表达反义N-myc逆转录病毒载体对神经生长因子诱导神经母细胞瘤细胞分化的影响

目的研究反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染后人神经母细胞瘤细胞在神经生长因子处理后的诱导分化情况,探讨Ｎ－ｍｙｃ在神经生长因子诱导分化中的意义。方法用基因重组技术构建表达反义Ｎ－ｍｙｃ的逆转录病毒载体。用ＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍＲｅａｇｅｎｔ等多种基因转染方法,转染已经基因转染恢复了神经生长因子受体表达的人神经母细胞瘤系,建成表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系。用神经生长因子处理转化细胞系,观察ＮＧＦ是否能诱导分化。同时用ＴＵＮＥＬ原位凋亡检测技术及超微结构技术研究表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系凋亡的情况。结果表达反义Ｎ－ｍｙｃ的转化细胞系经单链ＲＮＡ探针杂交,证实其Ｎ－ｍｙｃ的表达明显降低。用神经生长因子处理这些转化细胞系,细胞出现明显的形态学分化。ＴＵＮＥＬ技术及超微结构研究表明,经反义Ｎ－ｍｙｃ转染的细胞系细胞凋亡增多。结论反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染能有效抑制Ｎ－ｍｙｃ的表达,进而促进神经生长因子诱导人神经母细胞瘤细胞的分化。反义Ｎ－ｍｙｃ基因转染能使神经母细胞瘤细胞凋亡增多。     

神经生长因子诱导神经干细胞分化的作用机制探讨

目的探讨神经生长因子(NGF)对体外培养的小鼠神经干细胞(NSCs)分化为神经元的作用及可能机制。方法以无血清培养法从孕13～14 d的昆明小鼠大脑皮质分离培养获得NSCs,传至3代后,进行NGF处理,并对培养的细胞进行MAP-2免疫细胞化学染色,荧光显微镜下对MAP-2阳性细胞进行计数。同时运用蛋白免疫印迹法(Western blot)考察NGF对TrkA、Akt、Erk磷酸化水平的影响;在研究NGF作用的信号转导通路时,预先给予各种信号通路抑制剂处理,再进行NGF干预,通过MAP-2染色及Western blot考察NGF促进神经干细胞分化为神经元的信号通路。结果 NGF可以显著促使NSCs分化为神经元并可以促进TrkA、Akt和Erk的磷酸化,呈现剂量和时间依赖性;各种通路抑制剂结果显示PI3K/Akt抑制剂可以阻断NGF对Akt的磷酸化作用,同时阻断了NGF对NSCs的促分化作用,MAPK抑制剂处理可以阻断NGF对Erk的磷酸化作用,但未见明显阻断NGF的促分化作用。结论 NGF可以促进NSCs分化为神经元,其作用机制可能与激活PI3K/Akt信号通路有关。     

表达反义N－myc基因逆转录病毒载体的构建

表达反义Ｎ－ｍｙｃ基因逆转录病毒载体的构建陈杰，刘彤华，王志永，崔全才，李和伟，郭洪涛，高洁（中国医学科学院，中国协和医科大学协和医院，北京１００７３０）关键词逆转录病毒载体；Ｎ－ｍｙｃ基因中图号Ｒ７３０．２Ｎ－ｍｙｃ癌基因是ｍｙｃ族癌基因的重要成员...     

神经母细胞瘤中NSE,S—100,CGA及p53,p21,C—erb—B2蛋白表？…

回顾性研究了４９例原诊断为神经母细胞瘤，神经节神经母细胞瘤和神经节细胞瘤的病理资料。结果表明，这３种肿瘤为分化程度不同的同源性肿瘤，统称为神经母镏细胞瘤。应用免疫组化方法检测ＮＳＥ，Ｓ－１００，ＣＧＡ和ｐ５３，Ｃ－ｅｒｂ－Ｂ２，ｐ２１在该肿瘤中的表达和分布，发现ＮＳＥ，Ｓ－１００和ＣＧＡ阳性率分别为８５％，７３％和５０％，在肿瘤的Ⅰ－Ⅳ级之间，分化越好者阳性率越高，可做为临床鉴别诊断的估计预后的指     

外源性神经生长因子对神经移植的影响

目的:探讨神经移植后在局部注入神经生长因子对神经再生的影响.方法:家兔30只,随机分为两组.A组:切除5mm面神经颊支,用等长的耳大神经移植.B组:神经移植同A组,并于术中、术后第1、2、3、4天分别在局部注入2 000U的神经生长因子(大连司威特制药有限公司制).术后饲养12周,对移植体进行神经电生理、组织学检测.结果:实验结果证明,再生神经纤维都可以通过移植神经的吻合端,A组神经传导速度为20.42±2.12m/s,B组神经传导速度为23.71±2.24m/s,两组神经传导速度差异有显著性(P<0.01).结论:神经移植后注入神经生长因子的效果明显优于单纯神经移植.     

神经生长因子对糖尿病大鼠背根神经节神经细丝蛋白变化的 …

观察神经生长因子对糖尿病神经病变的治疗作用。方法采用免疫组织化学染色结合电子计算机图像分析技术，测定糖尿病大鼠根神经节的结构蛋白－神经细丝蛋白的相对含量。结论：ＮＧＦ可促进感觉神经结构蛋白的表达，有益于糖尿病周转神经病变的恢复。     

神经生长因子对神经干细胞增殖的影响

目的:观察不同剂量神经生长因子(NGF)对体外培养的神经干细胞(NSCs)增殖的影响.方法:取人胚胎组织脑室区/脑室下区(VZ/SVZ)组织分离神经干细胞,培养于DMEM/F12 B27细胞基础培养液中,加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作为阳性对照组;实验组培养液中分别加入NGF至终浓度的50μg/L、20μg/L、10μg/L、5μg/L、2μg/L;培养液无添加成分作为阴性对照组.用MTT比色分析法测定细胞增殖能力,倒置显微镜下观察细胞增殖情况.结果:3 d MTT比色显示,50μg/L NGF组细胞增殖较其他各组低(P＜0.05);培养10 d时细胞活力测定表明各组细胞均有一定程度的增殖,10μg/L NGF组与阳性对照组比较差异无统计学意义,与阴性对照组比较差异有统计学意义.结论:在一定浓度范围内NGF能明显促进神经干细胞的增殖.     

不同生长因子对神经干细胞定向分化的影响

目的 研究神经干细胞（NSCs）分化为神经元和胶质细胞的影响因素,探讨各种生长因子对小鼠NSCs定向分化的影响。方法 以无血清培养法从E13-14d的昆明小鼠大脑皮质分离培养获得NSCs后,分别加入50 mg/L EGF、bFGF、IGF-1、NGF和PDGF处理,分析不同生长因子对NSCs定向分化的影响。结果 分离得到的细胞表现出NSCs的特性,能无限增殖,神经元微管相关蛋白和胶原纤维酸性蛋白均呈阳性表达。与空白对照组相比,各生长因子均可显著诱导NSCs分化为神经元及星形胶质细胞,其中NGF的诱导NSCs分化为神经元的作用最强;IGF-1、NGF、PDGF均能明显诱导NSCs分化为星形胶质细胞。结论 几种生长因子均能促进NSCs分化,其中NGF诱导NSCs向神经元方向作用最强;而IGF-1、NGF和PDGF促进NSCs向星形胶质细胞分化的作用均较强。     

反义bcl-2 和反义survivin对人神经母细胞瘤细胞系SK-N-MC细胞生长的作用

目的研究反义bcl-2和反义survivin(svv)对人神经母细胞瘤(NB)细胞系SK-N-MC细胞生长的作用.方法利用基因重组技术,采用定向克隆构建在真核细胞中能够稳定表达反义bcl-2 或反义svv 的逆转录病毒载体PBabe puro-Asbcl-2和PBabe puro-Assvv,并分别经脂质体LipofectamineTM介导转染人NB细胞株SK-N-MC细胞,经嘌呤霉素(2.0 μg/ml)筛选得到抗性克隆,同时以空载体Pbabe puro 转染SK-N-MC作为对照;以免疫组化和Western 印迹分析反义bcl-2、反义svv对细胞内源性Bcl-2、SVV蛋白质的表达抑制作用,应用MTT法研究细胞(5×103 /孔)的生长和增殖情况,并接种于裸鼠(3只/组),观察107 个细胞在6周时的成瘤情况,以研究反义bcl-2、反义svv对SK-N-MC细胞生长的作用.结果反义bcl-2转染后的细胞SK-N-MC/PBabe puro-Asbcl-2中的Bcl-2表达明显降低,反义svv转染后的细胞SK-N-MC/PBabe puro-Assvv中的SVV表达也明显降低;且这两种细胞均生长缓慢, 裸鼠移植瘤体积均明显小于SK-N-MC原始细胞或转染空载体的细胞接种形成的移植瘤.结论稳定表达的反义bcl-2、反义svv均能够有效抑制SK-N-MC细胞内源性相应蛋白质Bcl-2、SVV的表达,提示这两个基因在NB细胞的肿瘤形成中均具有一定的作用.     

反义GFAP对人恶性胶质瘤细胞系CHG-5增殖及分化的影响

目的观察抑制内源性胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)基因表达对恶性胶质瘤细胞生物学特性的影响,为进一步深入研究GFAP基因在胶质瘤恶性转化及诱导分化治疗中的作用提供实验基础.方法构建反义GFAP 逆转录病毒表达载体,经包装后以病毒上清感染人恶性胶质瘤细胞系CHG-5;采用RT-PCR、原位杂交以及免疫细胞化学方法检测GFAP基因及其蛋白的表达;并通过形态学、细胞生长曲线、软琼脂克隆形成及流式细胞分析等观察抑制GFAP基因表达后CHG-5细胞形态、增殖和细胞周期进程的变化.结果反义逆病毒感染后CHG-5细胞GFAP mRNA及其蛋白表达显著减弱甚至缺失,瘤细胞异型性增加,细胞增殖速度加快,体外成瘤能力增强,S期、G2/M期细胞比例升高.结论抑制内源性GFAP基因表达可使CHG-5细胞呈现更为恶性的表型,提示GFAP基因在调控胶质瘤细胞分化程度及恶性生物学行为方面具有重要作用.     

外源性反义血管内皮生长因子-C基因稳定转染对人胃癌细胞SGC-7901体外生长的影响

目的:观察以pCI-neo为载体的血管内皮生长因子-C(Vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C)反义基因转染的人胃癌细胞SGC-7901中VEGF-C蛋白的表达,并研究其对人胃癌细胞体外生长的影响.方法:应用重组质粒pCI-neo-antiVEGF-C和pCI-neo空载体质粒,以脂质体转染法转染体外培养的人胃癌细胞株,以未转染组为对照,经G418筛选抗性克隆,扩大培养后,再用免疫组化和Western-blot分析VEGF-C基因及蛋白的表达,最后用MTT法分析其对细胞生长的抑制作用.结果:免疫组化和Westem-blot均显示pCI-neo-anti VEGF-C转染组无VEGF-C mRNA及其蛋白的表达,MTT检测表明pCI-neo-anti VEGF-C转染组活细胞数较其它各组均低(P＜0.05).结论:pCI-neo-anti VEGF-C成功转染人胃癌细胞SGC-7901且可封闭VEGF-C mRNA,使已转染pCI-neo-anti VEGF-C的人胃痛细胞VEGF-C蛋白的表达减少,并能抑制胃癌细胞SGC-7901的体外生长,为进一步研究VEGF-C的生物学功能及胃癌的基因治疗研究创造了条件.     

T-STAR基因对人结肠癌细胞系HCT-116生长增殖的影响

目的　探讨正、反义T- STAR(testes signaltransductionandactivatorofRNA,T -STAR)基因对结肠癌细胞HCT- 116 生长增殖的影响。方法　用脂质体介导法分别将正、反义T -STAR基因转入HCT -116细胞中,用Westernblot检测T -STAR 蛋白表达水平,用细胞动力学检测HCT- 116细胞的生长、增殖变化。结果　转染正义T -STAR基因后,HCT -116细胞的T STAR蛋白表达水平增加,但细胞生长速度变慢、增殖能力下降;转染反义T -STAR基因后,HCT- 116细胞的T -STAR蛋白表 达水平下降,但细胞生长速度变快、增殖能力增强。结论　T- STAR基因可抑制结肠癌细胞HCT- 116的生长、增殖。     

Survivin反义核酸对SKOV3细胞生长及Survivin基因表达的影响

目的 :观察Survivin反义核酸对人卵巢癌细胞系SKOV3的生长及Survivin基因表达的影响。方法 :应用基因重组技术 ,将在真核细胞中能稳定表达反义Survivin的pcDNA3 SVVas经脂质体LipofectamineTM2 0 0 0 介导转染人卵巢癌细胞株SKOV3,经G4 1 8筛选得到抗性克隆 (SKOV3/SVVas) ,同时以空载体pcDNA3转染SKOV3作为对照(SKOV3/neo) ;绘制细胞生长曲线 ;采用免疫组化、RT PCR和流式细胞仪检测SKOV3、SKOV3/neo及SKOV3/SVVas细胞的内源性SurvivinmRNA及蛋白的表达和凋亡细胞。结果 :与SKOV3及SKOV3/neo细胞比较 ,SKOV3/SVVas细胞增殖和代谢能力均明显降低 ,Survivin蛋白阳性表达率及mRNA相对表达量明显降低 (P <0 .0 1 ) ,细胞凋亡率显著增加 (P <0 .0 1 )。结论 :稳定表达的反义Survivin能够有效抑制SKOV3细胞内源性Survivin蛋白的表达 ,诱导SKOV3细胞凋亡。     

反义IGF-I R基因对肝癌细胞生长的抑制作用

目的:研究反义IGF-IR基因对肝癌细胞株7721细胞生长的抑制作用.方法:利用基因治疗的反义技术,通过脂质体介导将IGF-IR正、反义基因真核表达载体导入人肝癌细胞株SMMC-7721,经潮霉素筛选阳性克隆后,分别采用流式细胞仪检测细胞周期、凋亡,MTT法检测细胞生长及软琼脂克隆形成试验.结果:1GF-IR反义细胞与7721细胞IGF-IR正义细胞在前6 d生长趋势无明显变化,第7天后反义IGF-IR细胞生长减慢.反义IGF-IR基因细胞G1/G 2期细胞明显增加,为63.9%,明显高于7721细胞(49.8%);S期减少(1 9.3%),细胞凋亡增加(5.89%),不能在软琼脂中生长,而7721细胞及IGF-I R正义细胞在软琼脂中生长良好.结论:反义IGF-IR基因对肝癌细胞株7721生长具有明显抑制作用.     

口虾蛄乙酸乙酯提取物对鼻咽癌细胞生长和分化的影响

目的研究口虾蛄乙酸乙酯提取物对人低分化鼻咽癌细胞CNE-2Z生长和分化的影响。方法采用系统溶剂法,对口虾蛄进行分离;采用台盼蓝染色测定该提取物对CNE-2Z细胞的抑制作用;用免疫细胞化学爬片法检测提取物对CNE-2Z细胞角蛋白表达的影响。结果生长曲线测定结果显示,乙酸乙酯提取物可抑制CNE-2Z细胞的生长;NCNE-2Z细胞中角蛋白的表达随提取物浓度的增高而增加,且高于对照组（P〈0．01）。结论口虾蛄乙酸乙酯提取物能够抑制鼻咽癌CANE-2Z细胞的生长,并可能会促进CNE-2Z细胞的分化。     

端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对HL-60细胞生长的作用

目的：观察端粒酶反义寡聚脱氧核着酸对急性髓细胞白血病细胞株HL-60的作用、方法：采用台盼蓝排斥法进行药物敏感试验,流式细胞仪测定凋亡细胞含量结果：端粒酶反义寡聚脱氧核着酸对HL-60细胞有生长抑制作用,作用具有序列特异性及剂量依赖性．流式细胞仪检测到凋亡峰,含量为28．8％．无关寡聚核着酸片段无此作用．结论：端粒酶对维持白血病细胞的生长可能起十分重要的作用,它有可能成为白血病治疗的新靶点．     

端粒酶反义寡核苷酸对SGC-7901胃癌细胞生长的作用

目的 探讨端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸（PS－ASODN）对胃癌细胞生长的作用。方法 脂质体介导的PS－ASODN作用于SGC－7901细胞后，MTT法计算细胞生长抑制率，流式细胞学观察细胞周期及细胞凋亡率变化。结果 终浓度为3、2及1μM的PS－ASODN对SGC－7901细胞均有抑制作用，抑制率与对照组相比差异有显著性意义（P＜0．01）；流式细胞学检测到凋亡峰，细胞阻滞于G0／G1期。对照寡核苷酸无上述作用。结论 以端粒酶RNA模板区为靶点的反义寡核苷酸不但明显抑制胃癌细胞的增殖，而且具有促凋亡作用，对胃癌具有重要治疗价值。