抗肿瘤药羟喜树碱对Wnt通路抑制剂FrpHE的表达作用

目的研究加入羟喜树碱后Wnt通路抑制因子FrpHE(frizzled relatd protein)在人肿瘤细胞株中的表达调控作用。方法选择人肝癌HepG2(HepG2,含野生型p53;Hep3B,p53缺失)和人大肠癌(Lovo,含野生型p53),人神经胶质瘤细胞(U251,p53突变)细胞株为模型,观察抑制剂FrpHE以及反映Wnt通路功能变化的-βcatenin的表达。以RT-PCR技术检测Wnt通路抑制因子FrpHE表达的调节作用,以流式细胞术检测肿瘤细胞中Wnt通路的关键调节因子-βcatenin的表达。结果加入羟喜树碱24h后FrpHE mRNA表达水平在人肝癌细胞(HepG2,含野生型p53;Hep3B,p53缺失)中与对照组相比表达水平显著增加。在人大肠癌细胞(Lovo,含野生型p53)和人神经胶质瘤细胞(U251,p53突变型)中,未见FrpHE mRNA表达。-βcatenin的阳性细胞百分比强度和平均荧光量强度与对照组相比,表达水平降低。结论羟喜树碱在人肝癌细胞中能明显诱导抑制剂FrpHE mRNA的表达。     

化疗药顺铂对Wnt通路抑制因子的表达作用

目的 研究抗肿瘤药顺铂(cisplatin,Pt)对Wnt通路抑制因子FrpHE(frizzled relatd protein)和 DKK-1(dickkopf-1)表达的调节作用.方法 培养人肝癌HepG2、Hep3B、人大肠癌Lovo和人神经胶质瘤U251细胞,并分别加入5 μmol/L Pt作用24 h,以RT PCR技术检测FrpHE和DKK-1mRNA,以流式细胞术检测肿瘤细胞中Wnt通路的关键调节因子β-catenin的表达.结果 顺铂作用24 h后,FrpHE mRNA表达水平在人肝癌细胞较对照组表达水平显著增加(P<0.001).在人大肠癌细胞和人神经胶质瘤细胞中,未见FrpHE mRNA表达.DKK 1mRNA表达水平在加入Pt作用后的人肝癌细胞、人大肠癌细胞和人神经胶质瘤细胞均较对照组表达水平显著增加.β-catenin的阳性细胞百分比和平均荧光强度与对照组相比均降低(P<0.001).结论 化疗药顺铂能够诱导肝癌细胞FrpHE mRNA和人肝癌、肠癌、神经胶质瘤细胞DKK-1 mRNA的表达,抑制Wnt通路.     

Wnt/β-catenin信号通路在体外调控诱导性多能干细胞向神经干细胞分化中的作用及机制研究

[目的]探讨Wnt/β-catenin信号通路在体外调控诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS)向神经干细胞分化中的作用及机制。[方法]体外培养小鼠iPS,采用N2B27培养基联合维甲酸(retinoic acid,RA)诱导法,诱导其向神经干细胞分化;免疫荧光法检测iPS来源神经干细胞中的巢蛋白(Nestin)、β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ)的表达情况;将细胞分为正常组、Wnt3a组、Dickkopf相关蛋白-1(Dickkopf-1,DKK-1)组和IWR-1组,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,Real-time qPCR)、Western blot分别检测iPS神经分化过程中Nestin、β-tubulinⅢ及β-catenin的表达情况;采用悬浮培养法检测Wnt/β-catenin信号通路对iPS来源神经干细胞增殖能力的影响。[结果]iPS来源神经干细胞表达神经干细胞的表面特异性标志物Nestin,以及早期神经元特异性标志物β-tubulinⅢ;iPS向神经干细胞分化过程中,Nestin、β-tubulinⅢ的表达均升高(P0.05,P0.05),β-catenin表达降低(P0.05);采用Wnt3a处理后,iPS来源神经干细胞增殖能力较弱;采用DKK-1和IWR-1处理后,iPS来源神经干细胞增殖能力较强,且Nestin表达提高(P0.01),β-catenin表达降低(P0.05)。[结论]Wnt/β-catenin信号通路在iPS向神经干细胞诱导分化过程中受到抑制;采用DKK-1和IWR-1下调Wnt/β-catenin信号通路,可促进iPS向神经干细胞分化,提高iPS来源神经干细胞的增殖能力,提示Wnt/β-catenin信号通路在iPS向神经干细胞分化过程中具有负调控的作用。     

COX-2/PGE2激活Wnt/β-catenin信号通路调控人肠癌细胞VEGF表达

目的 探讨环氧化酶2(COX- 2)/前列腺素E2(PGE2)是否通过Wnt/β-catenin信号通路调控人肠癌细胞血管内皮生长因子(VEGF)的表达.方法 将PGE2或COX-2选择性抑制剂NS-398作用LoVo细胞24 h,采用蛋白质印迹法检测COX-2和β-catenin蛋白表达;将PGE2和(或)β-catenin/tcf抑制剂FH-535作用LoVo细胞24 h,采用ELISA法检测VEGF表达.以常规培养的LoVo细胞为对照.结果 与对照组比较,PGE2能够上调LoVo细胞中COX-2蛋白表达,同时上调β-catenin在细胞总蛋白、细胞浆蛋白和核蛋白中的表达水平(分别是对照组的3.8倍、2.7倍和3.0倍,P均＜0.01);COX-2抑制剂能够下调COX-2蛋白表达,同时下调β-catenin在细胞总蛋白、细胞浆蛋白和核蛋白中的表达水平(分别是对照组的0.3倍、0.3倍和0.2倍,P均＜0.01).与对照组比较,PGE2能够上调LoVo细胞VEGF表达水平(是对照组的1.6倍,P＜0.01);β-catenin/tcf抑制剂能够下调VEGF表达(是对照组的0.68倍,P＜0.01);将PGE2和β-catenin/tcf抑制剂同时作用LoVo细胞后VEGF表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05).结论 COX-2/PGE2通过上调β-catenin蛋白表达,从而激活Wnt/β-catenin信号通路,上调VEGF表达,这可能是COX-2/PGE2促进大肠癌血管新生的机制之一.     

Wnt/β-catenin信号通路对问充质干细胞衰老的影响及其作用机制

目的:研究不同年龄血清对Wnt/β-catenin信号通路激活水平的影响,探讨Wnt/β-catenin信号通路对间充质干细胞(MSCs)衰老、增殖、存活能力的作用及其机制.方法:提取年轻(8 ～12周)及老年(64—72周)SD大鼠血清,实验分为4组,分别为年轻血清(Young rat serum,YRS)组,YRS+ Wnt 3a组、老年血清(Old rat serum,ORS)组和ORS+ DKK1组.免疫细胞化学染色和Western blotting检测胞浆、胞核β-catenin的表达.SA-β-半乳糖苷酶染色检测各组细胞衰老,MTT法检测细胞增殖,AO/EB染色法检测MSCs存活和凋亡.为研究Wnt/β-catenin信号通路导致MSCs衰老的作用机制,免疫细胞化学染色和Western blotting检测γ-H2A.X和p53蛋白表达,RT-PCR法检测p53、p21 mRNA表达.结果:ORS组β-catenin表达较YRS组明显增强,尤其是胞核,出现β -catenin聚集现象,而ORS+ DKK1组β-catenin表达减弱.与YRS组相比,YRS+ Wnt 3a组细胞SA-β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数显著增多(P＜0.01),细胞增殖和存活能力减弱.而ORS+ DKK1组与ORS组相比,SA-β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数显著减少(P＜0.01),细胞增殖和存活能力增强.免疫细胞化学染色、Western blotting和RT-PCR检测结果显示,ORS组内γ-H2A.X、p53、p21表达较YRS组明显增强,而在ORS内加入DKK1后,γ-H12A.X、p53、p21表达较ORS组明显减弱.结论:ORS培养可以激活MSCs内Wnt/β-catenin信号通路.Wnt/β-catenin信号通路对MSCs衰老发挥重要调控作用.DNA损伤反应和p53/p21途径是Wnt/β-catenin信号通路导致MSCs衰老的重要介导因素.     

双氢青蒿素通过Wnt信号通路对胶质瘤细胞增殖侵袭的影响

目的:研究双氢青蒿素(dihydroartemisinine,DHA)对人胶质瘤U251细胞的增殖、侵袭的影响及其作用机制。方法:采用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法观察DHA对胶质瘤活性的影响;细胞划痕实验检测细胞迁移力; Transwell小室法检测细胞侵袭力;免疫印迹试验(Western blot,WB)检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin及β-catenin、GSK-3β、Axin2、c-myc蛋白的表达水平。结果:DHA显著抑制胶质瘤U251细胞的增殖活性、迁移能力及侵袭能力且呈浓度依赖性; WB法显示DHA下调E-cadherin、β-catenin、c-myc蛋白的表达水平,上调N-cadherin、Vimentin、GSK3β、Axin2蛋白的表达水平且呈浓度依赖性。结论:DHA可以抑制人胶质瘤U251细胞增殖、迁移及侵袭,其机制可能与其抑制Wnt/β-catenin通路从而抑制EMT相关进程。     

胶质瘤细胞株U251,SHG-44,BT325中β-catenin的表达及其成瘤性分析

目的：探讨β-catenin在人神经胶质细胞株（HA）、人神经胶质瘤细胞株U251,SHG-44,BT325中的表达及其与恶性程度的相关性.方法：运用实时荧光定量PCR检测β-catenin在HA,U251,SHG-44,BT325细胞内的表达水平,并通过免疫荧光辅助分析β-catenin的表达及细胞内定位情况.建立裸鼠胶质瘤模型,观察肿瘤的生长.结果：β-catenin基因在人神经胶质瘤U251,SHG-44,BT325细胞株内的表达均高于HA细胞株,其中U251细胞表达最高,SHG-44细胞次之,而BT325细胞表达最低.在HA细胞株中,β-catenin蛋白主要在细胞膜表达,而在人神经胶质瘤U251,SHG-44,BT325细胞株中β-catenin蛋白表达出现了明显的胞质和胞核的易位表达.通过对荷瘤鼠模型的观察发现U251细胞所造肿瘤生长速度最快,SHG-44细胞次之,而BT325细胞的肿瘤生长速度最慢.结论：β-catenin基因表达与人神经胶质瘤U251,SHG-44,BT325细胞株恶性程度呈正相关.U251细胞表达β-catenin最高,更适合神经胶质细胞瘤Wnt/β-catenin信号传导通路相关研究.     

Wnt/β-catenin及p38MAPK信号通路在人胃癌组织中的表达情况与化学治疗预后及多药耐药相关性研究

目的 研究Wnt/β-catenin及p38MAPK信号通路在人胃癌组织中的表达规律及其与患者病理情况、化疗后预后生存期情况、相关多药耐药因子之间相关性.方法 选取2007年11月至2013年7月大连医科大学附属第一医院胃癌根治术后病例共91例,应用免疫组化法,对已行胃癌根治术、相同化疗、随访的91名病例的病理标本进行检测,收集Wnt/β-catenin及p38MAPK表达情况和患者一般及病理情况、多药耐药因子ToPoⅡ和GST-π表达情况、预后生存期情况,并进行相关性分析.结果 Wnt/β-catenin及p38MAPK阳性表达率与年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤分期无相关性;相同化疗后,中位生存时间Wnt/β-catenin阴性表达患者(26.5个月)比阳性表达患者(14.9个月)延长(P<0.05),p38MAPK阳性表达患者(29.1个月)比阴性表达患者(9.2个月)延长(P<0.05),经Log-Rank分析,Wnt/β-catenin阳性表达率与患者预后生存期呈负相关,p38MAPK阳性表达率与患者预后生存期呈正相关(P<0.05);p38MAPK阳性表达率分别与ToPoⅡ及GST-π阳性表达率呈正相关及负相关性(P<0.05),而Wnt/β-catenin阳性表达率与二者均无相关性(P>0.05);Wnt/β-catenin与p38MAPK阳性表达率之间无相关性(P>0.05).结论 Wnt/β-catenin 及p38MAPK 阳性表达率与年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤分期无关;Wnt/β-catenin 阳性低表达及p38MAPK 阳性高表达与胃癌化疗预后生存期成正相关,可能降低了化疗药物的多药耐药性.     

塞来昔布对人滑膜细胞和人软骨细胞共培养体系相关因子的调控作用

目的 观察塞来昔布对Wnt/β-catenin信号通路活化的人滑膜细胞和人软骨细胞共培养体系相关因子的调控作用,初步阐释塞来昔布治疗骨关节炎的分子作用机制.方法 通过β-catenin慢病毒载体转染正常人滑膜细胞,激活其Wnt/β-catenin信号通路.Wnt/β-catenin信号通路活化的人滑膜细胞与正常人软骨细胞置于Transwell小室中共培养.倒置显微镜观察Wnt/β-catenin信号通路活化的人滑膜细胞对人软骨细胞形态学变化的影响.塞来昔布混悬液干预共培养体系,采用Western blot方法检测塞来昔布对滑膜细胞β-catenin蛋白表达的影响;采用ELISA方法检测塞来昔布对滑膜细胞、软骨细胞培养上清液基质金属蛋白酶-7(MMP-7)、Ⅱ型胶原羧基端肽(CTX-Ⅱ)、软骨寡聚基质蛋白(COMP)表达的影响.结果 β-catenin慢病毒载体转染正常人滑膜细胞后成功激活Wnt信号通路并与软骨细胞共培养.随着培养时间的延长,软骨细胞生长逐渐受到抑制,软骨细胞胞体边缘与板壁接触处发白,折光度增加,细胞贴壁强度降低.塞来昔布干预后,Western blot检测发现滑膜细胞中β-catenin蛋白的表达明显下调(P＜0.01);ELISA法检测发现滑膜与软骨细胞上清液中MMP-7、CTX-Ⅱ、COMP的表达与正常对照相比明显升高(P＜0.01).结论 滑膜细胞Wnt/β-catenin信号通路的激活可以使软骨细胞生长受到抑制.塞来昔布可以降低滑膜细胞β-catenin表达,且与干预时间长短相关.塞来昔布可以抑制滑膜细胞Wnt/β-catenin信号通路,下调MMP-7、CTX-Ⅱ、COMP的表达.塞来昔布可能通过抑制OA滑膜Wnt/β-catenin信号通路,改善滑膜炎症、调控滑膜-软骨共同体系微环境、达到抑制软骨降解,促进软骨细胞功能恢复而治疗骨关节炎.     

Wnt/β-catenin信号通路对间充质干细胞衰老的影响及其作用机制

目的:研究不同年龄血清对Wnt/β-catenin信号通路激活水平的影响,探讨Wnt/β-catenin信号通路对间充质干细胞(MSCs)衰老、增殖、存活能力的作用及其机制。方法:提取年轻(8～12周)及老年(64～72周)SD大鼠血清,实验分为4组,分别为年轻血清(Young rat serum,YRS)组,YRS+Wnt 3a组、老年血清(Old rat serum,ORS)组和ORS+DKK1组。免疫细胞化学染色和Western blotting检测胞浆、胞核β-catenin的表达。SA-β-半乳糖苷酶染色检测各组细胞衰老,MTT法检测细胞增殖,AO/EB染色法检测MSCs存活和凋亡。为研究Wnt/β-catenin信号通路导致MSCs衰老的作用机制,免疫细胞化学染色和Western blotting检测γ-H2A.X和p53蛋白表达,RT-PCR法检测p53、p21 mRNA表达。结果:ORS组β-catenin表达较YRS组明显增强,尤其是胞核,出现β-catenin聚集现象,而ORS+DKK1组β-catenin表达减弱。与YRS组相比,YRS+Wnt 3a组细胞SA-β-半乳糖苷酶染色阳性细胞...     

抑癌基因p53诱导Wnt通路抑制因子sFRP的表达

目的 研究p53对Wnt通路抑制因子sFRP表达的调节作用。方法 将携带p53基因的复制缺陷型腺病毒载体（Aap53)导入到p53缺失的人肝癌细胞株Hep3B中，以流式细胞术检测Adp53转基因情况，以RT—PCR技术检测p53对sFRP表达的调节作用。结果 sFRP mRNA水平在转染p53 20h后即有明显升高，其中以32h达最高水平，随后逐渐降低。量效关系研究表明在转染剂量为0．05、0.5、5、50pfu／cell的Adp53 sFRP mRNA表达均有显著增高，尤以5pfu／cell时表达水平最高。结论 p53能明显诱导Wnt通路抑制利sFRP的mRNA表达。     

人甲状旁腺激素（1-34）在人成骨肉瘤细胞中对基质Gla蛋白及Wnt/β-catenin信号通路的调节作用

目的观察人甲状旁腺激素（PTH）的N端活性片段PTH（1-34）对人成骨肉瘤细胞MG63 基质Gla 蛋白（MGP）表达的影 响,以及PTH通过Wnt/β-catenin 信号通路介导MGP表达调控的作用,探讨PTH（1-34）在防治骨质疏松症作用中可能的分子 机制。方法（1）用不同浓度PTH（1-34）（10-9、10-8、10-7 mol/L）,单独或联合Wnt/β-catenin信号通路抑制剂DKK-1（200 ng/mL）干预 MG63 细胞;（2）检测碱性磷酸酶（ALP）染色及活力测定用于判断细胞分化情况;（3）MGP及Wnt/β-catenin 信号通路各组分 的mRNA及蛋白的表达分别采用实时定量RT-PCR 及Western blotting 方法。结果（1）PTH（1-34）上调MGP基因的表达, MGP mRNA的表达分别是对照组的2.56 倍、4.14 倍、7.81 倍（P<0.05 或P<0.01）,且呈剂量依赖性增高;（2）PTH增强MG63 细胞ALP活力,Dkk-1 抑制ALP活性,Dkk-1 与PTH联用部分阻断PTH上调ALP活力（P<0.05）;（3）PTH上调MGP及Wnt/ β-catenin 信号通路中相关因子LRP5、β-catenin、Runx2 mRNA及蛋白水平,其mRNA分别是对照组的2.65、4.01、3.48 倍（P< 0.05 或<0.01）;DKK-1 对PTH（1-34）促MGP表达没有影响,但大部分阻断了Wnt/β-catenin 信号通路中相关因子的表达。结 论PTH（1-34）能明显上调MGP及Wnt/β-catenin 信号通路中相关因子的表达,Wnt/β-catenin 信号通路和MGP在PTH调节骨 代谢中起重要作用。     

抑癌基因p53诱导Wnt通路抑制因子sFRP的表达

目的研究p53对Wnt通路抑制因子sFRP表达的调节作用。方法将携带p53基因的复制缺陷型腺病毒载体(Adp53)导入到p53缺失的人肝癌细胞株Hep3B中,以流式细胞术检测Adp53转基因情况,以RT-PCR技术检测p53对sFRP表达的调节作用。结果sFRP mRNA水平在转染p53 20 h后即有明显升高,其中以32 h达最高水平,随后逐渐降低。量效关系研究表明在转染剂量为0.05、0.5、5、50 pfu/cell的Adp53 sFRP mRNA表达均有显著增高,尤以5 pfu/cell时表达水平最高。结论p53能明显诱导Wnt通路抑制剂sFRP的mRNA表达。     

Wnt／β-catenin信号途径促进肌源性干细胞向神经细胞分化

目的探讨Wnt／β—catenin信号途径在肌源性干细胞（musclederivedstemcells,MDSCs）分化过程中的调控作用。方法对照组单纯体外培养MDSCs;实验组采用丙戊酸（valproicacid,VA）诱导培养MDSCs分化为类神经细胞;抑制剂组在实验组的基础上采用Dickkopf-l（DKK-1）和sFRP抑制Wnt／β—catenin信号途径。免疫细胞化学检测各组MDSCs的分化情况。RT—PCR检测MDSCs中Wnt3amRNA表达的变化,Westernblot检测MDSCs中GSK-3β、β—catenin蛋白含量的变化。结果实验组和抑制剂组MDSCs经VA诱导后出现神经细胞分化现象,抑制剂组分化水平明显低于实验组,对照组未见分化。与对照组相比,实验组和抑制剂组Wnt3amRNA和β—catenin表达水平增加,实验组明显高于抑制剂组。实验组和抑制剂组GSK-3B表达水平低于对照组。结论MDSCs向类神经细胞分化过程中Wnt／i3-catenin信号通路被激活,Wnt／β-catenin信号通路阻断能够部分抑制MDSCs向类神经细胞分化。     

鳖甲煎丸对肝细胞癌中Wnt/β-catenin信号通路及抑制基因DKK-1、FrpHe表达的影响

目的通过研究鳖甲煎丸对肝细胞癌中Wnt 信号通路及抑制基因DKK-1、FrpHe 表达的影响,探讨其抗肝细胞癌转移
侵袭的作用机制与Wnt/β-catenin 信号通路的关系。方法24 只Wistar 大鼠随机分为3 组（8 只/组）,分别以临床剂量的20 倍、
10 倍的鳖甲煎丸和生理盐水灌胃3 d,3 d 后采血,离心,获取血清。分别将3 组血清加入DMEM培养液中培养肝癌细胞
HepG2,48 h 后采用流式细胞术检测细胞中的β-catenin 蛋白含量,qRT-PCR法检测DKK-1、FrpHe基因的表达情况,以进一步
阐明药物的作用机制与Wnt/β-catenin 信号通路的关系。结果流式细胞术结果：高剂量组和中剂量组含药血清均可显著降
低细胞中β-catenin 蛋白表达,且该作用与药物浓度有关。RT-PCR结果：高剂量组和中剂量组含药血清均可显著下调DKK-1
基因的表达,且该作用与药物浓度有关。而高剂量组和中剂量组含药血清对FrpHe 基因的表达影响不明显。结论鳖甲煎
丸能显著抑制肝细胞癌的生长、粘附和转移,且这种抑制作用与显著降低肝癌细胞中β-catenin 蛋白表达、显著下调DKK-1 基
因的表达,从而阻断Wnt/β-catenin 信号通路有关。
     

双氯芬酸抑制肝癌细胞增殖和促进环氧合酶-2 mRNA作用的表达

目的 观察环氧合酶抑制剂双氯芬酸钠对体外培养的肝癌细胞HepG2、Hep3B和正常肝细胞系QSG-7701增殖的作用以及药物对环氧合酶-2（COX-2）mRNA表达的影响,探讨COX-2与肝癌细胞增殖的关系。方法 采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）细胞计数法测定药物作用24、48、72h后细胞增殖活性,半定量逆转录聚合酶链反应检测各种细胞系COX-2 mRNA的表达水平以及药物作用对基因表达的影响。结果双氯芬酸在10～200μmol/L浓度依赖性地抑制HepG2和Hep3B细胞的增殖,50μmol／L作用48h后抑制率分别为40．47％和54．49％,半数抑制浓度分别为70．54和48．39μmol／L。双氯芬酸对正常肝细胞株QSG-7701的抑制作用较弱,作用48h的半数抑制浓度为189．91μmol／L。HepG2、Hep3B细胞均表达COX-2 mRNA,QSG-7701细胞几乎不表达COX-2 mRNA。双氯芬酸和化疗药5-氟尿嘧啶均可增强HepG2和Hep3B细胞COX-2 mRNA的表达。结论 双氯芬酸特异性地抑制表达COX-2的肝癌细胞HepG2和Hep3B的增殖,并且诱导COX-2 mRNA表达上调,提示COX-2在肝癌细胞增殖中具有重要意义。     

TGF- β 1/SMAD SIGNALING PATHWAY MEDIATES p5 3 -DEPENDENT APOPTOSIS IN HEPATOMA CELL LINES

HEPATOCELLULARcarcinoma(HCC)isoneofthemostcommonanddevastatingmalignanttumors,withanestimatedannualincidenceofonemillioncases,mainlyinAfricanandAsianregions.Inrecentyears,importantadvanceshavebeenmadeinunder standingthemolecularpathogenesisofHCC,butonlyli…     

逆转录病毒载体介导的RNAi技术稳定抑制前列腺癌细胞株β-catenin的表达

目的:建立稳定抑制β-catenin基因表达的前列腺癌细胞株,为探讨Wnt/β-catenin信号在前列腺癌发生中的作用提供合适的细胞模型。方法:在β-catenin基因编码区选择3个RNAi作用的靶位点,体外合成前体DNA链,复性后连入逆转录病毒载体pSUPER-retro,转染包装细胞PA317,收集含病毒颗粒的培养上清感染DU145细胞,经嘌呤霉素筛选并扩大培养后得到克隆,继续培养2个月形成稳定克隆。免疫印迹检测癌细胞内β-catenin及受其调控的靶基因c-myc和cyclinD1的表达；四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测β-catenin基因表达抑制的细胞和对照组细胞的增殖。结果:免疫印迹和RT-PCR结果显示，筛选得到的2个克隆中细胞内β-catenin表达水平下降；且克隆内c-myc，cyclinD1基因的表达下调；MTT检测显示，β-catenin表达抑制的细胞克隆吸光度值下降，这表明克隆内细胞数量减少,细胞增殖受到了抑制。结论:成功建立稳定抑制β-catenin基因表达的前列腺癌细胞株。     

Tenascin-C表达降低抑制成骨细胞分化并促进骨质疏松的机制

目的探讨Tenascin-C在成骨细胞分化中的作用及机制,并分析其表达变化对骨质疏松的调控。方法以免疫印迹法检测 去卵巢致骨质疏松的小鼠股骨松质骨的Tenascin-C 表达变化。体外诱导成骨前体细胞MC3T3-E1 分化,检测瞬时转染 Tenascin-C的siRNA后其碱性磷酸酶的活性。以蛋白质相互作用预测软件STRING筛选与Tenascin-C可能存在相互作用的蛋 白质。在上述候选蛋白中,以免疫沉淀法验证了Tenascin-C与Wnt通路内源性抑制蛋白Dickkopf-1（Dkk-1）的相互作用,并以 免疫印迹检测Tenascin-C对DKK-1的调控。此后进一步采用荧光素酶报告基因系统检测了Tenascin-C对Wnt信号通路转录活 性的影响。结果去卵巢骨质疏松的小鼠股骨松质中Tenascin-C 蛋白表达急剧下降。降低Tenascin-C 的表达能够阻遏 MC3T3-E1向成熟成骨细胞分化,反之,在此基础上过表达β-Catenin可逆转前者导致的成骨细胞分化阻滞。Tenascin-C结合于 DKK-1,敲低Tenascin-C可上调DKK-1的表达并降低Wnt通路的转录活性。结论Tenascin-C的下调可能通过减弱对DKK-1 的负调控从而抑制Wnt通路的转录活性,进而抑制成骨细胞的分化并介导骨质疏松。     

β-catenin在大鼠胚胎肝脏发育和肝癌发生中的作用

目的探讨Wnt信号通路关键分子β-catenin在大鼠胚胎肝脏发育和肝癌发生中的作用。方法采用免疫组织化学方法观察β-catenin在12、16d胎龄大鼠、新生鼠、成年鼠以及肝癌模型鼠肝脏中的表达;同时用RT-PCR方法检测β-catenin mRNA在标本中的转录水平。结果免疫组化显示,在12d胎龄大鼠肝脏中,β-catenin在几乎所有的肝细胞浆中都有比较强的表达,部分细胞的核膜上也有阳性着色;在16d胎龄大鼠肝脏中,β-catenin在肝细胞浆中仍有表达,但是无论是表达强度还是阳性细胞的数量都较前时期有所下降。在大鼠肝癌细胞中,β-catenin的表达定位也以胞浆为主。而在新生鼠和成年大鼠的肝脏中则未见β-catenin表达。RT-PCR的结果显示,无论是在新生鼠、成年鼠肝脏还是胚胎以及肿瘤肝脏中均存在β-catenin的转录,而且转录水平没有明显的差异。结论Wnt／β-catenin信号传导通路在大鼠胚胎肝脏发育和肿瘤的发生中被激活。β-catenin蛋白在细胞浆中的积累可能不是因为转录水平的提高而是其未被降解所导致的。