稳定转染细胞株,并用RT-PCR、Western blot方法进行鉴定。结果酶切和测序分析显示重组质粒构建正确,并在转染的SH-SY5Y细胞中获得hβ3-AR的高效表达。结论成功克隆了人PPAR-γ2、β3-AR基因全长cDNA,并成功构建了人野生型和突变型的hPPAR-γ2和hβ3-AR的真核表达重组体〔pcDNA3·1(+)/hPPAR-γ2和pcDNA3·1(+)/hβ3-AR〕。成功获得了稳定表达hβ3-AR基因的SH-SY5Y细胞株。     

凝血栓蛋白-1Ⅰ型重复序列反义核酸在血管内皮细胞中的作用研究

目的探讨TSP-1Ⅰ型重复序列反义RNA对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HU-VECs)生长活性、增殖活性影响。方法构建TSP-1Ⅰ型重复序列反义RNA真核表达载体(pcDNA3.1-/anti-TSP-1-Ⅰ),经双酶切、测序及Western blot鉴定后,转染HUVECs。采用MTT法检测转染后HUVECs活性改变,流式细胞仪检测转染后HUVECs周期变化,透射电镜观察转染后HUVECs形态学改变。结果构建的pcDNA3.1-/anti-TSP-1-Ⅰ经鉴定后转染HUVECs,MTT法检测所得HUVECs OD值较未转染组、pcDNA3.1-空载体转染组升高(均P<0.01);流式细胞仪检测结果显示:pcDNA3.1-/anti-TSP-1-Ⅰ转染HUVECs后S+G2(%)较未转染组、pcDNA3.1-空载体转染组S+G2(%)延长(均P<0.01);透射电镜结果显示:pcDNA3.1-/anti-TSP-1-Ⅰ转染后HUVECs核仁相对增多。结论TSP-1反义RNA能够促进HUVECs增殖和生长。     

密码子优化的HPV6b L1 DNA诱导BALB/c小鼠产生增强的免疫应答

目的 探讨真核细胞偏好密码子优化对人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)6b型L1 DNA诱导BALB/c小鼠特异性体液和细胞免疫应答的增强效应.方法 利用PCR从尖锐湿疣组织中扩增HPV6b L1基因,将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建野生型pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(wt)并进行鉴定;同时,对HPV6b L1基因进行真核细胞偏好密码子优化,进一步通过重叠PCR的方法获得全长基因,构建密码子优化的重组质粒pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(mod.)并进行鉴定.将6～8周龄雌性BALB/c小鼠分成4组,分别肌肉注射3次pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(mod.)、pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(wt)、pcDNA3.1(+)载体和PBS,间隔2周,每次剂量为150μg/鼠.分别于免疫前和免疫后每隔2周,收集血清,用间接ELISA检测血清igG抗体;并于第8周取小鼠脾细胞,采用乳酸脱氢酶释放法,按效应细胞与靶细胞之比(E:T)为5:1、10:1、20:1进行免疫小鼠特异性CTL杀伤活性检测.结果 成功构建了密码子优化的HPV6b L1重组质粒.小鼠免疫后血清特异性IgG抗体水平随着免疫时间和次数的增加而升高.pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(mod.)组血清IgG抗体在第8周达到高峰,与pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(wt)、载体和PBS对照组相比差异均有统计学意义(t=18.138、t=29.140、t=30.840,P值均＜0.01);而pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(wt)组与载体和PBS组比较差异也有统计学意义(t=20.072、t=22.457,P值均＜0.01).在特异性CTL杀伤实验中,当E:T分别为5:1、10:1、20:1时,pcDNA3.1(+)/HPV6bL1(mod.)组的脾细胞特异性CTL杀伤率明显高于pcDNA3.1(+)/HPV6bLl(wt)组(t=11.892、t=15.329、t=2.911,P值均＜0.05)、载体组(t=12.936、t=16.613、t=13.90l,P值均＜0.01)和PBS对照组(t=14.768、t=18.935、t=10.925,P值均＜0.01).结论 密码子优化的HPV6b L1 DNA可诱导BALB/c小鼠产生增强的特异性体液和细胞免疫应答.     

ADAM28基因对人牙囊细胞生物学特性的影响

目的探讨ADAM28基因对人牙囊细胞(HDFC)增殖、分化等生物学特性的影响及可能的作用机制。方法应用基因重组技术、细胞培养、基因转染、四唑盐比色法(MTT)、流式细胞术(FCM)和酶动力学方法探讨ADAM28基因对HDFC生物学特性的影响。结果成功构建并转染ADAM28真核质粒,系列检测显示:真核质粒转染组HDFC的增殖活性、增殖指数、ALP分泌活性明显高于空载体组及未转染组(P<0.01)。结论ADAM28可显著促进HDFC的增殖和ALP的分泌,并可能同时激活Notch信号途径,参与调控HDFC的增殖、分化和矿化。     

OX40Ig修饰大鼠脂肪间充质干细胞的实验研究

目的构建含OX40融合蛋白(OX40Ig)基因修饰的大鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)即ADSCs^OX40Ig,探讨其在体外对淋巴细胞的免疫调节作用。方法构建pcDNA3.1(+)/OX40Ig融合基因表达载体,采用核转染技术转染大鼠ADSCs,Western blot检测ADSCs中OX40Ig表达水平。ADSCs与大鼠异基因淋巴细胞共培养后分为对照组(反应细胞+刺激细胞)、ADSCs组(反应细胞+刺激细胞+ADSCs)及ADSCs^OX40Ig组(反应细胞+刺激细胞+ADSCs^OX40Ig),MTT法检测淋巴细胞增殖抑制率,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测淋巴细胞内干扰素(IFN)-γ、白细胞介素(IL)-10及转化生长因子(TGF)-βmRNA表达。结果经测序鉴定验证,pcDNA3.1(+)/OX40Ig质粒构建成功,转染ADSCs后OX40Ig蛋白呈高表达;与ADSCs组比较,ADSCs^OX40Ig显著增强异基因淋巴细胞增殖抑制率(P<0.05);对照组、ADSCs组及ADSCs<...     

miR-141-3p靶向调控FOXA1对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞增殖凋亡的影响

目的 探讨miR-141-3p对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞增殖及凋亡的影响及其分子机制.方法 以AECⅡ细胞为研究对象,分别将miR-NC、miR-141-3p mimics、si-NC、si-FOXA1、miR-141-3p mimics+pcDNA3.1、miR-141-3p mimics+pcDNA3.1-FO...     

人nanog-delta48基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的:构建pcDNA5/FRT-nanog-delta48真核表达载体,检测其在肝癌SMMC-7721细胞中的表达。方法:通过RT-PCR的方法克隆nanog基因的选择性剪接变异体nanog-delta48全长编码序列,连接入pMD18-T载体,经鉴定正确后亚克隆入pcDNA5/FRT,构建pcDNA5/FRT-nanog-delta48真核表达载体,测序无误后经脂质体介导转染到SMMC-7721细胞中,通过RT-PCR初步鉴定其在SMMC-7721细胞中的表达,并通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测转染前后的细胞增殖活力。结果:成功克隆nanog-delta48基因全长编码区,测序证明pcDNA5/FRT-nanog-delta48重组真核表达载体构建成功,使其在SMMC-7721细胞中过表达,MTT检测nanog-delta48转染入SMMC-7721细胞后,增殖能力增强。结论:剪接变异体nanog-delta48基因可能具有与nanog基因类似的活性。