利用Cre/loxP系统构建无标记的htrA基因缺失的变链菌突变株

目的:利用Cre/loxP位点特异性重组系统构建口腔变异链球菌htrA基因缺陷株,并删除选择标记。方法:PCR扩增变链菌的htrA基因片段并克隆到pGEM-T-EasyTA载体。随后插入卡那霉素(Km)抗性基因盒(loxP-Km-loxP)并替换htrA基因的部分序列,使htrA基因失活,构建出htrA基因缺失的同源重组载体pIB△htrA-Km。将该质粒电转化变链菌标准株,抗生素筛选出发生同源重组的菌株,再用含cre基因的热敏质粒pCrePA电转化,删除Km抗性基因。在限制性温度下培养,消除质粒pCrePA,获得无标记的变链菌htrA基因缺陷株,经PCR及DNA测序鉴定。结果:PCR及DNA测序分析证明htrA基因的部分序列及Km抗性基因均被删除,该部位只留下一个loxP位点。结论:成功构建出了变链菌htrA基因缺失突变株,并删除了抗性标记,为进一步研究htrA基因缺失对变链菌致龋毒力的影响奠定了基础。     

人胰高血糖素样肽-2类似物基因串联体构建及原核细胞表达

利用同尾酶法构建人胰高血糖素样肽一2类似物{PP-h[Gly2]GLP-2(1-35)}基因串联体重组质粒,实现目的基顺在大肠杆菌中高效表达.通过PCR扩增获得pp-h[Gly2]GLP-2(1-35)基因片段,利用同尾酶BamHI和BclⅠ产生相同的粘性末端,经连接、转化、筛选等操作构建其基因串联体.经DNA测序分析...     

振荡频率对变形链球菌生长及黏附的影响

目的:探讨不同频率振荡培养对变形链球菌生长及其在修复材料表面黏附的影响。方法:将热凝树脂和钴铬合金试件分别置于含变形链球菌悬液的试管内,在不同振荡频率培养24小时。测定细菌黏附量及培养液细菌量。结果:当热凝树脂组振荡频率>60 r/min,钴铬合金组振荡频率>30 r/min时,变形链球菌黏附量随振荡频率的增加而减少(P<0.05)。振荡频率<90 r/min时,培养液中细菌随振荡频率增加而增加(P<0.05);振荡频率>90 r/min时,菌量随振荡频率增加而减少(P<0.05)。结论:当达到一定频率时,振荡频率与变形链球菌生长及黏附量呈负相关关系,提示口腔功能活动有利于减少细菌的生长繁殖以及修复体表面的早期黏附,有利于减少戴用义齿后口腔继发疾患。     

动态观察变形链球菌luxS基因缺陷株生物膜的形成

目的:应用倒置荧光显微镜动态观察变形链球菌(变链菌)lngbritt C国际标准株及luxS基因缺陷株不同时期生物膜形成的差异.方法:建立以玻片为载体的生物膜模型,分别取两菌株6、18、24、48 h的生物膜,观察不同时期两菌株生物膜与玻片的黏附程度,吖啶橙(AO)荧光染色后,倒置荧光显微镜下及时观察生物膜形态及细菌之间相对活动度,并对不同时期的生物膜标本进行处理和保存,观察3个月后倒置荧光显微镜下生物膜形态有无改变.结果:应用倒置荧光显微镜可对孔板内生物膜进行直接动态观察,镜下两菌株生物膜形态多样;6 h开始出现细菌聚集成膜,18～24 h形成最佳,与玻片黏附牢固而不易冲掉;48 h标准株生物膜附着于玻片能力较缺陷株弱,易整体滑落;两菌株生物膜标本经处理保存3个月后镜下形态未发生改变.结论:变链菌标准株与luxS基因缺陷株生物膜具有不同的空间立体结构,形态多样,且在不同时期、生物膜形态、细菌间的相互作用及黏附力不同.     

Daxx-C626-740原核细胞表达载体的构建与诱导表达

目的为了研制Daxx-C抗体并观察其在宫颈癌细胞中的应用效果,构建原核表达载体pET28a／DM626-740,将其在大肠杆菌中进行诱导表达,纯化表达产物,鉴定其抗原性。方法用PRIMER5．0软件设计Daxx-C基因片段（氨基酸626-740）特异性引物,引入BamHl和SalI酶切位点,PCR扩增目的基因。将PCR产物连入载体pMD18-T,构建pMD18-T／DM626-740;然后,将BamHI和Sail酶切产物连入载体pET28a,经酶切鉴定及DNA序列分析后,构建原核表达载体pET28a／DM626-740。将其转化E．coliBL21,IPTG诱导表达,利用Ni琼脂糖凝胶层析柱纯化表达产物,Western-blot检测表达物与纯产物。结果双酶切和DNA测序结果显示,PCR正确扩增了Daxx-C基因片段并成功连入载体pET28a,构建了原核表达载体pET28a／DM626-740,该质粒在E．coli中诱导表达分子量约19kDa目的蛋白,且该蛋白能被抗Daxx抗体检出。结论构建的原核表达载体pET28a／DM626-740能在E.coli中表达目的的蛋白6His-DM626-740,并具有良好的抗原性。     

老年人牙菌斑中变形链球菌临床分离株的基因型分析

目的:探讨老年高龋和无龋人群牙菌斑中变形链球菌临床分离株基因型与龋病的关系.方法:将79例老年人分为高龋组(55例)和无龋组(24例),从两组个体口腔牙菌斑中分离鉴定出263株和102株变形链球菌(血清型c),用细菌DNA提取盒提取细菌染色体DNA,经多次实验自行确定AP-PCR反应条件,对获得的变形链球菌(血清型c)临床分离株进行遗传型分析.结果:两组同一个体临床分离株共发现了101种不同基因型.高龋组同一个体口腔中定植不同基因型葫株的数量与无龋组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论:不同个体分离出的变形链球菌菌株间具有明显的遗传多态性;个体携带不同基因型菌株的数量与其致龋性有密切关系.     

老年人牙菌斑中变形链球菌临床分离株的基因型分析

目的:探讨老年高龋和无龋人群牙菌斑中变形链球菌临床分离株基因型与龋病的关系.方法:将79例老年人分为高龋组(55例)和无龋组(24例),从两组个体口腔牙菌斑中分离鉴定出263株和102株变形链球菌(血清型c),用细菌DNA提取盒提取细菌染色体DNA,经多次实验自行确定AP-PCR反应条件,对获得的变形链球菌(血清型c)临床分离株进行遗传型分析.结果:两组同一个体临床分离株共发现了101种不同基因型.高龋组同一个体口腔中定植不同基因型葫株的数量与无龋组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论:不同个体分离出的变形链球菌菌株间具有明显的遗传多态性;个体携带不同基因型菌株的数量与其致龋性有密切关系.     

htrA、clpP基因缺失对变异链球菌生长影响的初步观察

目的:研究htrA、clpP基因缺失对变异链球菌生长情况的影响.方法:采用浊度法测定变异链球菌标准株、htrA单基因缺陷株、clpP单基因缺陷株及htrA-clpP双基因缺陷株生长6h中每小时的吸光度,采用MTT实验测定4种菌株的不同时间甲臜吸光度变化情况并探究其与平板计数活菌量之间的关系.结果:在正常营养条件下,浊度法1～6h及MTT法2、4h及6h变异链球菌标准株的生长快于htrA、htrA-clpP缺陷株(P＜0.01);浊度法1～6 h及MTT法1～3hclpP缺陷株生长快于其他两种缺陷株(P＜0.01);变异链球菌标准株、htrA缺陷株及htrA-clpP缺陷株1～4h、clpP缺陷株1～3 h甲臜吸光度与活菌量呈正相关(r分别为0.860、0.761、0.790及0.773,P＜0.05或P＜0.01).结论:htrA、clpP 单独或同时缺失可抑制变异链球菌的生长,MTF实验可在一定时间和一定菌数范围内反映标准株与3种缺陷株的活菌数.     

黑色素瘤抗原-3原核重组质粒的构建及表达

目的 构建MAGE-3目的 基因原核重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-3并检测其在大肠杆茵(E.coli)B121(DE3)中的表达.方法 RT-PCR法制备MAGE-3目的 基因,连接入原核表达载体pGEX-4T-1.构建MAGE-3目的 基因的原核重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-3并测序,将该质粒转化E.coli BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,12%SDS-PAGE和Western Blot表达鉴定.结果 扩增出349bp的MAGE-3 目的 基因并构建了原核重组表达栽体pGEX-4T-1-MAGE-3;测序结果与GenBank收录序列相一致;在E.coli BL21(DE3)中检测到含该重组表达载体的转化菌表达出分子量约35kD的融合蛋白并证实其为目的 蛋白.结论 成功构建的原核重组表达栽体pGEX-4T-1-MAGE-3及其所表达的融合蛋白,为以MAGE-3为基础的肽疫苗及特异诊断试剂的研制提供抗原打下了基础,为后续实验提供了依据.     

肿瘤—睾丸基因SSX1的原核表达载体的构建

目的：构建肿瘤-睾丸基因SSX1的原核表达载体,为进一步表达、纯化SSX1蛋白,制备肝癌疫苗奠定基础。方法：行RT-PCR从肝细胞癌组织中扩增CT基因SSX1,将SSX1和pMAL-C2质粒进行BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切,然后连接并转化大肠杆菌DH5α,最后对重组质粒进行蓝白斑筛选,酶切和测序鉴定。结果：重组表达质粒经鉴定准确无误。结论：成功构建了肿瘤-睾丸基因SSX1的原核表达载体。     

变形链球菌耐氟株体外诱导分离方法的研究

目的：对分离变形链球菌耐氟株的逐步诱导法和直接诱导法进行研究。方法：采用逐步诱导法和直接诱导法分别获得变形链球菌耐氟株，对各耐氟菌株的生物学特性进行比较。结果：在体外应用两种方法成功分离稳定传代的变形链球菌耐氟株；且所得耐氟菌株的形态、培养特性及生化反应都是相同的，传代时间和最大耐氟水平差别无统计学意义。结论：逐步诱导法和直接诱导法均可用于诱导变形链球菌耐氟株。     

ctxB和ureB抗原表位的融合表达及其免疫学活性

为研制新型有效的幽门螺杆菌疫苗，设计了一个由ctxB(去除信号肽部分)和ureB抗原表位融合的新型分子。PCR扩增霍乱弧菌的ctxB基因，插入到质粒pEl32a上，再将化学合成的ureB抗原表位序列(编码的氨基酸为CHHLDKSIKEDVQFAQSRI）连接到ctxB下游，融合基因命名为ctube。将含有融合基因的pET32a转化到大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达后SDS-PAGE测定融合蛋白ctube的分子质量，ELISA法检测ctube对神经节苷脂GM1的结合活性，Western blotting检测对兔抗幽门螺杆菌(Hp)多抗的结合活性。序列分析结果表明，ctube基因全长387bp，编码129个氨基酸，其中ctxB的密码子与GenBank上的序列同源性达到99％。转化后的大肠杆菌BL21（DE3)经IPTG诱导表达后，产生了一个分子质量为2．5万的蛋白，经肠激酶酶切后的产物为ctube。ELISA试验和West Blotting表明，ctube与神经节苷脂性GM1、兔抗Hp多抗均具有很好的结合活性，有希望成为一个具有抗幽门螺杆菌感染的新的活性分子。     

血卟啉单甲醚光动力疗法对致龋变形链球菌及龋损表面形态的影响

摘要 目的：探讨以血卟啉单甲醚(hematoporphyrin monomethyl ether,HMME)为光敏剂的光动力疗法（photodynamic therapy,PDT）在龋病预防中的作用。方法：采用变形链球菌接种Wistar大鼠磨牙,给予致龋饲料,建立龋病模型。将大鼠分为5组,分别用10 ng/L HMME-PDT（A组）、20 ng/L HMME-PDT（B组）、40 ng/L HMME-PDT（C组）、0.2 g/L氟化钠水溶液（D组）和0.9％的生理盐水(E组)处理各组大鼠磨牙,每周1次,连续4周,记录大鼠口腔变形链球菌生长情况。处死大鼠后用扫描电镜观察各组磨牙龋损区的表面形态。结果：第一周和第二周各组菌落数差异均无统计学意义（P>0.05）,第三周B组、C组菌落数低于E组（P<0.05）。第四周A组、B组和C组菌落数均低于E组（P <0.05或P <0.01）,C组菌落数低于A组和B组（P <0.05）,扫描电镜观察发现C组与D组龋损破坏程度最轻且表面相对平滑。结论：PDT具有抑制龋病的作用,将为龋病的预防提供一种新的有效途径。     

新基因Betatrophin原核重组蛋白表达及纯化

目的 构建人Betatrophin基因(h-Betatrophin)原核表达载体,诱导Betatrophin重组蛋白表达及纯化,为制备Betatrophin蛋白多克隆抗体及其功能研究打下基础.方法 体外克隆Betatrophin cDNA序列,酶切后连接到PET32 a(+)原核表达载体上,构建重组载体h-Betatrophin-PET 32 a,然后转入大肠杆菌BL 21(DE 3),用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,SDS-PAGE-考马斯亮蓝染色及Western blotting检测蛋白表达情况,然后用Ni-NTA His·Bind(R)Resin纯化目的蛋白.结果 成功构建Betatrophin基因原核表达载体,诱导表达Betatrophin重组蛋白表观分子量正确,经纯化后可以得到纯度较高的Betatrophin重组蛋白.结论 重组载体h-Betatrophin-PET 32 a转入大肠杆菌BL 21后通过诱导及纯化可获取到纯度很高的Betatrophin重组蛋白,为后期研究Betatrophin基因功能奠定基础.     

裂解液对变异链球菌蛋白质提取效果的影响

目的探讨裂解液对变异链球菌蛋白质提取效果的影响。方法通过革兰染色、SDS-PAGE和蛋白质浓度测定,对4种裂解液提取变异链球菌蛋白质的效果进行评价。结果裂解液Ⅲ、Ⅳ中的细菌破碎程度高于裂解液Ⅰ、Ⅱ。裂解液Ⅱ提取的蛋白质条带丰度低于其他3种裂解液。裂解液Ⅲ、Ⅳ提取的蛋白浓度高于裂解液Ⅰ、Ⅱ(P<0.05)。结论含还原剂、去垢剂、离液剂和蛋白酶抑制剂的裂解液提取变异链球菌蛋白质的效果优于只含还原剂和去垢剂的裂解液。     

GP73 融合蛋白原核表达及纯化

目的：原核表达并纯化高尔基体糖蛋白-73（GolgiProtein73,GP73）。方法以人肝癌细胞系HepG2总RNA为模板,经RT-PCR扩增GP73基因,克隆至原核表达载体pET-21a（＋）-TRX中,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。His-tag磁珠纯化重组蛋白GP73,SDS-PAGE鉴定。结果克隆目的基因的序列正确,未发生碱基突变;重组表达质粒pET21a（＋）-TRX-GP73经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子量为80 kD,与预期相符。结论本实验成功在大肠杆菌BL21（DE3）中表达并纯化了GP73重组蛋白,为后续研究奠定了基础。     

Isolation and characterization of n-octacosanoic acid from Viburnum foetens: a novel antibiofilm agent against Streptococcus Mutans

The aim of this study was to isolate, characterize the antibiofilm agent from Viburnum foetens and to investigate it’s in vitro effects on cariogenic properties of Streptococcus mutans, a major caries causing microorganism. The compound was purified by silica gel chromatography and analyzed with IR, MS, ¹H, and ¹³C NMR spectroscopy. Virulence attributes of S. mutans were assessed at different concentrations of the purified compound. Confocal microscopy was employed to investigate the effect on biofilm architecture. The purified compound was found to be n-octacosanoic acid and exhibited MIC of 80?μg/ml against S. mutans. At a concentration of 10 and 20?μg/ml, adherence to saliva-coated glass surface and ability to form biofilm were reduced to 50%. The n-octacosanoic acid profoundly changed the biofilm architecture and distorted the cell aggregating ability of S. mutans in a unique manner. The active compound, n-octacosanoic acid, demonstrated for the first time, potential antiplaque activity by inhibiting the adherence of S. mutans. The compound strongly inhibited biofilm formation of S. mutans and resulted in a reduction of water-insoluble glucans. These findings suggest that n-octacosanoic acid may have potential to prevent caries by limiting the overgrowth and biofilm formation of S. mutans.     

抗VEGFR-2 scFv-Fc融合抗体的构建及其在CHO细胞中的稳定表达

目前报道的靶向VEGF/VEGFR基因工程抗体多为不含Fc片段的Fabs、cFv等小分子抗体,该文旨在CHO-k细胞中表达抗VEGFR-2 scFv-Fc融合抗体。将抗VEGFR-2 scFv(AK404)基因与含有人IgG1恒定区的真核表达载体pcDNA3.1-Fc连接,重组质粒测序后经脂质体介导转染CHO-k细胞,G418加压筛选获取稳定表达细胞株。RT-PCR、western blot检测目的基因的转录、表达。测序结果表明重组质粒构建成功,RT-PCR及western blot显示目的基因成功整合到宿主基因组并表达。最终获得可稳定表达抗VEGFR-2 scFv-Fc融合抗体的重组CHO-k细胞株,为融合抗体的大量制备和活性研究打下基础。     

杂合抗菌肽HMCM的原核表达及其活性鉴定

将哺乳动物抗菌肽(Hexapeptide)、两栖类抗菌肽(Magainin)、昆虫抗菌肽(Cecropin A和Melittin)的有效作用部分拼接在一起,以获得一种新型的杂合抗菌肽HMCM。根据HMCM氨基酸序列和大肠杆菌B细胞的密码子偏好性设计了HMCM的基因序列;将目的基因克隆到原核表达载体pET-32a-c(+),构建了重组表达载体pET-32a-HMCM;再转化原核表达菌株E.coli BL21(DE3)实现融合表达,通过摸索诱导时间、IPTG浓度、OD600和温度等条件确定了表达最佳条件,并确定了融合蛋白以可溶形式存在;通过亲和层析纯化了融合蛋白,并进行了Western-blotting鉴定;最后用EK酶酶切融合蛋白释放出HMCM,对HMCM的抗菌性进行了初步研究。结果表明HMCM对枯草芽孢杆菌有良好的抑菌作用。     

AD7c-NTP与麦芽糖结合蛋白的融合表达、纯化及其抗血清制备

人工合成了编码AD7c-NTP的基因,并将其中的6种密码子GGA AGG AGA ATA CTA CCC分别突变成大肠杆菌偏爱密码子GGT CGT CGT ATC CTG CCG,PCR扩增后克隆到表达载体pMAL-c2上,构建表达质粒pMAL-AD7c,重组质粒导人E coli BL21(DE3)构建工程菌,IPTG诱导实现了MBP-ADTc-NTP融合蛋白在工程菌中的高效表达,细胞裂解液经Amylose-resin亲和层析、DEAE-Sepharose离子交换层析以及Su—perdex 200凝胶过滤层析,得到了电泳纯的融合蛋白。纯化的融合蛋白免疫家兔制备了兔抗MBP-AD7c-NTP 融合蛋白的抗血清,利用该抗血清及点杂交技术,初步分析了10例AD疑似患者的尿样.结果表明5例疑似患者的尿样呈阳性,另5例呈阴性。