利用异源性饲养细胞建立人抗原特异性T淋巴细胞克隆

目的 摸索利用有限稀释法建立抗原特异性T淋巴细胞克隆操作中的最佳培养条件,并探讨利用异体来源的饲养细胞作为替代方案的可行性.方法 MTT法测定细胞增殖活性,判断T细胞生长的最佳PHA、IL-2作用浓度以及用丝裂霉素处理法制作饲养细胞的浓度、时间条件,观察IL-4对克隆生长形态的影响.探讨异体饲养细胞进行有限稀释法T细胞克隆时的克隆生长特点和影响因素.结果 克隆时PHA 25 μg/ml、IL-2 27 u/ml,饲养细胞丝裂霉素处理60 μg/ml、80 min为比较理想的操作条件.IL-4可以促进CD4 细胞亚群的克隆生长,但异体饲养细胞法形成的T细胞克隆的抗原特异性难以保障.结论 IL-4对CD4 细胞克隆生长具有促进作用,异体饲养细胞法得到的T细胞克隆抗原特异性不高.     

HLA-A·02/24限制的HBcAg表位特异性细胞毒T细胞克隆的建立及分析

目的建立HLA-A＊0201／2403限制的HBcAg表位特异性CTL细胞克隆。方法HLA-A＊0201／2403阳性HBV感染者的外周血单个核细胞（PBMC）分别用限制性表位肽HBc18-27和HBc117-125刺激,并以有限稀释法进行克隆化,期间单独使用植物血凝素（PHA）及联合使用表位肽刺激。用免疫荧光、流式细胞术以及乳酸脱氢酶释放实验对所获克隆进行鉴定。结果从HBc18-27活化的细胞中获得29株细胞克隆,其中28株为CD8^＋T克隆,均具有特异性细胞毒活性。从HBc117-125激活的细胞中获得12株CD8＋T克隆,其中9株有明显的细胞毒活性,另3株细胞毒活性则显著低下。克隆化过程中单独使用PHA及联合使用表位肽,克隆形成率分别为15.62％和14.58％。结论分别用表位肽HBc18-27和HBc117-125,能激活HLA-A＊0201／2403阳性HBV感染者的CD8^＋T细胞。建立CD8^＋T克隆过程中,表位肽的使用不能提高克隆形成率。     

HLA-A＊02／24限制的HBcAg表位特异性细胞毒T细胞克隆的建立及分析

目的建立HLA-A＊0201／2403限制的HBcAg表位特异性CTL细胞克隆。方法HLA-A＊0201／2403阳性HBV感染者的外周血单个核细胞（PBMC）分别用限制性表位肽HBc18-27和HBc117-125刺激,并以有限稀释法进行克隆化,期间单独使用植物血凝素（PHA）及联合使用表位肽刺激。用免疫荧光、流式细胞术以及乳酸脱氢酶释放实验对所获克隆进行鉴定。结果从HBc18-27活化的细胞中获得29株细胞克隆,其中28株为CD8^＋T克隆,均具有特异性细胞毒活性。从HBc117-125激活的细胞中获得12株CD8＋T克隆,其中9株有明显的细胞毒活性,另3株细胞毒活性则显著低下。克隆化过程中单独使用PHA及联合使用表位肽,克隆形成率分别为15.62％和14.58％。结论分别用表位肽HBc18-27和HBc117-125,能激活HLA-A＊0201／2403阳性HBV感染者的CD8^＋T细胞。建立CD8^＋T克隆过程中,表位肽的使用不能提高克隆形成率。     

人类白细胞抗原-抗原肽复合物特异性细胞毒性T细胞的诱生及克隆

为建立一种有效诱导及克隆人类白细胞抗原(HLA)-抗原肽复合物特异性细胞毒性T细胞(CTL)的方法.用EB病毒转化的B淋巴母样细胞系细胞作为刺激细胞,采用长期混合淋巴细胞培养法诱导自身外周血T细胞库中抗原肽-HLA复合物特异性CTL增殖、分化,并用有限稀释法对之进行克隆.通过细胞毒实验证实获得的CD3+、CD8+T细胞克隆具有高度抗原特异性并受某些HLA型别的限制.     

恶性疟细胞毒性T淋巴细胞单表位疫苗抗原递呈细胞模型的建立

目的 构建恶性疟细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL）单表位疫苗及建立抗原递呈细胞模型。方法 采用中国人群常见的HLAⅠ类分子A11限制的恶性疟（CTL）抗原表位(VTCGNGIQVR),合成其DNA序列并克隆于真核表达载体,构建CTL单表位DNA疫苗。将上述克隆在HLA－A11表型细胞株中进行表达,流式细胞仪检测细胞表面HLAⅠ类分子表达水平。结果 上述CTL单表位DNA疫苗编码的短肽在细胞内的表达明显促进HLA－A11分子在细胞表面的表达,用流式细胞仪测定平均荧光强度可量化表达水平（P＜0.05）。结论 成功构建CTL单表位短肽表达载体,模拟体内环境建立了抗原递呈细胞模型,提示CTL表位在该细胞模型内被内源性加工和递呈,以该表位为基础的疫苗可以为HLA－A11遗传背景的人群提供免疫防护。     

肿瘤抗原细胞毒性T淋巴细胞表位鉴定和多肽疫苗的研究进展

恶性肿瘤是当前威胁人类生命健康的主要疾病之一,尽管手术治疗联合化疗/放疗能够延长患者的生存期,但是这些治疗手段也会损伤正常细胞,产生很多不良反应,再加上很多恶性肿瘤具有侵袭转移和复发等特征,因此,急需发展新的方法来治疗肿瘤患者[1]。随着人们对免疫系统及其调节方式的逐     

体外检测近交系小鼠HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞方法的建立

通过磷酸钙法用含ＨＢＶＳ基因的质粒ｐＲｃ／ＣＭＶＳ与含筛选标记基因—ｎｅｏｒ基因的质粒ｐＳＶ２ｎｅｏ对ＢＡＬＢ／Ｃ近交系小鼠肥大细胞瘤细胞株—Ｐ８１５细胞进行了质粒共转染，并经Ｇ４１８筛选得到了Ｇ４１８抗性细胞，即Ｐ８１５Ｓ细胞。斑点杂交和免疫组化实验分别证实Ｐ８１５Ｓ细胞内有ＨＢＶＳ基因的存在；Ｐ８１５Ｓ细胞浆内和膜上有ＨＢｓＡｇ的表达。表明了Ｐ８１５Ｓ细胞可作为体外检测ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠ＨＢｓＡｇ特异性ＣＴＬ的靶细胞。进一步对Ｐ８１５Ｓ细胞成功地进行５１Ｃｒ标记，以及标记靶细胞５１Ｃｒ最大释放值和自然释放值的测定表明：利用５１Ｃｒ释放法体外检测近交系小鼠（ＢＡＬＢ／Ｃ）ＨＢｓＡｇ特异性ＣＴＬ功能的方法被建立。     

乙型肝炎病毒c抗原特异性T细胞系的建立及CTL克隆的筛选

目的：建立乙型肝炎病毒（HBV）抗原特异性T细胞系,并筛选得到抗原肽特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）克隆。方法通过流式细胞染色方法鉴定出1例急性乙型肝炎患者的人类白细胞分化抗原（HLA）为HLA‐A2型,分离患者外周血单个核淋巴细胞（PBMCs）;用重组人HBVc抗原（HBcAg）刺激PBMCs建立抗原特异性T细胞系;用HBcAg抗原肽刺激和有限稀释方法,筛选出HBcAg抗原肽特异性CTL克隆;以固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）和乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒试验对HBcAg特异性T细胞系和CTL克隆进行功能鉴定。结果建系后HBcAg特异性T细胞明显得到富集,有限稀释后获得15株CTL克隆,其中14株表现出明显的HBcAg抗体肽特异性,包括抗原肽Core18‐27特异性CTL克隆8株,抗原肽Core107‐115特异性CTL克隆4株,另外2株CTL克隆对2条HBcAg抗原肽有交叉反应性。结论成功建立HBcAg抗原特异性T细胞系和CTL克隆,为后续试验奠定基础。     

HPV18E7抗原T细胞表位的鉴定及CD4+T淋巴细胞的免疫反应

目的 初步鉴定人乳头瘤病毒(HPV)18型E7抗原的辅助T淋巴细胞(Th)表位及CD4+T淋巴细胞的免疫反应.方法 以免疫磁珠进一步分离HLA-DRB1*0301阳性健康人外周血单核细胞(PBMC)中的CD4+T淋巴细胞,流式细胞仪鉴定细胞纯度,用之前实验中已获得的3个HPV18 E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th表位刺激外周血CD4+T淋巴细胞,用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测CD4+T淋巴细胞增殖活性.ELISA方法分析表位刺激CD4+T淋巴细胞分泌的细胞因子.结果 多肽P1(HPV18E780-94)在体外刺激CD4+T淋巴细胞后能够有效诱导CD4+T淋巴细胞增殖,P1组与阴性对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01),多肽P1 (HPV18 E780-94)刺激CD4+T淋巴细胞分泌IFN-γ,P1组与阴性对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 P1(HPV18 E780-94)可能为HPV18 E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th表位.     

癫痫患者T淋巴细胞亚群和泌乳素的测定

为探讨神经内分泌免疫调节功能变化在癫痫发病中的作用，采用放射免疫法和ＡＰＡＡＰ法对４６例癫痫患者和３０例健康对照组血清泌乳素（ＰＲＬ）及外周血Ｔ淋巴细胞亚群进行了检测。结果显示：癫痫患者ＣＤ４细胞及ＣＤ４／ＣＤ８比值明显低于对照组（Ｐ＜００１，Ｐ＜０００１）；ＣＤ８细胞和ＰＲＬ含量显著高于对照组（Ｐ＜０００１，Ｐ＜００１），且上述指标的改变与癫痫的发作频率有关；ＰＲＬ与ＣＤ４／ＣＤ８之间呈显著负相关。提示：神经内分泌免疫调节功能失衡在癫痫的发病机制中起着重要的作用     

T淋巴细胞活化与蛋氨酸腺苷转移酶的表达

目的 :检测人外周血 T细胞 (PBT)在不同刺激时蛋氨酸腺苷转移酶 (MAT) m RNA的表达和细胞内 MAT活性的变化。 方法 :半定量 PCR和 MAT酶活性检测法。 结果 :人 PBT只表达 MAT- 。经 IL - 2、PHA和抗 CD3抗体刺激后 ,人PBT MAT- m RNA的表达分别增加 (8.9± 2 .1)、(7.7± 1.9)和 (8.0± 1.8)倍 ,表达高峰分别出现在刺激后 8、4和 8h;MAT- 活性在 48h内持续升高 ,分别是未刺激时的 4、3.9和 3.3倍。 S-腺苷蛋氨酸 (SAM)能低水平增加人 T细胞产生的IL - 2和 IFN,0 .1m g/ ml SAM能反馈抑制 PHA和抗 CD3抗体诱导的 MAT- 的表达和活性 ,以及 PHA和抗 CD3抗体诱导的 IL - 2和 IFN产生 ,但对细胞增殖无影响。结论 :MAT参与 T细胞的活化过程 ,大剂量 SAM可能通过对细胞内物质的过甲基化抑制 PHA和抗 CD3抗体介导的 T细胞活化。     

雷公藤对重症肌无力外周血T淋巴细胞亚群的影响

目的：探讨雷公藤对重症肌无力（MG）的免疫调节机制。方法：将40例MG患者随机分为雷公藤治疗组和非治疗组。观察两组治疗前后与正常对照组外周血T淋巴细胞亚群的分布。结果：雷公藤治疗和非治疗的MG组治疗前外周血中CD3^＋、CD8^＋细胞较正常对照组明显降低。CD4^＋与正常对照组差别无显著性，CD4^＋／CD8^＋比值较正常对照组显著升高；雷公藤治疗组治疗前后外周血中CD3^＋无明显差别，CD4^＋较治疗前明显降低，CD8^＋明显增加，CD4^＋／CD8^＋比值则显著降低，而非雷公藤治疗组治疗前后外周血中CD3^＋、CD4^＋、CD8^＋、CD4^＋／CD8^＋比值无显著变化。结论：雷公藤治疗MG的免疫抑制机制可能是通过调节T淋巴细胞亚群分布而发挥作用。     

闭合性创伤小鼠巨噬细胞对T淋巴细胞增殖的影响

本实验利用小鼠闭合性创伤模型研究了创伤后巨噬细胞对Ｔ淋巴细胞增殖的调节作用，并初步探讨了其作用机理。结果显示：创伤后１、２、４、７、１０天Ｔ淋巴细胞转化活性均明显低于正常，伤后巨噬细胞对Ｔ淋巴细胞转化活笥的抑制作用增强，双伤后１、２、４ｄ最为明显。伤后巨噬细胞产生白细胞介素１（ＩＬ－１）的能力无明显变化，但产生肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）和前列腺素Ｅ２（ＰＧＥ２）的能力却明显增强。体外应用消炎痛可以阻断     

有丝分裂原体外诱导T细胞亚群条件的探讨

本文采用T淋巴细胞~3H-TdR掺入量,培养细胞总数及CD_4和CD_8阳性细胞百分率作为检测指标,观察了PHA和ConA体外诱导T淋巴细胞反应的有关条件。结果表明,PHA或ConA使T淋巴细胞反应达到高峰或从反应低水平进入持续高水平的诱导时间均为5天,诱导浓度,PHA为40μg/ml,ConA为10μg/ml。同时还观察到PHA诱导细胞中以CD_4阳性细胞为主,ConA诱导细胞中则以CD_8阳性细胞为主。     

T淋巴细胞产生的应激免疫抑制蛋白

综述应激免疫抑制蛋白（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆｓｔｒｅｓｓ,ＩＳＰＳ）的研究概况和进展。大鼠和小鼠在应激条件下,通过中枢神经系统的作用,由外周Ｔ淋巴细胞产生了一种大分子蛋白质,对某些免疫功能具有抑制作用。称之为应激免疫抑制蛋白。它具有以下两个特点,一是相对分子质量很大,不像是已知的细胞因子、干扰素、肽类激素、神经肽等。二是它的独特生成机制。它是在应激条件下,通过中枢神经系统的作用,再以交感神经为介导,通过释放去甲肾上腺素,在Ｔ淋巴细胞生成的。这种生成方式尚未见到类似的报道。     

T细胞免疫功能变化对严重烧伤病人的影响及调节机制

目的研究T淋巴细胞免疫功能的变化对严重烧伤病人的影响及机制。方法选择35例严重烧伤病人,分为脓毒症组（20例）和非脓毒症组（15例）。分别于两组患者伤后1d、5d、10d、15d、20d、25d采集外周静脉血分离T淋巴细胞。方法采用放射免疫法检测白细胞介素2、4、6、8（IL-2、IL-4、IL-6、IL-8）、TNF-α的水平,通过流式细胞仪检测CD4＋／CD8＋T淋巴细胞的百分率及其凋亡率。结果与非脓毒症组比较,脓毒症组患者伤后1d、5d、10d、15d、20d、25dT淋巴细胞的TNF和IL-2、IL-4、IL-6、IL-8的分泌水平均显著升高（P〈0．05或P〈0．01）,两指标呈显著正相关（r=0．78,P〈0．01）。伤后1d、5d、10d、15d、20d、25d,脓毒症组患者CD4＋／CD8＋T淋巴细胞的百分率明显低于非脓毒症组,而其凋亡率呈相反趋势（P〈0．05或P〈0．01）,两指标呈显著负相关（r=0．73,P〈0．05）。结论严重烧伤后,T淋巴细胞免疫功能持续处于抑制状态;T淋巴细胞凋亡参与了脓毒症细胞免疫素乱的病理生理过程。     

体外联合培养条件下小鼠睾丸足细胞诱导成熟T淋巴细胞凋亡

目的 :探讨体外联合培养条件下睾丸足细胞能否诱导 T淋巴细胞凋亡。方法 :用 TU NEL 标记、核酸电泳、电镜、流式细胞术检测对照组 (T淋巴细胞 )、A组 (T淋巴细胞 +培养睾丸足细胞 2 4h培养基上清 )、B组 (T淋巴细胞 +睾丸足细胞 )等 3组中小鼠成熟 T淋巴细胞的凋亡及其数量的变化。结果 :3组 T淋巴细胞在电镜下均可见细胞染色质浓集 ,核固缩裂解 ,凋亡小体形成 ;TUNEL 标记见部分细胞核染色呈深蓝色 ;核酸电泳出现典型 DNA梯状带 ;流式细胞术检测 A,B两组 T淋巴细胞凋亡量均明显高于对照组 (P<0 .0 1) ,B组 T淋巴细胞凋亡数量显著高于 A组 (P<0 .0 1)。 结论 :体外培养条件下小鼠睾丸足细胞能够诱导成熟 T淋巴细胞凋亡。     

抗原致敏树突细胞激活细胞毒性T淋巴细胞的体外抗肿瘤作用

目的 利用新型诱导剂钙离子载体(CI)A23187联合重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)体外诱导人外周血单核细胞(PBMC)生成树突细胞(DC),观察DC刺激细胞毒性T细胞(CTL)对人白血病细胞K562细胞产生的特异性杀伤作用.方法 采用密度梯度离心法及黏附法分离出PBMC,分2组培养:传统方法组,加人rhGM-CSF+重组人白细胞介素4+重组人肿瘤坏死因子-α;新型诱导剂组,加入rhGM-CSF+CI A23187.培养开始前,予K562细胞冻融抗原致敏,培养96 h后收集负载抗原的DC.光镜观察细胞形态的变化;流式细胞仪检测DC细胞的表面标志;四甲基偶氮唑盐比色法检测各组DC刺激同种异体外周血T细胞增殖的能力、DC对K562细胞的抑制作用和DC激活的CTL细胞对K562细胞的杀伤作用.结果 与传统方法相比,A23187联合rhGM-CSF 诱导培养的DC具有更加典型的树突形态;DC 表面分子CD83、CD1a、CD86、CD40表达(45.2%±1.8%、31.5%±3.9%、40.1%±7.8%、36.4%±6.3%)较传统方法组(16.9%±1.3%、20.4%±3.4%、26.5%±2.2%、22.3%±3.0%)明显高(均P<0.05),且CD14表达(5.7%±0.8%比19.0%±1.6%)明显低(P<0.05);负载K562细胞冻融抗原后的DC具有明显刺激同种异体T细胞增殖作用;对K562细胞有明显抑制作用,效靶比为1:1及10:1时,抑瘤率分别为(25.3±3.8)%比(15.6±2.4)%、(35.6±5.2)%比(22.9±3.2)%(均P<0.05);刺激的CTL对K562细胞有明显的杀伤作用,效靶比为10:1及40:1时,杀瘤率分别为(44.3±6.2)%比(29.9±2.8)%、(61.0±5.2)%比(43.1±4.8)%(均P<0.05).结论 新型诱导剂CI A23187联合rhGM-CSF能更有效地诱导PBMC生成强效成熟DC,K562细胞冻融抗原冲击该DC激活CTL能够获得较强的杀伤K562细胞的能力.