CPB-ST融合基因的构建及表达研究

用限制性核酸内切酶ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ双酶切含有大肠杆菌耐热性肠毒素ＳＴ１前体蛋白基因的质粒ｐＸＳＴ１，回收３２５ｂｐ的ＳＴ基因片段，然后，通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶将其定向连接于事先经同样的双酶切处理的带有产气荚膜梭菌β－毒素基因（ＣＰＢ）的重组质粒ｐＥＣＢ２中ＣＰＢ基因的下降，转化受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中，经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ酶切反应鉴定重组质粒，得到了理想重组质粒ｐＥＣＢ－ＳＴ１。重组菌株Ｂｌ２１（ＤＥ３）（ｐＥＣＢ－ＳＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后，其表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｉｎｇ及ＥＬＩＳＡ检测，结果表明重组菌株可以表达ＣＰＢ－ＳＴ融合蛋白，而且该融合蛋白无天然β－毒素和ＳＴ１的生物毒性。     

黄曲霉毒素B1在人支气管细胞中的代谢与细胞毒性

流行病学研究表明吸入被黄曲霉毒素Ｂ1(ＡＦＢ1)污染谷物的粉尘与发生肺癌的危险性增加有关 ,但是ＡＦＢ1在人肺中的活化与代谢机制尚不明确。本研究以ＳＶ40永生化的人支气管上皮细胞系 (ＢＥＡＳ 2Ｂ)为对照细胞 ,通过ｃＤＮＡ转染得到分别表达人细胞色素Ｐ450 1Ａ2 (Ｂ ＣＭＶ1Ａ2 )和人细胞色素Ｐ450 3Ａ4(Ｂ3Ａ4)的两个细胞系 ,以比较ＡＦＢ1在人肺细胞中的活化与细胞毒性。在含ＬＨＣ 9的Ｔ75组织培养瓶中培养ＢＥＡＳ 2Ｂ细胞 ,保持温度为 3 7℃ ,ＣＯ2 浓度为5%。采用竞争性定量ＲＴ ＰＣＲ法对ＣＹＰ表达进行定量 ,ＲＴ ＰＣＲ…     

产气荚膜梭菌β-毒素基因的克隆及CPB-ST融合基因的构建

用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术，从Ｂ型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了９３０ｂｐ的β－毒素基因。用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ对ＰＣＲ产物进行双酶切处理，然后，通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶将其定向连接于事先经同样的双酶切处理的载体质粒ｐＥＴ－２８Ｃ（＋）的多克隆位点，转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切分析和ＰＣＲ扩增检测。证明重组质粒ｐＥＣＢ２中含有产气荚膜梭菌的β－毒素基因。经核苷酸序列分析，明确了克隆的β－毒素基因在重组质粒中的连接向位和阅读框架是正确的。利用已构建的另一重组质粒ｐＸＳＴ１（带有肠毒素性大肠杆菌的耐热性肠毒素ＳＴ基因），通过ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ双酶切处理，将切下的ＳＴ基因片段定向连接到ｐＥＣＢ２重组质粒中ＣＰＢ基因的下游。经特定酶切分析鉴定，得到了理想重组子质粒ｐＥＣＢＳＴ１，ＣＰＢ－ＳＴ融合基因在重组质粒ｐＥＣＴ－ＳＴ１中的连接向位是正确的     

中国仓鼠肺成纤维细胞过氧化适应及其机理

目的为研究真核细胞过氧化适应反应及其可能机理。方法在中国仓鼠肺成纤维细胞（ＣＨＬ）上，通过低剂量Ｈ２Ｏ２预处理，观察细胞和ＤＮＡ对高剂量Ｈ２Ｏ２再处理的适应反应，同时测定ＣＡＴ酶和ＰＡＲＰ的变化及其在适应ＤＮＡ断裂中的作用。结果在细胞活力和ＤＮＡ断裂水平上均观察到非致死性适应反应，然而这两种水平的适应模式（条件）有所不同，提示两者可能存在不同的诱导适应的途径。低剂量Ｈ２Ｏ２可诱导ＣＡＴ酶活性增高，并与抑制ＤＮＡ断裂的适应效应具有相关性（ｒ＝０．９５，Ｐ＜０．０５），同时ＰＡＲＰ阻断剂３氨基苯胺（３ＡＢ）可明显抑制ＤＮＡ断裂水平的适应反应。结论ＣＨＬ细胞系存在细胞活力变化和ＤＮＡ断裂的过氧化非致死性适应。ＣＡＴ和ＰＡＲＰ参与过氧化ＤＮＡ断裂的适应诱导     

前白蛋白cDNA的克隆及真核表达载体的构建

为构建血浆前白蛋白的真核表达载体，采用逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）从水囊引产的胎儿肝组织中得到ＰＡｃＤＮＡ。将该序列克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体中，再转入真核表达载体ｐＣＤＮＡ３．１（＋）。限制性内切酶消化筛选正向插入重组体。重组体经过序列分析证实，ｐＣＤＮＡ３－ＰＡ中正向插入ＰＡ全长ｃＤＮＡ。     

SAM肝细胞色素P450 3A对衰老的作用

为探讨衰老与细胞色素Ｐ４５０３Ａ（ＣＹＰ３Ａ）活性的关系,用红霉素Ｎ－脱甲酶活性测定法分别检测了ＳＡＭ－Ｒ１、ＳＡＭ－Ｐ１和ＳＡＭ－Ｐ８三组衰老加速鼠（ＳＡＭ）中肝微粒体细胞色素Ｐ４５０３Ａ的活性,每组动物分为７、１３、３６周龄组。结果发现ＳＡＭ随年龄增长ＣＹＰ３Ａ的活性均降低,１３周龄组尤为显著,ＳＡＭ－Ｒ１组ＣＹＰ３Ａ活性下降约７２％（ｔ＝２６１,Ｐ＜００２）;ＳＡＭ－Ｐ１组ＣＹＰ３Ａ活性下降约７３％（ｔ＝２．７４,Ｐ＜００２）;ＳＡＭ－Ｐ８组中ＣＹＰ３Ａ活性降低约８６％（ｔ＝３．１４,ｐ＜０．００５）。ＳＡＭ－Ｐ１组ＣＹＰ３Ａ活性３６周龄比３周龄组下降约３５％,呈缓慢进行;ＳＡＭ－Ｒ１和ＳＡＭ－Ｐ８组中１３至３６周龄组均无明显变化。提示细胞色素Ｐ４５０３Ａ对衰老有重要影响作用。     

三种危险因素的协同致肝癌作用

为分析黄曲霉毒素Ｂ１（ＡＦＢ１）、乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）和丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）在致人原发性肝细胞癌（ＨＣＣ）时可能的协同作用，对同份人ＨＣＣ组织分别采用高效液相色谱法、嵌套式ＰＣＲ及逆转录嵌套式ＰＣＲ检测ＡＦＢ１、ＨＢＶＤＮＡ和ＨＣＶＲＮＡ，检出率分别为６７．７％（２１／３１）、８８．２％（６０／６８）和１３．２％（９／６８）。其中，ＡＦＢ１和ＨＢＶＤＮＡ重叠检出率为５８．１％（１８／３１），ＨＢＶＤＮＡ和ＨＣＶＲＮＡ重叠检出率为８．８％（６／６８），由４例ＨＣＣ患者重叠检出ＡＦＢ１、ＨＢＶＤＮＡ和ＨＣＶＲＮＡ；同步检测对照组，３种危险因素全部阴性。结果表明，３种危险因素均与人类肝癌直接相关，并且存在着协同致癌效应     

转基因细胞CHL－2B6的建立和在遗传毒理试验代谢活化中的应用

应用稳定表达ＣＹＰ２Ｂ６的转基因细胞系ＣＨＬ－２Ｂ６对一组前致突变物／致癌物进行双核微核试验，同时以母细胞系ＣＨＬ为对照，结果表明：５种前致突变物ＮＮＫ、ＤＥＮ、ＮＭ、ＭＢＩ和ＣＰ均能诱导ＣＨＬ－２Ｂ６细胞的徽核率显著增加，其中ＮＮＫ、ＣＰ和ＡＦＢ１具有剂量－反应关系，在最高受试浓度微核率约增加３～８倍。显示转基因细胞系ＣＨＬ－２Ｂ６在化学致癌物的遗传毒理学研究方面具有重要的应用价值．     

杂色曲霉素对人胚胃粘膜细胞p53基因致突变研究

为探讨杂色曲霉素（ＳＴ）的致癌作用，运用细胞培养、流式细胞术（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＦＣＭ）和银染ＰＣＲ－ＳＳＣＰ等方法研究了不同浓度的ＳＴ（１ｍｇ／Ｌ和３ｍｇ／Ｌ）诱发体外培养的人胚胃粘膜细胞恶性转化情况以及此过程中抑癌基因ｐ５３在蛋白及基因水平上的变化。结果表明，ＳＴ处理４周后处理细胞增殖旺盛，并出现恶性转化灶；ＳＴ处理２４周后处理细胞可在软琼脂上形成细胞集落（ＳＴ１ｍｇ／Ｌ和３ｍｇ／Ｌ组每皿细胞集落数平均分别为１５和１７个）；ＦＣＭ检测结果表明，ＳＴ处理的细胞细胞增殖指数增高，ＤＮＡ含量增高，出现ＤＮＡ异倍体，突变型抑癌基因ｐ５３蛋白表达明显增强。ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析结果显示，ＳＴ处理２２周后，处理细胞ｐ５３第８外显子出现异常泳动带型。本研究进一步证实了ＳＴ对体外培养的人胚胃粘膜细胞的致癌作用     

苯并（a）芘代谢产物诱发BALB／3T3细胞程序外DNA合成的研究

为了解苯并（ａ）芘（ＢａＰ）代谢产物对哺乳动物细胞ＤＮＡ的损伤作用，本实验采用单标记和双标记法，分别检测４种苯并（ａ）芘代谢产物（ａｎｔｉ－ＢＰＤＥ，ｓｙｎ－ＢＰＤＥ，３－ＯＨ－ＢＰ和９－ＯＨ－ＢＰ）对ＢＡＬＢ／３Ｔ３细胞ＤＮＡ合成和程序外ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）的影响。结果表明：ａｎｔｉ－ＢＰＤＥ、ｓｙｎ－ＢＰＤＥ、Ｅ－ＯＨ－ＢＰ和９－ＯＨ－ＢＰ均在不同程度上使ＢＡＬＢ／３Ｔ３细胞ＤＮＡ合成增加；但     

Anticarcinogenic effect of probiotic fermented milk and chlorophyllin on aflatoxin-B₁-induced liver carcinogenesis in rats

The present investigation was carried out to evaluate the hepatoprotective effect of probiotic fermented milk (FM) containing Lactobacillus rhamnosus GG and Lactobacillus casei strain Shirota, alone as well as in combination with chlorophyllin (CHL) as an antioxidant agent in male Wistar rats administered aflatoxin-B? (AFB?). AFB? was injected intraperitoneally at the rate of 450 μg/kg body weight per animal twice a week for 6 weeks, maintaining an equal time interval between the two consecutive AFB? administrations. A total of 125 male Wistar rats were randomly allocated to five groups, each group having twenty-five animals. Group I was offered FM containing L. rhamnosus GG and L. casei strain Shirota. Group II was administered AFB1 and served as the control group; group III was administered FM-AFB?, in which besides administering AFB?, FM was also offered. Group IV was offered CHL and AFB?, and group V was offered both FM and CHL along with AFB?. The rats were euthanised at the 15th and 25th week of the experiment and examined for the biochemical and hepatopathological profile. A significant reduction in thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS) was observed in the FM-CHL-AFB? group compared with the AFB1 control group. FM alone or in combination with CHL was found to show a significant (P < 0·05) hepatoprotective effect by lowering the levels of TBARS and by enhancing the activities of antioxidant enzymes such as glutathione peroxidase, superoxide dismutase, catalase and glutathione-S-transferase, indicating that probiotic FM alone or in combination with CHL possesses a potent protective effect against AFB?-induced hepatic damage.     

真核表达载体pcDNA3．1-RASSF1的构建及其对肝癌细胞凋亡的影响

目的构建pcDNA3．1－RASSFl真核表达载体,并检测其对肝癌细胞系HepG2凋亡的影响。方法应用聚合酶链反应技术从人RASSFlcDNA中扩增出RASSF1基因后,以内切酶XhoI和EcoRI进行双酶切,将其克隆人用相同酶处理的载体pcDNA3．1;将重组质粒pcDNA3．1－RASSF1转染肝癌HepG2细胞,应用Westernblot法检测RASSF1的表达水平;用AnnexinV／PI法检测细胞的凋亡情况。结果酶切和测序结果表明,重组质粒pcDNA3．1．RASSF1构建成功;Westernblot法结果表明转染pcDNA3．1-RASSF1后HepG2细胞中RASSFl表达升高;AnnexinV／PI法用流式细胞术检测凋亡,空白组、pcDNA3．1组和pcDNA3．1-RASSFl组HepG2细胞的凋亡率分别为（5．8±0．42）％、（7．48±0．68）％和（35．1±3．15）％。结论真核表达载体pcDNA3．1-RASSF1构建成功;RASSF1蛋白在HepG2细胞中高表达,并促进细胞凋亡。     

Effect of xenoestrogen exposure on the expression of cytochrome P450 isoforms in rainbow trout liver

We studied the estrogenic effects of model chemicals in one-year-old juvenile rainbow trout. Methoxychlor (20 mg/kg), diethylstilbestrol (15 mg/kg), 4-tert-octylphenol (25 and 50 mg/kg), and biochanin A (25 and 50 mg/kg) were injected intraperitoneally on days 1, 4, and 7. Fish were sacrificed on day 9 and examined for multiple biomarkers. All of the test chemicals caused increases in plasma vitellogenin levels, a biomarker of estrogenicity. Treatment with the xenoestrogens decreased hepatic lauric acid hydroxylase activity and, as shown by Western blots, also generally reduced expression of hepatic cytochrome P450s 2K1 (CYP2K1), 2M1 (CYP2M1), and 3A27 (CYP3A27) at the protein level. Both doses of biochanin A also significantly induced P4501A (CYPIA) and greatly increased hepatic 7-ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) activity. These findings suggest that methoxychlor, diethylstilbestrol, 4-tert-octylphenol, and biochanin A were all estrogenic and mimicked 17beta-estradiol (E2) in repressing the expression of cytochrome P450 isoforms (CYP2KI, CYP2M1, and CYP3A27) in the rainbow trout liver. Additionally, biochanin A was found to induce CYPIA in this fish species.     

携带人肿瘤抑素Tumstatin基因的重组腺相关病毒载体的构建及其在乳腺癌细胞中的表达研究

目的构建携带人肿瘤抑素Tumstatin基因的重组腺相关病毒载体,研究其在乳腺癌细胞MCF-7中的表达。方法以人胚肾293细胞为材料,用RT-PCR方法获取人肿瘤抑素Tumstatin基因,将其克隆入pAAV-MCS载体中形成重组载体pAAV-Tum质粒。用脂质体介导法将重组载体导入乳腺癌细胞株(MCF-7)建立一株稳定的表达Tumstatin基因的乳腺癌细胞株MCF/AAV-Tum,并用RT-PCR检测该细胞系中Tumstatin基因的表达。结果成功构建了pAAV-Tum重组腺相关病毒载体,筛选出乳腺癌细胞株MCF/AAV-Tum,该细胞能表达Tumstatin基因。结论构建的pAAV-Tum重组载体能在MCF-7细胞中表达,为其后的肿瘤抗血管生成治疗研究奠定了基础。     

人细胞间黏附分子1cDNA的克隆及表达载体的构建

目的 构建人细胞间黏附分子-1真核表达重组体pcDNA3．1hisB-ICAM-1。方法 设计、合成ICAM-1基因序列特异性引物，从肝癌组织中提取总RNA，以此为模板经RT-CR扩增人ICAM-1的cDNA片段；然后将其克隆到pGEM-T Easy Vector，构建中介重组体(pGEM-ICAM-1)，再克隆，构建真核表达重组体pcDNA3．1HisB-ICAM-1，经菌落PCR和限制性酶切有目的片段出现，进行DNA序列分析。结果 RT-PER扩增得到人成熟ICAM-1的cDNA片段大小为1622bp，中介重组体(pGEM-ICAM-1)，酶切后与真核表达载体连接，根据酶切鉴定和DNA序列分析得到真核表达重组体pcDNA3.1HisB-ICAM-1；结论：成功构建了真核表达重组体pcDNA3．1HisB-ICAM-1。     

A recombinant replication-defective human adenovirus type 3: a vaccine candidate

Human adenovirus type 3 (HAdV-3) cause respiratory infections globally. There is no safe and efficient HAdV-3 vaccine thus far. In this report, a replication-defective human adenovirus type 3 was constructed by deletion of the whole E1 gene. A HEp-2 cell-based cell line designated HEp-2/E1 was generated and was shown to complement the function of E1 deleted mutant. A partial genome (9.5-100 mu) of HAdV-3 was cloned into pPolyII vector to be a backbone plasmid. A shuttle vector carrying eGFP gene was also constructed. The backbone and shuttle plasmids were co-transfected into the HEp-2/E1 cell line and 293 cell line separately. Typical cytopathic effect (CPE) appeared in the HEp-2/E1, but not in 293 cells 2 weeks after transfection. Wild-type HAdV-3 is neutralized by the sera from the mice immunized with the recombinant HAdV-3. The results demonstrated that the recombinant adenovirus type 3 may serve as a HAdV-3 vaccine candidate.     

人β-防御素-2基因表达及其抗菌活性

目的获得人β-防御素-2（humanβ-defensin-2,hBD2）基因并构建其真核表达载体,转染小鼠纤维母细胞（L929）,检测其表达,观察hBD2的体外抗菌活性。方法采用逆转录（RT）-PCR方法从人宫颈癌组织获取人β-防御素-2基因,然后进行克隆扩增,重组真核表达载体pCAGG-hBD2,通过磷酸钙共沉淀法将pCAGG-hBD2导入L929细胞,并用RT-PCR法检测hBD2的表达,用Kirby-Bauer纸片扩散法检测其抗菌活性。结果RT-PCR凝胶电泳及测序分析的结果显示,所克隆的hBD2基因序列正确,并成功构建了真核表达载体pCAGG-hBD2。Kirby-Bauer纸片法显示,hBD2对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌有明显的杀灭效应。结论转染pCAGG-hBD2的L929细胞能高效表达hBD2,其对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌有杀灭作用。     

单纯疱疹病毒II型gD糖蛋白在真核细胞中的表达

目的:构建真核表达质粒pcDNA3/gD,并在体外COS-7细胞中进行表达。方法:体外PCR扩增出gD糖蛋白基因,克隆入真核表达质粒pcDNA3中。PCR、酶切和测序证实插入的gD基因正确后,转染COS-7细胞,用原位ELISA鉴定表达蛋白。结果:构建了pcDNA3/gD真核表达质粒,经原位ELISA证实,转染COS-7细胞表达的gD蛋白能和gD单克隆抗体ID3和DL11结合,证明该蛋白具有天然gD蛋白的抗原性。结论:构建的重组真核表达质粒pcDNA3/gD能够在COS-7细胞中表达。     

用cDNA微阵列芯片检测苯中毒细胞色素P450基因表达差异

目的 利用cDNA芯片技术检测苯中毒细胞色素P450的基因表达谱差异。方法 选取7名诊断为不同程度接苯中毒的工人（疑似1例、轻度2例、中度2例和重度2例）,并设年龄、工龄匹配的健康者做对照,分离外周血白细胞,用Trizol试剂盒抽提总RNA,纯化、逆转录生成cDNA产物,分别用荧光染料Cy3和Cy5标记后与含32条细胞色素P450基因的微阵列芯片进行杂交。结果 共有6条细胞色素P450基因呈差异性表达,包括CYP4F3、CYP1A1、CYP27A1、CYP1B1、CYP286、CYP51,其中CYP4F3基因在所有苯中毒工人中均表达上调。结论 苯中毒工人细胞色素P450基因的表达异常可能在苯诱导的血液毒性中起重要作用．     

人畸胎瘤衍化生长因子原核表达载体的构建及表达

目的:构建人畸胎瘤衍化生长因子(teratocarcinoma-derived growth factor-1,TDGF-1)原核表达载体,进一步探讨其生物学作用及机制。方法:从人肝癌细胞系HepG2中提取总RNA,利用TDGF-1特异性引物通过RT-PCR方法扩增TDGF-1 cDNA,克隆入pHB载体中,构建重组载体pHB-TDGF-1。将重组载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,并通过SDS-PAGE及免疫印迹法对表达产物进行鉴定。结果:酶切及测序结果显示,重组质粒构建成功;SDS-PAGE及免疫印迹结果显示,所构建的重组载体可在大肠杆菌中高效表达TDGF-1。结论:该研究成功构建了人TDGF-1原核表达载体,并能够在大肠杆菌中有效表达TDGF-1,为进一步研究TDGF-1的生物学功能及其机制奠定了基础。