人hsp90β基因的热诱导表达与染色质活化的关系

目的研究人ｈｓｐ９０β基因的热诱导表达与染色质活化的关系。方法采用有机汞亲和层析柱分离热诱导前后Ｊｕｒｋａｔ细胞内的活性和非活性染色质，然后采用狭缝杂交技术比较热诱导前后人ｈｓｐ９０β基因在活性和非活性染色质中的分布，并用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交的方法研究热休克诱导下的ｈｓｐ９０βｍＲＮＡ表达。结果发现热休克诱导使细胞内人ｈｓｐ９０β基因在活性染色质中的含量明显增加，并与内源性的ｈｓｐ９０βｍＲＮＡ表达水平一致。结论首次证实人ｈｓｐ９０β基因的热诱导表达在染色质水平受“基因开关”的调控，为研究人类细胞热应激机制提供了新的模型。     

入hsp90p基因的热诱导表达与染色质活化的关系

目的研究人hsp90β基因的热诱导表达与染色质活化的关系.方法采用有机汞亲和层析柱分离热诱导前后Jurkat细胞内的活性和非活性染色质,然后采用狭缝杂交技术比较热诱导前后人hsp90β基因在活性和非活性染色质中的分布,并用Northern印迹杂交的方法研究热休克诱导下的hsp90β mRNA表达.结果发现热休克诱导使细胞内人hsp90β基因在活性染色质中的含量明显增加,并与内源性的hsp90βmRNA表达水平一致.结论首次证实人hsp90β基因的热诱导表达在染色质水平受“基因开关”的调控,为研究人类细胞热应激机制提供了新的模型.     

hsp90α基因在染色质模板上的热诱导转录

目的在体外将带有hsp90α基因启动子的报告基因质粒pBLCAT3α1组装为染色质模板,用于研究hsp90α基因的热诱导转录.方法采用竞争性RT-PCR定量检测基因启动子活性的方法,研究染色质模板的体外组装,并比较染色质模板与裸露DNA模板上基因的转录活性.结果优化了热休克处理的HeLa全细胞抽提物在基因转录活性研究中的实验条件:用体外重组表达的染色质组装相关因子与核心组蛋白在体外与hsp90α基因启动子质粒组装成染色质;证明染色质模板的hsp90α基因体外转录水平低于裸露DNA模板,而其热诱导效率显著高于对照组.结论在体外组装的染色质模板具有阻遏hsp90α基因转录的活性,但明显提高了该基因的热诱导表达效率.     

丝裂原活化蛋白激酶信号途径在热休克蛋白90基因表达？…

目的 研究丝裂原活化蛋白激酶－（ＭＡＰＫ）信号传导途径对Ｊｕｒｋａｔ细胞中热休克蛋白９０基因（ｈｓｐ９０）表达的影响。方法 用Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹－增强型化学光系统（ＥＣＬ）检测热休克前后Ｊｕｋａｔ细胞外信号调节激酶（ＥＲＫ）、ｐ３８激酶及ｃ－Ｊｕｎ Ｎ－末端蛋白激酶（ＪＮＫ）的底物ｃ－Ｊｕｎ的磷酸化程度;分别用ＪＮＤ１的显性负突变质粒ＤＮ－ＪＮＫ１、ｐ３８ｃＤＮＡ反应表达质粒ａｎｔｉ－ｐ３８及     

人热休克蛋白hsp90β基因的染色体定位

目的：研究ｈｓｐ９０β基因的染色体定位。方法：以３ＨｄＣＴＰ和３ＨｄＧＴＰ标记的ｈｓｐ９０β基因－１１０２／＋６８ｂｐ片段为探针，进行染色体原位杂交。结果：分析了２５７个杂交分裂相，１９６５个杂交银颗粒在各条染色体上的分布，发现５号染色体上有杂交银颗粒１８５个，占全部杂交银颗粒的９４１％（Ｐ＜００１）；在５ｑ１３５ｑ２２之间有杂交银颗粒８２个，占全部杂交银颗粒的４１７％，占５号染色体上杂交银颗粒的４４３％。结论：ｈｓｐ９０β定位于５ｑ１３５ｑ２２。由于使用了ｈｓｐ９０β基因上游片段作为探针，本文结果只反映活性基因的定位，可排除假基因的影响。     

日本血吸虫32ku抗原基因的克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

日本血吸虫３２ｋｕ抗原（简称ｓｊ３２ｋｕ）是血吸虫的一种保护性抗原,为研究其重组疫苗的保护作用,将该抗原基因的全编码序列接正确的阅读框顺序列插入到穿梭质粒ｐＢＣＧ２１００,受控于人结核杆菌热休克蛋白７０（Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏ－ｔｅｉｎ,７０,简称ｈｓｐ７０）启动子,构建成重组表达质粒ｐＢＣＧ－ＳＪ３２,在大肠杆菌－分枝杆菌两个系统中能稳定复制。重组分枝杆菌于４２℃诱导２ｈ或４５℃诱导３０ｍ     

hsp70与c─myc、c─fos和P~（53）的结构及功能联系

ｈｓｐ７０与ｃ─ｍｙｃ、ｃ─ｆｏｓ和Ｐ~（５３）的结构及功能联系杨和平（衡阳医学院分子生物学中心）人类热休克蛋白７０（ｈｓｐ７０）基因启动子部位有ｍｙｃ原癌基因产物的两个结合位点，分别位于ｈｓｐ７０基因５＇侧上游－１６０和－２３０碱基处，ｍｙｃ蛋白可?..     

丙肝病毒非结构蛋白基因3的克隆及其体外诱导表达

目的：研究丙型病毒非结构蛋白基因３（ｎｓ３基因）在体外真核细胞中的诱导表达。方法：以ＰＣＲ方法从含ＨＣＶｎｓ３基因的重组载体ｐＢｎｓ３中扩增出ｎｓ３基因，并将其插入到克隆载体ｐＧＥＭ－Ｔ中，再与表达载体ｐＭＳＧ重组，以利到重组表达载体ｐＭＳＧ－ｎｓ３。然后采用磷酸钙沉淀法将其转染哺乳动物ＣＨＯ细胞，经地塞米松（ＤＭ）诱导，采用ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ技术检测ＮＳ３蛋白的表达水平。结果：     

维生素D3,9—顺式维甲酸及其相应核受体对hsp90β基因？…

目的 研究维生素Ｄ３（ＶＤ３）、９－顺式维甲酸（９－ｓｉｃ－ＲＡ）及其相应核受体对ｈｓｐ９０β基因表达的调控作用。方法 采用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ方法将人ｈｓｐ９０β基因调控片段（－１ ０３９ ｂｐ／＋１ ５３１ ｂｐ）介导的荧光素酶（Ｌｕｃ）报告基因质粒β１．１１转染Ｊｕｒｋａｔ细胞,并用ＶＤ３和９－ｃｉｓ－ＲＡ分别或同时刺激细胞,或将质粒β１．１１及野生型维生素Ｄ３受体（ＶＤＲ）或／和维甲酸     

日本血吸虫32ku抗原基因的克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

日本血吸虫３２ ｋｕ抗原（简称ｓｊ３２ｋｕ）是血吸虫的一种保护性抗原,为研究其重组疫苗的保护作用,将该抗原基因的全编码序列按正确的阅读框顺序插入到穿梭质粒 ｐＢＣＧ２１００,受控于人结核杆菌热休克蛋白 ７０（Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏ－ｔｅｉｎ ７０,简称ｈｓｐ７０）启动子,构建成重组表达质粒 ｐＢＣＧ－ｓｊ３２,在大肠杆菌－分枝杆菌两个系统中能稳定复制。重组分枝杆菌于 ４２℃诱导 ２ ｈ或 ４５℃诱导 ３０ ｍｉｎ,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,在 ３２ ｋｕ的位置能见到明显的蛋白条带,表明 ３２ ｋｕ抗原能在分枝杆菌中高效表达。     

热激活Rac-MEKK-JNK信号通路与hsp90β基因表达

目的探讨Rac-MEKK-JNK(Rac-丝裂原活化的蛋白激酶的激酶的激酶-C-jun N端蛋白激酶)信号通路对热诱导hsp90β基因表达的调控作用以及Hsp90蛋白对Rac信号通路传递的调节过程.方法将载体PcDNA3、显性负突变Rac(DN-Rac),显性负突变MEKK(DN-MEKK)和显性负突变JNK(DN-JNK)表达质粒分别与hsp90β基因转录调控片段介导的氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因质粒β3.1共转染Jurkat和LETPa-2细胞,采用以竞争性RT-PCR为基础的系统检测CAT报告基因转录水平.用Western印迹分析检测转染了DN-Rac、DN-MEKK和DN-JNK的细胞在热刺激前后c-Jun的表达水平和磷酸化状态.用体外激酶活性分析法检测geldanamycin(GA)对热诱导的JNK活性的影响.结果转染DN-Rac、DN-MEKK及DN-JNK均能抑制42℃1 h诱导的β3.1报告基因的表达,Jurkat细胞中CAT的热诱导表达分别为对照组的(72.8±5)%、(60±13.2)%及(47.7±12.1)%;LETPa-2细胞中CAT的热诱导表达分别为对照组的(16.17±5.1)%、(50.2±8.7)%及(47.5±10)%.转录因子c-Jun的表达和磷酸化水平也在一定程度上被抑制.GA处理细胞可明显抑制热诱导激活的JNK激酶活性和c-Jun的磷酸化水平,但不影响JNK和c-Jun的蛋白表达水平.结论Rac-MEKK-JNK通路参与hsp90β基因的热诱导表达,hsp90可能对热激活化的Rac信号通路有调节作用.     

STAT1对hsp90∝基因表达的负调控作用

目的 探讨转录因子STAT1对hsp90∝基因表达的调控作用。方法 将STAT1表达质粒转染Jurkat细胞,利用竞争性RT－PCR定量检测其内源性hsp90∝基因mRNA水平。共转染STAT1表达质粒和hsp90∝基因上游调控区不同长度的片段驱动的氯霉素乙酰转移酶（CAT）报告基因质粒,利用定量RT－PCR检测CAT报告基因转录水平,用Western印迹分析方法检测42℃ 1h热激前后Jurkat细胞中STAT1酪氨酸磷酸化状态,用电泳迁移率变更分析（EMSA）检测STAT1与hsp90∝5‘基因上游调控区中含有STAT1特异结合元件的双链寡核苷酸片段特异性结合程度。结果 STAT1既可抑制Jurkat细胞hsp90∝基因的表达,又能抑制hsp90∝基因5‘上游调控区驱动的CAT报告基因活性。热激以前Jurkat细胞中的STAT1 701位酪氨酸已有一定程度的磷酸化,热激以后其磷酸化程度明显升高,而且STAT1与hsp90∝基因5‘上游调控区中的STAT1结合元件呈特异性结合。结论 STAT1对hsp90∝基因的表达具有负调控作用。     

热休克诱导基因表达谱的变化

目的 研究细胞在热应激时的基因表达谱变化。方法 提取热休克前后Jurkat细胞的总RNA,经逆转录合成cDNA探针后分别与人cDNA表达占阵杂交,再用ESTblot软件进行分析,并用Northern印迹证明基因表达的改变。结果 经42℃1h热休克的细胞中有40个基因的mRNA表达升高,16个基因的mRNA表达降低,其中除热休克基因表达显著增加外,原癌基因c-Jun、cdc样激酶CLK－1基因表达明显增加。整合素integrin ∝－4基因,转化生长因子TGF－β基因表达显著降低。Northern印迹证明c-Jun及hsp90∝基因表达升高。结论 在热应激条件下Jurkat细胞热休克基因、c-Jun、CLK－1基因表达增加,integrin ∝－4基因、TGF－β基因表达减少。     

BTB／POZ结构域蛋白GRP对热休克中hsp90a基因表达的增强作用

目的 探讨人BTB／POZ结构域GAGA元件结合相关蛋白(GRP)在hsp90a基因表达中的作用。方法 用正义或反义GRP真核表达质粒或空载体,分别与装有hsp90a基因启动子(-1756- 37)的pREP4 episomal vector质粒和对照质粒pMCAT共转染Jurkat细胞,提取总RNA,用竞争性半定量RT-PCR测定hsp90a-氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因相对启动子活性。结果 热休克时,GRP明显促进pREP4 episomal vector质粒上hsp90a-CAT报告基因启动子活性。结论 GRP可能通过参与染色质动态调整促进pREP4 episomal vector质粒上hsp90a CAT的表达。     

检测4种热休克基因表达水平的RT-PCR体系的建立及其应用

目的建立能同时检测人Jurkat细胞中4种热休克基因mRNA表达水平的RT-PCR体系。方法采用基因克隆、基因重组、体外转录、RT-PCR技术,建立能同时检测细胞中4种热休克基因的RT-PCR体系,并将此体系用于检测SW13细胞中热休克基因的表达。结果构建了用于4种热休克基因mRNA检测的内参照质粒,并经体外转录成内参照RNA(i-RNA);用于SW13细胞中结果显示:hsp70、hsp90α呈典型的热诱导表达,hsp60和hsp90β具有较高水平的组成性表达,并且呈不同程度的热诱导表达。结论新构建的RT-PCR体系可以用于检测人Jurkat细胞中4种热休克基因mRNA的表达水平。     

热激诱导Jurkat细胞中主要组织相容性复合物Ⅱ类转录激活因子基因和人白细胞抗原的表达

目的 检测热激对Jurkat细胞中主要组织相容性复合物Ⅱ类转录激活因子(CⅡTA)的表达,及其对下游人类白细胞抗原(HLA-DR)表达的影响.方法 采用实时RT-PCR检测42℃热激和干扰素-γ(IFN-γ)作用前后Jurkat细胞中CⅡTA mRNA的变化.采用Western blot检测热激和IFN-γ作用前后Jurkat细胞中CⅡTA 蛋白的表达变化.采用流式细胞仪荧光分析热激前后Jurkat细胞表面HLA-DR的表达.结果 在Jurkat细胞中,热激可诱导CⅡTA mRNA和蛋白的表达,而IFN-γ处理后无明显变化.与正常Jurkat细胞相比,热激后HLA-DR在Jurkat细胞表面的抗原浓度明显增加(P<0.01).结论 热诱导Jurkat细胞中CⅡTA和HLA-DR先后表达增高.提示热激可能在免疫基因表达缺陷的细胞中,重建相关基因的功能,为肿瘤热疗提供新的依据.     

p53反式结合hsp90β基因

目的 探讨hsp90β基因中p53结合位点（＋31／＋60）是否参与p53与hsp90β基因的反式结合,以进一步揭示该位点在p53调节hsp90β基因转录中的作用。方法 将含有p53结合位点的hsp90β基因片段插入质粒pBS-SK,然后将综与突变引物和选择引物一起依次退火和延伸,经过两 轮细菌转化,酶切筛选出突变阳性粒后进行序列分析。采用电泳迁移率变更测定（EMSA）检测突变后基因片段与转染p53表达质粒的Jurkat细胞核抽提物的结合。结果 序列分析证实p53结合。结论 hsp90β基因中p53结合位点的核心序列在p53与hsp90β基因的反式结合中关键作用。