应用PCR方法检定单核细胞增多性李斯特菌

目的建立单核细胞增多性李斯特菌（单增李斯特菌）快速、敏感、特异的ＰＣＲ诊断方法。方法选取ｈｌｙＡ基因作为靶序列设计一对引物，用该引物对５４株标准李斯特菌和２１株无关菌进行ＰＣＲ扩增，得到进一步验证。采用ＰＣＲ和常规鉴定方法同时对从国内食品分离的３３株李斯特菌进行鉴定。结果可扩增含有保守ＨｉｎｄⅢ切点的７４３ｂｐ片段。表现出极好的单增李斯特菌种特异性。纯培养的检测极限为５５个菌。发现其中１８株用两种方法都鉴定为单增李斯特菌，两种方法的结果完全符合。当用于食物标本检测时，ＰＣＲ反应遭强烈抑制。经过２５小时的增菌培养，对培养物进行化学抽提、纯化的菌体经加热裂解后直接用作ＰＣＲ反应模板，可使抑制作用大大降低。每毫升牛奶人工接种４个菌可用该法特异检出。结论建立了ＰＣＲ方法，可初步用于单增李斯特菌的快速、特异、敏感诊断。     

单核细胞增生李斯特菌PCR鉴定技术的研究

目的建立单核细胞增生李斯特菌PCR鉴定技术.方法选择Hly Inl基因设计扩展片段分别为300～400bp、600～700bp的二对特异性引物,进行PCR扩增.结果单增李斯特菌标准菌株及本实验室分离保存的单增李斯特菌均扩增出两条明显条带,其它食品中常见致病菌及非单核细胞增生李斯特菌均不见扩增条带.52株李斯特菌生化符合菌中,有30株菌同时扩增出两条明显条带,与Mini-VIDSA测定法比较,两者符合率达92.31%.结论本实验建立的PCR鉴定技术为一种简便、快速、敏感、特异的单增李斯特菌鉴定方法.     

食品中单核细胞增生李斯特菌PCR快速检测方法

[目的]建立食品中单核细胞增生李斯特菌的快速、敏感、特异的PCR检测方法。[方法]选择Hly基因作为靶序列设计一对引物，用该引物对单增李斯特菌和10株非单增李斯特菌进行PCR扩增，并且用此方法对30份食品进行检测。[结果]扩增片断表现出极好的单增李斯特菌特异性，最低检出限为190cfu/ml。[结论]本实验建立的PCR检测方法为一种简便、快速、敏感、特异的单增李斯特菌检测方法。     

焦磷酸测序法检测单增李斯特菌

目的:建立单增李斯特菌的焦磷酸测序检测方法。方法:通过焦磷酸测序法对hly基因的保守片段进行测序来检测单增李斯特菌,从基因序列上对单增李斯特菌进行鉴定。结果:焦磷酸测序法可准确鉴定94株单增李斯特菌。结论:本方法可用于单增李斯特菌的检测鉴定,具有准确、快速和实时等优点,可满足对单增李斯特菌快速、高通量检测的需求。     

通州区6类食品单增李斯特菌污染状况及分子流行病学特征调查研究

目的:了解通州区6类食品中单增李斯特菌的污染情况,探讨所污染菌株携带的三个毒力基因(hlyA、iap、prfA)的状况和DNA随机扩增多态性PCR分型情况。方法:依据国标方法,采用全自动微生物分析仪和API Listeria试剂条鉴定系统对样本进行单增李斯特菌分离和生化鉴定;采用聚合酶链反应检测实验菌株携带毒力因子的情况,使用随机引物PCR的方法对菌株进行分子分型。结果:从通州区共采集6类食品样品121件,检出单增李斯特菌18株,检出率为14.9%;18株实验菌株均携带单核细胞增多性李斯特菌特异的毒力因子;随机引物PCR方法将实验菌株分成6个随机引物PCR型别。结论:本区食品中单增李斯特菌污染较为严重,且毒力基因prfA、hly、iap同时存在,说明有潜在的致病能力,应引起相关部门关注;通州区在不同时间、不同地点分离的单增李斯特菌其PCR型别差别较大,有多种型别的细菌存在;也可根据PCR分型看出在食品加工过程中存在着内部污染问题。但来源不同的菌株之间PCR分型无关联,无流行趋势。     

单增李斯特菌鉴定方法比较研究

[目的]对单增李斯特菌鉴定方法进行研究。[方法]分别用API检测方法、16SrRNA序列分析法和焦磷酸测序法对17株单核细胞增生李斯特菌进行检测。[结果]3种方法均能准确鉴定单增李斯特菌。[结论]焦磷酸测序方法检测单增李斯特菌特异性强、经济、操作简便、检测快速,为单增李斯特菌的快速、高通量检测提供了一种新的手段。     

单增李斯特菌PCR-ELISA快速检测技术研究

目的建立快速检测单增李斯特菌的PCR-ELISA方法,将其应用于人工污染的食物样品检测。方法根据GenBank数据库资料,应用分子生物学软件DNAMAN6.0和Primer Premier5.0,以单增李斯特菌的致病基因hlyA为基础,选用PCR引物,应用地高辛标记试剂盒,获得单增李斯特菌特异的地高辛标记片段。根据PCR目的片段序列,设计特异性捕获探针,建立了单增李斯特菌PCR-ELISA快速检测方法。应用该方法对不同血清型的单增李斯特菌食品分离株进行了检测,并将PCR方法与PCR-ELISA方法对人工污染单增李斯特菌的牛奶样品的检测敏感性进行了比较。结果应用单增李斯特菌特异的PCR-ELISA方法完成检测约需6h。该方法对单增李斯特菌分离株检测的结果,与国家食源性疾病检测网的鉴定结果100%符合。经过12h的增菌培养,PCR-ELISA方法最低可从25ml样品中检出1CFU,检测敏感性为传统PCR方法的10～100倍。结论建立了单增李斯特菌PCR-ELISA快速检测方法。该方法敏感性高、特异性强、可靠性好,对于提高食源性疾病预警、预测能力,增强检测的时效性和准确性,具有推广应用价值。     

Taq Man-MGB探针Real-timePCR快速检测单增李斯特菌的研究

目的：建立TaqMan—MGB探针Real—time荧光PCR快速检测单增李斯特菌技术。方法：在对单增李斯特菌invA序列进行分析、比较基础上，设计一对特异性TaqMan—MGB探针法引物及探针，通过Real—timePCR反应条件和反应体系的优化，实现对单增李斯特菌的快速检测；用克隆到pMD18-T载体上的李斯特菌invA基因阳参片段及不同菌株、食品标本验证方法的特异性和敏感性。结果：方法的灵敏性高，其循环阈值与模板浓度的对数值具有很好的对应关系，最低可检测57个拷贝数，经18h增菌，可检测低至4．5cfu／ml的细菌；特异性强，检测6株单增李斯特菌标准株和100株单增李斯特菌样品分离株的PCR循环域值（cT值）均小于25，而90株威氏李斯特菌、英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌以及非李斯特菌PCR循环域值（CT值）大于35；快速，最快1h可出结果，实际样品20h可出结果，而常规细菌培养法需要一周以上；对103份速冻米面食品进行检测，13份阳性，与常规方法无显著性差异（P〉0．05）。结论：TaqMan—MGB探针的单增李斯特菌Real—time荧光PCR检测方法具有特异性强，敏感性高，易操作等优点，可推广应用。     

食品中分离的李斯特氏菌的致病基因分析

１９９６—１９９７年作者对全国１２个省市的７类食品共３７４６份进行了李斯特氏菌的污染调查,共分离出李斯特氏菌１６５株。用ＰＣＲ技术对分离菌株中李斯特氏菌的２种主要致病因子李氏溶血素Ｏ和内化素的基因进行了检测,其中５７株仅有内化素基因,２７株同时具有内化素基因和李氏溶血素Ｏ基因。两种致病基因均未检出的共有８１株。本研究说明判断单增李氏菌的主要指标是小鼠毒力试验阳性而不是其溶血反应,同时检测溶血素Ｏ和内化素２种基因对单增李氏菌有鉴别意义。     

四种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立

目的建立一种多重PCR检测方法同时检测食品中沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌。方法参考沙门菌侵袭蛋白A(invA)基因序列,志贺菌侵袭性质粒抗原(ipaH)基因序列,金黄色葡萄球菌引物设计参考耐热核酸酶(nuc)基因序列,单增李斯特菌引物设计参考溶血素蛋白(hly)基因序列设计引物,通过多重PCR对4种食源性致病菌的目的基因进行扩增,并对反应体系进行优化。结果对15株目标菌和17株非目标菌的检测未出现假阳性和假阴性结果,产物分子量与预期一致;4种菌的检测灵敏度分别至少达到10pg/μl;对产物的测序分析表明所得序列与目的基因序列吻合;对319份样品的检测结果显示,其中4份生鲜乳中检出金黄色葡萄球菌,1份生猪肉中检出沙门菌。结论该方法具有良好的检测特异性,可供食源性致病菌的快速检测。     

食品中单增李斯特菌PCR检测方法建立与评价

目的建立单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）快速、敏感、特异的PCR诊断方法。方法采用聚合酶链式反应技术（PCR）特异性扩增单核细胞增生李斯特菌溶血素基因（hlyA），并评价该方法的特异性与敏感性。结果在706bp处出现nuc基因的目的片断，只有单增李斯特菌的目的片段获得扩增，其他菌种扩增均呈阴性；该方法可以检测到3．3ng／L的DNA。结论PCR方法比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏和简便。为食品中单增李斯特菌的快速检测提供了新的手段。     

3种方法鉴定单核细胞增生李斯特菌比较

[目的]采用分子生物学方法(accuprobe和PCR)对传统方法经ATB鉴定为单核细胞增生李斯特菌和疑为单核细胞增生李斯特菌的菌株进行鉴定比较,建立灵敏,快速,可靠的鉴定方法。[方法]对经传统方法结合ATB鉴定分离的菌株(单核细胞增生李斯特菌)分别采用accuprobe和PCR试剂盒进行鉴定比较。[结果]对10株经传统方法结合ATB鉴定的Lm菌(包括疑似Lm菌)经PCR鉴定,3株为阳性,7株为阴性,与accuprobe法鉴定结果一致。[结论]分子生物学方法检测单核细胞增生李斯特菌是对传统方法的有效补充,可用于大批量样品中致病菌的快速鉴定     

食品中肠出血性大肠埃希菌O157:H7的PCR检测

目的建立快速准确检测食品中肠出血性大肠埃希菌O157：H7的方法。方法采用多重聚合酶链式反应技术（MPCR）特异性扩增肠出血性大肠埃希菌O157：H7的STX、rfbE、fliC基因。结果分别在228，378，709bp处扩增出3个目的基因片段，且只有肠出血性大肠埃希菌O157：H7获得扩增，其他菌种扩增均呈阴性。结论PCR方法比传统细菌检测方法更特异、快速、灵敏和简便，为食品中肠出血性大肠埃希菌O157：H7的快速检测提供了新的手段。     

多重实时PCR快速同时检测沙门菌和志贺菌

目的 建立改良分子信标，多重实时PCR同时检测沙门菌和志贺菌的快速方法，应用于食源性致病菌的快速诊断。方法 根据GenBank公布的沙门菌侵袭性基因invA和ssaR基因，分别设计一对引物和改良分子信标探针，用同色荧光标记，用于同体系检测沙门菌。志贺菌根据ipaH基因的保守序列，设计引物和改良分子信标探针，加入沙门菌检测体系中，建立三重实时PCR一改良分子信标检测体系，应用于同时对沙门菌、志贺菌食物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测。结果 改良分子信标一多重实时PCR反应体系DNA灵敏度为69～93fg/μl。菌液灵敏度为32～64CFU／ml或1～2CFu／PCR反应体系，无交叉反应。该反应体系同时检测134株沙门菌和67株志贺菌，均出现特异的荧光信号，两种细菌检测互不干扰。对细菌性食物中毒样本等共1100份同时进行沙门菌和志贺菌检测，569份沙门菌实时PCR阳性，其中551份沙门菌培养阳性；42份志贺菌实时PCR阳性，其中41份志贺菌培养阳性。从样品处理到检测结果仅需时间2h至1d。结论 改良分子信标-多重实时PCR检测体系快速、灵敏度高，特异性强，可用于沙门菌和志贺菌食物中毒的快速诊断，伤寒、痢疾等肠道传染病的初筛及预防医学门诊的健康人群体检，为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

食品中沙门菌实时荧光PCR快速检测方法的研究

目的利用荧光定量PCR技术，建立食品中沙门菌污染的快速敏感特异的检测方法。方法以沙门菌的fimY基因作为靶序列，设计一对引物和探针，以沙门菌菌株提取核酸DNA作为模板，优化引物和探针的浓度比和Mg^2＋浓度，以沙门菌和10种相关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性，并初步应用于样品的检测。结果本研究建立的反应体系在引物和探针的浓度为0．8μmol／L，1．0μmol／L，Mg^2＋浓度为3mmol／L时，具有良好的特异性和敏感性。在10株相关菌株的检测中，除沙门菌出现很好的阳性外，其余菌株均为阴性。在纯菌条件下，定量检测低限33cfu／ml。稳定性分析表明：同一样品重复检测3次Ct值的变异系数均小于5％。检测样品结果显示实时PCR方法较传统方法敏感、快捷、简便。结论该方法特异性强，稳定性高，操作简便快捷，适应食品微生物检验发展需要，具有较大的推广及应用价值。     

PCR方法快速检测食品中的金黄色葡萄球菌

目的建立聚合酶链反应(PCR)方法快速检测牛奶、冰淇淋及肉中的金黄色葡萄球菌(金葡菌)。方法针对金葡菌耐热核酸酶基因(nuc)、纤维蛋白原结合蛋白基因(ClfA)设计并合成2对引物进行PCR扩增,特异的检测金葡菌,并对52株金葡菌和31株非金葡菌进行扩增,验证方法的特异性。在牛奶、冰淇淋及肉中人工污染不同菌量,增菌培养,在不同时间段提取DNA进行PCR扩增,确定该方法在食品中的检出限。结果nuc、ClfA两对引物对金葡菌的检出均有很好的特异性,在3种食品中的检出限均为10cfu/g(ml),全部检测可在24h完成。结论建立了适用于牛奶、冰淇淋及肉中的金葡菌检测的快速、灵敏、特异的PCR方法。     

食品中沙门菌特异性二重聚合酶链反应检测方法的研究

目的建立二重聚合酶链反应(PCR)方法快速检测食品中的沙门菌(Salmonella spp.)。方法以沙门菌特异性基因invA、hilA为靶基因,选择2对引物对16株沙门菌和24株非沙门菌进行扩增,验证二重PCR的特异性。梯度稀释DNA,以不同稀释度的DNA PCR扩增。在猪肉中以不同菌量人工污染,不同增菌时间培养,提取DNA进行PCR扩增。应用该方法检测实际样品。结果以invA、hilA为靶基因的两对引物对沙门菌的检出均有很好的特异性,PCR能检出0.1332pg的沙门菌DNA,人工污染猪肉的检测限为2.5cfu/ml。本研究共检测了53份食品样品,有21份检出了沙门菌。结论建立了适用于肉类、水产品及蛋糕等食品中的沙门菌检测的快速、灵敏、特异的二重PCR方法。     

自贡市食品中单核细胞增生李斯特菌污染状况的调查及药敏结果分析

[目的]调查自贡市食品中单核细胞增生李斯特菌(LM)污染状况及药敏情况。[方法]检测按国标GB/T4789.30-2003程序进行;药敏试验采用Kirby-Bauer法。[结果]2005~2007年于253份食品中共检出LM21株;总污染率为8.3%(21/253)。样品中生畜肉、生禽肉、熟肉及海水产品的污染率分别为18.3%(15/82)、3.4%(2/59)、4.4%(3/68)、2.3%(1/44)。对15株LM进行了18种抗生素的药敏试验,其中对庆大霉素、链霉素、左氟沙星、先锋V、四环素、万古霉素、青霉素G、红霉素、复方新诺明等全部敏感;对多粘菌素B、氯霉素等部分耐药。[结论]用CHROMAGAR显色培养基分离LM,是一种理想途径,可明显提高检测效率。进行食品中LM污染卫生学调查,掌握该菌在主要食品中的污染分布特点及敏感药物,为预防与治疗因LM引发食源性疾病或食物中毒的潜在危险及食品安全管理提供科学依据。