Profiler体系用于异基因造血干细胞移植植活测定

目的探讨应用Profiler体系进行短串联重复序列（STR）基因位点检查在异基因造血干细胞移植中的作用。方法采用荧光标记STR-PCR复合扩增、毛细管电泳基因分型技术，对11例异基因造血干细胞移植的供者和受者移植前、后STR基因进行检测，了解造血干细胞的植入情况。结果11例异基因造血干细胞移植受者移植后STR基因型与受者移植前STR基因型不同，与供者STR基因型完全相同，提示供者造血干细胞的植入。结论应用Profiler体系进行STR基因位点检查可用于判断异基因造血干细胞移植的植入情况。     

短串联重复序列监测异基因造血干细胞移植后的植入状态及其演变过程

目的：监测和观察异基因造血干细胞移植后的植入状态及其演变过程。方法：于2003—01／2004—12在中国造血干细胞库深圳分库采集完成人类白细胞抗原配型的6对供受者标本。采用荧光标记复合扩增短串联重复序列检测技术，对6对供受者标本移植前后的系列血样进行DSS1179，1321S11，D18S51，D5S818，D13S317，D7S820，D3S1358，vWA，FGA共9个短串联重复序列位点和Amelogenin性别位点的检测，找出供受者间的差异基因，通过移植后不同时间段患者基因型的转变情况，判断供者细胞是否植入以及嵌合体类型。结果：供受者6对样本均获得满意的9个短串联重复序列位点和1个性别位点的分型结果。6对移植标本短串联重复序列差异基因由受者型向供者型转化的时间为14～23d。6对样本间存在明显差异。第3对、第5对在第14天已为供者完全嵌合状态，而第1对在第16天、第4对在第18天尚为供受者混合嵌合体。但6对样本都是一个从混合嵌合向完全嵌合发展的良好趋势。结论：①6对移植标本短串联重复序列差异基因由受者型向供者型转化的时间为14～23d，6对样本都有从混合嵌合向完全嵌合发展的良好趋势。②采用荧光标记复合扩增短串联重复序列方法可精确地测量聚合酶链反应产物的数量，描述造血干细胞的植入程度及植入的整个演变过程。     

短串联重复序列监测异基因造血干细胞移植后的植入状态及其演变过程

目的:监测和观察异基因造血干细胞移植后的植入状态及其演变过程。方法:于2003-01/2004-12在中国造血干细胞库深圳分库采集完成人类白细胞抗原配型的6对供受者标本。采用荧光标记复合扩增短串联重复序列检测技术,对6对供受者标本移植前后的系列血样进行D8S1179,D21S11,D18S51,D5S818,D13S317,D7S820,D3S1358,vWA,FGA共9个短串联重复序列位点和Amelogenin性别位点的检测,找出供受者间的差异基因,通过移植后不同时间段患者基因型的转变情况,判断供者细胞是否植入以及嵌合体类型。结果:供受者6对样本均获得满意的9个短串联重复序列位点和1个性别位点的分型结果。6对移植标本短串联重复序列差异基因由受者型向供者型转化的时间为14～23d。6对样本间存在明显差异。第3对、第5对在第14天已为供者完全嵌合状态,而第1对在第16天、第4对在第18天尚为供受者混合嵌合体。但6对样本都是一个从混合嵌合向完全嵌合发展的良好趋势。结论:①6对移植标本短串联重复序列差异基因由受者型向供者型转化的时间为14～23d,6对样本都有从混合嵌合向完全嵌合发展的良好趋势。②采用荧光标记复合扩增短串联重复序列方法可精确地测量聚合酶链反应产物的数量,描述造血干细胞的植入程度及植入的整个演变过程。     

荧光标记短串联重复序列复合扩增监测嵌合体的应用研究

本研究采用荧光标记的多重PCR复合扩增短串联重复序列(STR)结合全自动毛细管电泳检测异基因造血干细胞移植后嵌合体水平,并探讨该方法动态监测对移植患者预后判断的作用。采集30例异基因造血干细胞移植患者及其供者移植前后骨髓或外周血的DNA,采用Profiler Plus试剂盒进行PCR扩增,产物经ABI310遗传分析仪进行毛细管电泳,通过供受者基因位点差异和峰面积进行嵌合体的定量检测。结果表明,29例患者在移植后28天形成完全供者嵌合体(complete chimerism,CC),1例形成混合嵌合体(mixed chimerism,MC)。在长期随访中,22例表现为持续完全供者嵌合体,8例混合嵌合体患者中7例原病复发,从完全供者嵌合体转为混合嵌合体。完全供者嵌合体组移植物抗宿主病(GVHD)的发生率明显高于混合嵌合体组。结论 :荧光标记多重复合扩增STR检测嵌合体具有快速、自动化高、可定量及灵敏度高等优点,动态定量监测嵌合体可用于移植动力学研究,对移植物早期植入或被排斥、疾病复发以及GVHD均有预警作用,对实施临床干预治疗有指导价值。     

混合脐血成人移植定量监测植入状态的实验研究

为了定量监测和研究双份异基因脐血用于成人白血病患者移植后两份脐血的植入状态、嵌合体类型、供者细胞相对数量的动态变化及演变规律 ,采用荧光标记复合扩增短串联重复 (STR)位点嵌合体定量检测技术 ,对 1例急性髓细胞白血病成人患者移植两份 (脐血 1有核细胞数为 2 .5× 10 7/kg ,脐血 2有核细胞数为 1.5 3× 10 7/kg)HLA各 1个位点不相合的异基因脐血前后的序列血样进行 9个STR位点的检测 ;利用供、受者之间的差异位点定性判断脐血是否植入以及嵌合体类型 ;而后根据 377XLDNA测序仪上荧光扫描后两供者差异基因检出峰的峰面积计算脐血植入后患者体内两份脐血的细胞相对数量 ,定量分析供体细胞植入程度及演变规律 ;并与采用HLA差异基因对植入状态的分析结果进行对比。结果表明 :移植后 15天两份脐血同时植入 ,植入状态为完全双份供者嵌合体 ,患者体内脐血 1的相对细胞数量占 5 1.3% ,脐血 2占 4 8.7% ;30天时脐血 1嵌合体细胞上升为 70 .0 % ,脐血2嵌合体细胞下降为 30 .0 %。 5 2天时只检测到脐血 1的基因 ,植入状态转为完全单份供者嵌合体 ,有核细胞数少的一份脐血被排斥 ,有核细胞数多的一份长期植入。结论 :荧光标记复合扩增STR嵌合体定量检测可精确地描述两份脐血的植入程度及变化过程 ,为临床脐     

STR-PCR对造血干细胞移植后植入证据的检测

本研究采用STRPCR检测方法，观察比较15例异基因造血干细胞移植术后患者的植入情况。提取15例异基因造血干细胞移植术患者及其供者移植前的以及患者移植术后的不同时期的外周血或骨髓DNA，PCR扩增5个具有高度多态性的STR位点，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染，分析其植入情况。结果表明：15例患者均有不同程度植入，其中完全供者植入10例，供受者混合嵌合体5例。持续缓解10例，死亡4例，1例复发但仍存活。混合嵌合体中供者DNA比例的下降预示着早期排斥或复发。Ⅱ度以下急性移植物抗宿主病的发生与混合嵌合体有明显相关性。结论：STRPCR是分析异基因造血干细胞移植后供体是否植入的灵敏、准确度高的方法，混合嵌合状态对白血病复发有预警作用。嵌合状态的变化对疾病的治疗有指导作用。     

造血干细胞移植植入存活检定技术的应用性研究

目的 探讨荧光标记短串联重复(STR)复合扩增技术在造血干细胞移植(SCT)存活检定中的应用价值。方法 用荧光标记引物对15个STR位点和1个性别位点牙釉质蛋白基因(amelogenin)进行聚合酶链反应(PCR)复合扩增，再用DNA自动测序仪对PCR产物进行分离及分型，并对30例移植后病人做存活鉴定检测。结果 有20例移植后病人的15个STR位点的分型完全表现供者源性，与受者移植前不同；3例表现为供／受体干细胞混合嵌合状态，7例未表现出供者源性细胞在受者体内的植入。结论 荧光标记STR复合扩增体系特异性强，个体识别力高，检测灵敏、快速、简便，可作为SCT存活的可靠指标。     

成人移植双份脐血植入状态的定量监测

背景:脐血因所含的有核细胞数量有限,主要应用于儿童患者,近年来,人们尝试将两份脐血混合输入,用于成人血液系统疾病的治疗。目的:定量监测双份异基因脐血用于成人白血病患者移植后两份脐血的植入状态、嵌合体类型、相对数量的动态变化及演变规律。设计:以脐血干细胞移植的供受者为观察对象,供受者移植前及受者移植后不同时间段的系列血样提取DNA作为检测标本,短串联重复序列遗传位点为观察指标。单位:深圳市血液中心输血医学研究所免疫遗传重点实验室。对象:纳入2005-06在北京大学深圳医院住院治疗的急性髓细胞白血病患者,男性,43岁,体质量75kg。首次化疗完全缓解后6个月移植两份人类白细胞抗原(HLA)各一个位点不合的非血缘脐血,脐血1有核细胞数为2.5×107kg-1;脐血2有核细胞数为1.53×107kg-1。脐血来源于广州脐血库。患者对治疗方案知情同意。方法:采用荧光标记复合扩增短串联重复位点嵌合体定量检测技术,对急性髓细胞白血病成人患者移植两份(脐血1有核细胞数为2.5×107kg-1,脐血2有核细胞数为1.53×107kg-1)HLA各一个位点不相合的异基因脐血前后的序列血样进行了9个短串联重复序列位点的检测,利用供、受者之间的差异位点定性判断脐血是否植入以及嵌合体类型;而后根据377XLDNA测序仪上荧光扫描后两供者差异基因检出峰的峰面积计算脐血植入后患者体内两份脐血的相对数量,定量分析供体细胞植入程度及演变规律。并与采用HLA差异基因对植入状态的分析结果进行对比。主要观察指标:在成人移植双份脐血后,观察患者及两供者9个位点的短串联重复序列基因在患者体内的转变过程,对植入状态进行定量及定性的描述。结果:移植后15d两份脐血植入状态为完全双份供者嵌合体,患者体内脐血1的相对细胞数量占51.3%,脐血2占48.7%;30d时脐血1上升为70.0%,脐血2下降为30.0%。52d时只检测到脐血1的基因,植入状态转为完全单份供者嵌合体,有核细胞数少的一份脐血被排斥,有核细胞数多的一份长期植入。结论:荧光标记复合扩增短串联重复序列嵌合体定量检测可精确地描述两份脐血的植入程度及变化过程,为临床脐血的应用及供者的选择提供了一个准确、可靠的实验依据,证明双份HLA各一个位点不合的脐血同时用于成人的移植是可行的。     

造血干细胞移植后植入状态的动态定量监测研究

目的 通过对造血干细胞移植后患者的短串联重复多态性序列(short tandem repeats,STR)位点进行定性和定量检测,实时动态监测供体细胞(doner cell,DC)的植入程度及嵌合体变化过程.方法 采用荧光标记多重PCR扩增技术,对36对移植前供、受者血样及移植后受者不同时间点的血样进行15个STR位点的检测,根据供、受者之间的差异位点判断DC在受者体内的植人情况,进而对患者的移植是否成功以及嵌合体类型[完全供者嵌合体(complete chimerism,CC)或混合嵌合体(mixed chimerism,MC)]进行定性判断;根据混合嵌合体中供、受者细胞的相对数量定量分析供体细胞的植入程度及演变规律.结果 36对供受体中检出有差别的STR位点为8～15个(平均为11.9个),移植后患者体内最早可检测到供者STR基因的时间为5～14 d(平均为7.56 d).动态监测结果表明36例患者中有31例形成稳定CC,STR位点由受者型向完全供者型转化的平均时间为14.17 d[(9～23)d].有5例形成MC,其中4例为持续MC,1例在移植后49 d转为CC并持续保持.结论 造血干细胞移植中,供受者STR基因位点的定性和定量检测,不仅可为临床提供判断移植是否成功的早期直接证据,且通过分析移植物的嵌合状态及其变化,有助于预警白血病的复发和原发疾病治疗.

Abstract：

Objective To monitor the transplantation level of donor-cell and the variation of the chimera at real-time, according to a qualitative and quantitative detection of the short tandem repeat (STR)loci labeling with fluorescence in the hematopoietic stem cell of transplantation patients. Methods Using multiplex polymerase chain reaction (PCR) method, we detected 15 STR loci labeling with fluorescence in blood samples of 36 donor-recipient pairs. According to the different genotypes of STR loci between donors and recipients, we qualitatively evaluated whether the donor cells were successfully transplanted and the type of chimera (mixed or completed). According to the relative quantity of donor cells and recipient cells in the mixed chimera, we quantitatively analyzed the transplantation level and the variation regularity of the donor cells. Results Eight to fifteen different STR loci were found in the 36 donor-recipient pairs (means at 11.9). The first time of the donor's STR gene which detected in the recipient was range from 5 to 14 days (means at 7.56 days). The ambulant monitoring results indicated that 31 of 36 recipients were transformed as completed chimera(CC) and the average completely transformed time of STR genotypes from recipient to donor was 14.17 days (from 9 to 23 days). Five recipients were found as mixed chimera (MC), among them, 4 recipients were found as continuous MC and the other one was transformed as continuous CC after 49 days. Conclusion In hematopoietic stem cell transplantation, qualitative and quantitative detection of STR loci in donor-recipient pairs could provide the early direct evidence to evaluate whether the donor cells are successfully transplanted. It also alarms the relapse of leukemia and the treatment of protopathy by analyzing the type and the variation of the chimera.     

异基因造血干细胞移植植活状态的变性高效液相色谱检测研究的首次报告

异基因造血干细胞移植后动态检测供者嵌合状态对判断移植效果和实施临床早期干预治疗具有重要意义。在临床上已有多种方法用于植活检测，本研究用变性高效液相色谱(DHPLC)技术结合聚合酶链反应扩增短串联重复序列(STR—PCR)检测造血干细胞移植植活状态的特点及可靠性。用非亲缘个体的系列DNA混合体在体外检测此测定方法的可行性和半定量结果的准确性。结果表明，体外模拟混合嵌合体检测实验，显示扩增前供者DNA嵌合百分率与扩增后供受者DHPLC色谱峰峰面积比值呈直线相关，最小检出DNA百分比为5％。用该方法分析51例移植对的结果显示：45例均至少有2个可以区分彼此的有信息住点(另外5例无移植前受者标本，1例为同卵双生双胞胎)；39例与荧光标记多重PCR扩增STR结合毛细管电泳方法进行对照，准确性为100％；29例与性染色体FISH分析，27例与特殊基因标记的分析结果一致；所有病例均检测到完全供者细胞嵌合状态(FDC)；对3例患者观察到临床复发的同时，检测到供者嵌合体的比例明显下降，其中2例为混合嵌合体，1例转变为受者自身型。在此基础上，我们将该方法首次用于对8例人类白细胞抗原(HLA)配型不同一单倍型亲缘供者干细胞及无血缘关系脐带血混合移植患者植活情况的动态检测。结果显示，8例混合移植患者STR—PCR检测结果均为FDC，来源均为亲缘供者。结论：用DHPLC技术结合短串联重复序列具有快速、经济、无污染和自动化高等特点，用于检测异基因造血干细胞移植物植活状态是可靠的。     

基于免疫磁珠分选的调节性T细胞亚群嵌合性定量分析

为了探讨免疫分选偶联短串重复序列（STR）方法用于调节性T细胞（Treg）嵌合性定量监测的可行性,以淋巴细胞不同比例混合制备14组人工嵌合体血样,以单个核细胞为起点,以免疫磁珠阴性和阳性选择法获取CD4＋CD25＋Treg细胞,分选后的Treg细胞再进行16位点的STR长度多态性分析。结果显示,从分选后的Treg细胞提取的DNA量能满足STR检测要求,当嵌合体中受体比例≥10%时,16个STR位点均能检出受体和供体特异性等位基因,按照STR峰面积计算的受体比例与理论值相符;当受体比例≤1%时,仅有部分位点能检出受体特异性等位基因,实测嵌合率与理论值存在差异。结论：建立了基于免疫分选的Treg细胞嵌合性定量分析方法,对造血嵌合体的检出灵敏度和准确性在1%-10%,可用于造血干细胞移植术后嵌合体监测。     

嵌合体的动态定量检测在异基因造血干细胞移植中的应用

目的　建立荧光标记的多重PCR扩增短串联重复序列 (STR PCR)结合毛细管电泳 ,定量检测供体细胞 (DC)嵌合率的方法 ,并探讨该方法的连续定量检测对异基因造血干细胞移植 (allo HSCT)后转归的预警作用。方法　采集 31例接受骨髓移植 (BMT)或非清髓外周血干细胞移植 (NST)患者移植前、移植后不同时段的外周血或骨髓。DNA样本用ProfilerPlus商品化试剂盒扩增后 ,用ABI 310遗传分析仪进行毛细管电泳 ,确定基因位点及峰面积 ,根据供受体基因型的差异选择嵌合率计算公式。结果　 31例患者中 15例 (48.4 % )为性别相合移植 ,只能通过STR PCR进行嵌合体的定量分析 ;性别不合移植患者用STR PCR和荧光原位杂交两种方法定量测得的DC嵌合率一致 ;31对供受体中能区别出供受差别的STR位点有 6 .7(2～ 10 )个 ,所有患者均在移植后 7天 ( 7天 )出现供体来源的细胞 ,BMT组 7天、 14天和 1个月DC中位数均明显低于NST组 ,而在移植中后期无显著性差异。 2 1天时BMT和NST患者均达稳定嵌合 ,DC在 92 %以上 ;中位随访 17(3.5～ 2 9.0 )个月 ,2 6例患者DC≥90 % ,均获得持久植入 ,至今均为无白血病生存。另有 5例患者出现不稳定混合嵌合 (MC)状态 (DC为2 7.3%～ 6 2 .7% ) ,其中 4例复发 ,1例出现移植物被排斥。上述 5例患者均     

用荧光标记短串连重复复合扩增技术监测骨髓移植存活

目的探讨荧光标记短串联重复(STR)复合扩增技术监测骨髓移植存活的价值,为观测骨髓移植疗效提供可靠方法。方法用荧光标记引物对D12S391、D18S865、D20S161这3个STR位点进行PCR复合扩增,用ABI310遗传分析仪对扩增后产物进行分离和分型,并对56例移植后病人做移植物存活鉴定检测。结果有52例移植后病人的3个STR位点的分型完全表现供者源性,与受者移植前不同;4例表现为供/受体干细胞混合嵌合状态。结论荧光标记STR复合扩增体系特异性强,成本低,个体识别力高,检测灵敏、快速、简便,结合临床判断可作为骨髓移植效果评定的有力指标。     

异基因骨髓移植后嵌合状态的研究进展

骨髓移植是许多血液系统疾病和免疫缺陷性疾病的有效治疗措施，移植成功与否与供细胞在受体内的植入状况即嵌合状态的形成有关。由于造血干细胞输入量、供和受T细胞量、预处理方案以及移植时患病情等因素的影响，可以形成不同形式的嵌合状态。如果受的骨髓或外周血中完全是供的细胞，则形成完全的供嵌合状态（CC）；当检测到供和受两种细胞成分时，则为混合嵌合状态（MC）。不同形式的嵌合状态，以及嵌合状态形式的不同演变趋势，其临床意义各不相同。检测嵌合状态的方法有多种，包括微卫星检测、染色体核型分析、血型转换、红细胞抗原、限制性片段长度多态性、可变数目串联重复序列以及现在最常用的PCR法。本从上述几个方面对嵌合状态研究的进展进行了综述。     

同种异基因造血干细胞移植后基于血细胞嵌合状态的个体化免疫治疗

目的:研究同种异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后血细胞嵌合率变化与复发的关系;观察根据血细胞嵌合率变化给予个体化免疫抑制剂治疗和供者淋巴细胞输注(DLI)的疗效。方法:106例供者细胞顺利植入的allo-HSCT患者,采用聚合酶链反应(PCR)扩增短串联重复序列的方法,动态检测移植后T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞的嵌合率。根据血细胞嵌合率的变化调整免疫抑制剂剂量和DLI的使用。结果:6例患者在移植后2个月,供者T细胞嵌合状态一直为混合嵌合(MC),将免疫抑制剂减量后均达到完全供者嵌合(FDC)。12例患者在移植后1～5个月,发生供者T细胞嵌合率下降,予免疫抑制剂减量后转为FDC。24例患者血液学复发或髓外复发(进展),有6例在复发前共发生10例次血细胞嵌合率下降,经免疫抑制剂减量或停药后一度回升至FDC,但最终血液学或髓外复发。12例患者在复发或疾病进展后停用免疫抑制剂,共给予DLI23例次,其中8例在DLI前或后给予化疗,最终5例再次达到完全缓解,其余患者最终均因疾病复发死亡。Ⅱ度及Ⅱ度以上急性移植物抗宿主病(GVHD)发生率为28.3%。慢性GVHD发生率为55.7%。中位随访期为17(1.5～90.0)个月,无病生存65例,死亡41例。67例标危患者预期3年生存率为59.0%;39例高危患者预期3年生存率为44.7%。结论:T淋巴细胞、NK细胞和B淋巴细胞的嵌合状态可作为血液恶性肿瘤复发的预测指标;基于血细胞嵌合率的个体化免疫治疗可以推迟甚至避免临床复发,且不增加急性GVHD的发生。