分泌型人白细胞介素18重组质粒的构建及其真核表达

目的：构建带IL—12 P40信号肽序列的分泌型IL—18质粒，使其在真核细胞中稳定表达。方法：根据IL—12 P40的信号肽cDNA序列及人成熟IL—18序列设计4条特异性引物，用RT—PCR法自人树突状细胞中分别扩增IL—12 P40信号肽序列(片段A)及成熟IL—18基因(片段B)，用重叠延伸PCR法拼接和扩增融合基因(片段C)，连接制备pGEM—T克隆载体，亚克隆至pcDNA3．1^ 。转染NCI—H460人肺癌细胞株，经RT—PCR和Western blot检测IL—18的表达。结果：表达质粒的酶切图谱符合预期的结果，测序结果与预期的cDNA序列完全一致，转染细胞株表达了IL—18。结论：成功地构建了含IL—12 P40信号肽序列的IL—18表达质粒，并在人肺癌细胞株中得到了表达。     

Ⅴ型腺病毒纤维蛋白基因真核表达质粒的构建及表达

目的：克隆VEGF受体sFET-1片段1-3区，并使之在原核中进行表达以探讨其对内皮细胞增殖和血管生成方面的抑制作用。方法：提取脐静脉血管内皮细胞总RNA，克隆sFLT-1基因1-3区，并使之在QIA表达系统进行表达，Ni^2 -Sepha-rose6B亲和层析纯化，复性，应用MTT和鸡胚绒毛尿囊膜血管生成模，探讨重组蛋白对血管生成的抑制作用。结果；该表达系统能表达sFLT-1基因片段，表达量低，纯化后，经复性，sFLT-1具有VEGF特异结合功能，1μg重组sFLT-1蛋白能抑制10ngVEGF诱导的脐静脉内皮细胞增殖和20ngVEGF诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成，结论：sFLT-1基因片段能在QIA表达系统中得到表达，复性后重组蛋白具有与VEGF结合和拮抗VEGF生物学活性的功能。     

癌胚抗原真核表达质粒构建与鉴定

目的：癌胚抗原（ＣＥＡ）是一种重要的肿瘤相关抗原，同时也是针对某些肿瘤治疗的有效靶抗原，为探讨运用表达ＣＥＡ的重组质粒进行抗肿瘤治疗的可行性，本研究构这两套表达ＣＥＡ的真核重组质粒。方法：运用基因工程技术将编码人ＣＥＡ的全长２．４ｋｂｃＤＮＡ分别插和到直核表达载体ｐｃＤＮＡ３及ＶＲ１０１２中，并用多种限制性内切酶对重组质粒进行酶切鉴定。结果：构建的重组质粒均含有２．４ｋｂＣＥＡ片段，且插入ｐｃＤＮ     

乙肝病毒 X基因真核表达载体的构建及表达

目的：探讨HBVX基因在肝癌发生中的作用,并构建含X基因真核表达质粒。方法：用PCR法扩增含EcoRI与P stI 酶切位点的X基因序列,对PAS2－1载体及X基因PCR产物经双酶切,用连接酶将两者连接并转化到大肠杆菌JM105,对得组质粒经序列测定,称PAS2－1X。用乙酸锂转化法将重组质粒转化入酵母菌AH109,经Western blot法证实重组质粒在酵母细胞中的表达。结果：已构建的质粒AS2-1X经序列测定含有完整的 X 基因片段,转入酵母后经Western blot证实酵母细胞表达X蛋白。结论：PSA2－1X表达载体是为了解X基因与X蛋白的致癌机制而构,为通过酵母双杂交体系筛选体内与X蛋白相互作用 的X相关蛋白奠定了基础。     

癌胚抗原真核表达质粒构建与鉴定

癌胚抗原（CEA）是一种重要的肿瘤相关抗原，同时也是针对某些肿瘤治疗的有效靶抗原。为了探讨运用表达CEA的重组质粒进行抗肿瘤治疗的可行性，本研究构建了两套表达CEA的真核重组质粒。方法：运用基因工程技术将编码人CEA的全长2．4kbcDNA分别插入到真核表达载体pcDNA3及VR1012中，并用多种限制性内切酶对重组质位进行酶切鉴定。结果：构建的重组质粒均含有24kbEA片段，且插入pcD－NA3及VR1012中的2．4kb片段的方向均为正向，将这两套重组质粒分别命名为pCEA－1及pCEA－2。结论：本研究结果为进一步研究表达CEA的重组质位的免疫效应打下了基础。     

T细胞淋巴瘤TCRγV1重排基因真核表达载体的构建

目的 构建含TCRγV1重排基因的真核表达质粒。方法 用PCR法扩增含XbaI与BglⅡ酶切位点的TCRγV1基因序列，对VR1012载体及TCRγV1基因PCR产物经双酶切，用连接酶将两者连接并转化到大肠杆菌DH5α，对重组质粒经序列测定，称VR1012／TCRγ。结果 已构建的质粒VR1012／TCRγ经序列测定含有完整的TCRγV1基因片段。结论VR1012／TCRγ表达载体的构建为基因治疗淋巴瘤奠定了基础。     

抑癌基因PTEN真核表达质粒的构建及对乳腺癌MDA468细胞的影响

目的研究外源性PTEN基因稳定转染对人乳腺癌MDA468细胞体外生长的影响。方法先构建PTEN基因的真核表达质粒pcDNA3．1-PTEN,应用重组质粒pcDNA3．1-PTEN和pcDNA3．1(-)空载体质粒,以脂质体转染法转染体外培养的人乳腺癌细胞株MDA468,以未转染组为对照。应用RT-PCR、免疫组化和免疫印迹方法分析目的基因及其蛋白表达,MTT法分析细胞生长抑制作用,Annexin V-FITC和PI双染流式细胞术检测细胞凋亡。结果稳定转染PTEN基因的细胞株有外源目的基因的整合和相应mRNA及其蛋白的高表达。MTT检测表明,pcDNA3．1-PTEN转染组活细胞数低于未转染组和pcDNA3．1-MDA468细胞转染组。流式细胞术显示,pcDNA3．1-PTEN转染组凋亡率高于未转染组和pcDNA3．1-MDA468细胞转染组。结论外源性PTEN基因稳定转染可抑制人乳腺癌细胞的恶性表型。     

腺病毒E1A基因高效真核表达载体的构建与鉴定

目的构建真核高效表达该基因的载体,为进一步探讨运用高效表达Ｅ１Ａ的重组质粒进行肿瘤基因治疗及研究Ｅ１Ａ基因的作用机理和与其他基因的相互作用提供方法。方法运用分子克隆技术构建２套用较强启动子驱动的表达Ｅ１Ａ的真核重组质粒,并用多种限制性内切酶和ＤＮＡ测序对重组质粒进行鉴定。结果构建的重组质粒分别含有１．３４ｋｂ和１．７７ｋｂＥ１Ａ片段,分别命名为ｐＥ１Ａ１和ｐＥ１Ａ２,且插入的方向均为正向,无重排等异常现象,核苷酸序列无误。结论为人腺病毒５型（Ａｄ５）Ｅ１Ａ基因实验性抗肿瘤基因治疗包括放射增敏研究提供方法学及资料。     

RI基因真核表达载体的构建及其对C6胶质瘤细胞生长的影响

目的通过构建核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor, RI)基因的真核表达载体——pLNCX-ri, 并转染C6神经胶质瘤细胞,探讨RI抑制肿瘤生长的作用机制.方法用Nde I / Xho从已构建的pET-ri上切下1.4 kb的RI基因片段,再构建到pLNCX上,获得真核表达载体(pLNCX-ri),采用Lipofect AMINE辅助转染大鼠C6神经胶质瘤细胞,经G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,用Western blotting 检测RI基因的表达水平.将转染阳性的C6神经胶质瘤细胞接种于大鼠皮下,观察肿瘤的生长情况.结果在转染的C6神经胶质瘤细胞中,RI基因的表达量明显高于未转染的C6神经胶质瘤细胞,转染阳性的C6神经胶质瘤细胞在大鼠体内的成瘤潜伏期23±5.7天(对照组14±3.5天),瘤组织重量转染组1.35±0.43g比对照组2.40±0.61g(P＜0.01)明显下降,瘤组织的血管密度转染组27.2±4.31比对照组47±6.54(P＜0.01)明显减少.结论RI基因的转染对肿瘤的生长有明显抑制作用,其作用机制可能是抑制肿瘤组织血管的形成.     

重组FN多肽真核表达载体pCH510衔接化疗治疗小鼠肿瘤的研究

目的：研究肿瘤化疗后转pCH510质粒是否提高疗效,以及二者衔接是否需要特定的条件。方法：采用瘤细胞接种建立小鼠肿瘤模型：通过基因转染,观察pCH510对不同接种量所形成的小鼠肿瘤的抑制作用以及小鼠肿瘤化疗后立即进行pCH510转染的抑瘤效果;采用细胞培养技术,观察小鼠体内注射化疗药物后,其对小鼠腹腔巨噬细胞和脾淋巴细胞激活功能的影响;采用细胞计数的方法,观察化疗药物所致小鼠腹腔巨噬细胞和外周血免疫细胞数量变化的动力学;另外小鼠肿瘤化疗后第5天进行pCH510转染,观察抑瘤效果。结果：转染pCH510对不同接种量形成的小鼠肿瘤生长都有抑制作用,并呈负相关。化疗药物可使免疫细胞代谢降低,活化受阻,在化疗后第3天免疫细胞数降至最低,约10d左右恢复正常;化疗后立即连续10d转染pCH510质粒,疗效没有增强;化疗5d后,再连续15d转染pCH510质粒,则疗效明显增强。结论：化疗后转染pCH510质粒,对小鼠肿瘤治疗效果更好,但由于化疗既降低免疫细胞数量,又抑制其功能,化疗后立即转染pCH510质粒是不恰当的,并且转染治疗时间不宜过短。pCH510、化疗和化疗 pCH510三者对肿瘤不同抑制特点的比较显示化疗具有两面性,既抑瘤又捉瘤。     

S100A13 基因真核表达载体的构建及其在COS-7 细胞中的表达

 目的 构建以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的重组表达质粒pcDNA3.1/NT-GFP-S100A13,观察S100A13基因在COS-7细胞中的表达及定位。方法 采用克隆和亚克隆技术构建S100A13基因真核表达载体,脂质体介导转染COS-7细胞,RT-PCR和western-blot验证其mRNA和蛋白的表达,荧光显微镜观察该基因亚细胞定位。结果 酶切和测序结果证实重组质粒含有S100A13编码区序列且插入方向正确,转染后观察该基因亚细胞定位于全胞浆。结论 成功构建了S100A13基因真核表达载体,该基因在COS-7细胞中成功表达,S100A13基因表达定位于全胞浆。     

B7-1/GFP基因真核表达载体的构建及其在骨肉瘤细胞中的表达

Objective： To construct eukaryotic expression vector containing B7-1/GFP geneand study its expression in osteosarcoma cell line LM8. Methods： By using gene cloning technique, eukaxyotic expression vector pEGFP-C1 was used to construct the murine B7-1 recombinant plasmid （pEGFP-C1/B7）. Recombinant plasmid was transfected into LM8 cells with liposome and was confirmed by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing. The expression of the fusion protein was detected using fluorescence microscope and Western blot analysis. Results： The recombinant eukaryotic expression plasmid pEGFP-C1/B7 was successfully constructed, which was confirmed by DNA sequencing, RT-PGR and restriction enzymes analysis. The green fluorescent protein could be detected in the transfected LM8 with fluorescence microscope. The expected B7-1 and green fluorescent protein （GFP） fusion protein was detected by RT-PCR and Western blot. Conclusion： The eukaryotic expression vector containing B7-1/GFP gene was constructed successfully, and it could be expressed in LM8 after transfection.     

Survivin基因真核表达载体的构建及其在cos-7中的表达

[目的]克隆人survivin基因并在真核细胞中表达。[方法]以人喉癌组织中提取总RNA为模版，采用反转录聚合酶链RT-PCR法获得survivin cDNA。将该基因克隆到pcDNA3．0载体中，构建真核细胞表达载体pcDNA3．0／survivin，将测序正确的survivin基因通过脂质体介导下转染cos-7,Westem blot检测survivin蛋白在cos-7中表达。[结果]DNA测序证明获得了survivin基因，其序列与GeneBank中报道序列完全一致。Western blot检测survivin蛋白获得高效表达，其相对分子质量为16．5kD。[结论]Survivin基因的克隆和表达均获得了成功，为进一步探讨survivin基因在喉癌诊治中应用奠定了基础。     

FABP7基因真核表达载体的构建及其对人乳腺癌MCF-7细胞的抑制作用

0 引言 脑脂肪酸结合蛋白(BLBP/B-FABP,FABP7)通常在处于发育期中枢神经系统中的放射状胶质细胞和已分化的成年胶质细胞群例如神经胶质介膜细胞和Bergmann胶质细胞中表达[1-2],在成人中枢神经系统中的表达明显减少[3].有研究发现FABP7的表达对构建和维持放射状神经胶质纤维系统是必需的[4].乳腺癌细胞和脑细胞同样富含脂肪,我们通过观察FABP7基因对人乳腺癌MCF-7细胞增殖能力的影响,为进一步研究FABP7的功能提供依据.     

人RASSF2基因的真核表达载体的构建及其表达

 目的　构建人RASSF2基因的真核表达载体 ,为研究RASSF2在肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞等方面的作用奠定基础。方法　采用RT PCR自正常人外周血单个核细胞RNA中扩增出人RASSF2基因的全长cDNA ,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体 pcDNA3.1/HisC中获得重组质粒。用脂质体将重组质粒转染人胰腺癌细胞株PANC 1,RT PCR检测其表达。结果　酶切图谱分析及基因测序证明人RASSF2表达片段已被完整、正确的插入到 pcDNA3.1/HisC中 ,RT PCR结果显示转染细胞RASSF2表达水平上调。结论　成功构建了RASSF2基因的真核表达载体 pcDNA3.1RASSF2     

人抑癌基因FHIT真核表达质粒的构建与鉴定

[目的]构建人抑癌基因FHIT真核细胞表达载体。[方法]采用PCR方法，从人胎脑组织的总cDNA中扩增出444bp的人FHIT cDNA片段，然后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3．1／myc-His（-）B中，用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒；用该表达质粒转染COS-7细胞，Western blot法检测FHIT蛋白的表达情况。[结果]人FHIT基因cDNA以正确方向插入到真核细胞表达载体DcDNA3．1／myc-His（-）B中；转染COS-7细胞后，可见转染细胞有Fhit蛋白的表达。[结论]本实验成功地构建了人抑癌基因FHIT的真核表达质粒pcDNA3．1／myc-His（-）B-FHIT，为研究FHIT基因在肿瘤的发生中的作用提供了有效的工具。     

人内皮抑素基因腺病毒表达载体的构建及其在乳腺癌细胞中的表达活性

引言近年来,阻止肿瘤血管生成,控制肿瘤的生长和转移,成为肿瘤治疗的一项新策略[1,2],其中采用转染血管生成抑制剂拮抗血管的生成,以内皮抑素最为理想[3]。本文通过构建人内皮抑素基因的腺病毒表达载体,研究内皮抑素在乳腺癌细胞中的表达,为进一步研究乳腺癌的抗血管基因治疗做好准备。1材料与方法1.1材料携带人内皮抑素基因(humanendostatin,hE)的质粒pBlast hEndostatin购于美国InvitroGen公司;腺病毒载体pCA13、pBGHE3及293细胞株购于MicrobixBiosystems公司;人乳腺癌细胞株MBD231和MCF7、人脐静脉内皮细胞株ECV304购于美国ATCC细胞库;LipofectAMINE2000转染试剂盒购自GibcoBRL公司;各种限制性内切酶和DNA连接酶购自NEB公司;QIAprepspin miniprepkit、QIAampDNABloodMiniKit购自QIAGEN公司;M PERMammalianProteinEx tractionReagent购自PIERCE公司;Western显色液LumiGLOchemiluminescentreag...     

人白细胞介素-2真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建高效表达人IL－2的真核表达质粒,为IL－2的肿瘤基因治疗提供重要的工具。方法运用PCR扩增出人IL－2基因,经BamHI及EcoRI双酶切后,回收片段与BamHI及EcoRI处理的表达载体pcDNA3在T4DNA连接酶的作用下连接,并用多种限制性内切酶对重组质位进行酶切鉴定。结果PCR扩增片段的长度约为480bp,重组质粒经酶切显示,构建的质粒中含480bp的IL－2插人片段,将此重组质粒命名为pcDNA3－IL－2。结论本研究结果为进一步研究表达IL－2质粒的肿瘤基因治疗及免疫调节作用打下了基础。