肝细胞生长因子对肿瘤坏死因子α及放线菌素D所致大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的探讨肝细胞生长因子(HGF)对肿瘤坏死因子(TNF)α及放线菌素D作用下的大鼠心肌细胞凋亡特性的影响及其信号机制,以寻求全身性感染及感染性休克状态下保护心肌细胞的新手段。方法通过流式细胞术、荧光显微镜技术及原位细胞凋亡检测,观察HGF(终浓度分别为10、30、100 ng/ml)对TNF-α(终浓度为5 nM)加用放线菌素D(终浓度为0.05μg/ml)所致大鼠心肌细胞凋亡模型的影响,并观察磷脂酰肌醇3激酶抑制剂LY294002(终浓度20μM)或丝裂原活化的蛋白激酶抑制剂U0126(终浓度30μM)能否阻断HGF的作用。结果HGF能够抑制放线菌素D与TNF-α共同作用下的培养大鼠心肌细胞凋亡,并呈现量效关系。与LY294002共孵育,HGF抑制凋亡的效应被阻断,而加用U0126不能阻断HGF的作用。结论HGF能够保护放线菌素D与TNF-α共同作用下的培养大鼠心肌细胞免于凋亡,且通过磷脂酰肌醇3激酶传导途径发挥作用。     

褪黑素对肺炎链球菌溶血素致大鼠脑损伤细胞凋亡的影响

目的 探讨褪黑素(MT)对肺炎链球菌溶血素(PLY)致脑损伤细胞凋亡的影响.方法 幼鼠84只随机分成3组:9 g·L-1盐水组(NS组)28只,颈内动脉注射9 g·L-1盐水;PLY组28只,颈内动脉注射0.2 mL(7 μg)PLY; MT组28只,腹腔注射(1 g·L-1)MT 10 ng·kg-1,15 min后颈内动脉注射0.2 mL(7μg)PLY.每组按照注射后不同的时间点(24 h、48 h)分为2个亚组.预定时间点处死动物,制备脑组织标本.干湿质量法测定其脑组织含水量( BWC),甲酰胺法测定伊文思兰(EB)水平,免疫组织化学技术测定凋亡诱导因子(AIF)表达,原位末端标记法检测细胞凋亡.结果　HE染色光镜下可见PLY组血管间隙增宽,大脑皮质炎性细胞浸润,胶质细胞和神经无细胞有不同程度肿胀、空泡变性.NS组无上述病理变化.MT组大鼠脑组织改变较PLY组轻.PLY组各时间点脑组织BWC水平、EB水平、AIF水平明显增加,24h高于48 h,差异有统计学意义.PLY组各时间点凋亡细胞数明显增加,48 h高于24h,差异有统计学意义.各时间点PLY组与对照组比较均有统计学差异.予以MT干扰后各时间点脑组织各指标以及凋亡细胞数均降低,与PLY组比较,差异有统计学意义.结论　MT能够降低AIF表达,减少神经细胞凋亡,保护脑组织.     

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1和凋亡诱导因子在缺氧缺血性脑损伤新生大鼠亚细胞器中的表达

目的 研究聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)和凋亡诱导因子(AIF)在缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠脑皮质细胞线粒体、胞质、胞核中的动态变化,探讨PARP-1诱导AIF核转位的机制和AIF在HIBD中的作用.方法 新生7 d SD大鼠随机分为2组:假手术组和缺氧缺血(HI)组.每组按观测时间点的不同分为3 h、6 h、12 h、24 h、3 d、7 d 6个亚组,每个亚组8只.在每个时间点将大鼠断头取皮质脑组织匀浆,行亚细胞器分离,用Western blot方法 测不同时间点亚细胞器中AIF、PARP-1的动态变化.用末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法染色法检测相应时间点光镜下脑皮质组织的凋亡细胞数.结果 1.HI后AIF在脑皮质亚细胞器中的表达变化:假手术组各个时间点的线粒体内均有AIF表达,且无量的变化,在胞质内有少量表达,而在胞核内无表达;HI组线粒体内AIF 3 h开始增加,6 h达到高峰后下降,7 d时基本降至正常,与假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05);AIF到胞质和胞核转位从HI后3 h开始增加,24 h胞质、胞核内均达到高峰,随后下降,到7 d时仍高于假手术组(P<0.05).2.PARP-1仅在各组胞核中有少量表达,但在胞质、线粒体内无表达.3.HI后3 h结扎侧脑皮质开始有少量的凋亡细胞增加,24 h达高峰,随后下降.结论 AIF在HIBD新生大鼠线粒体、胞质、胞核内均是增加的,胞质、胞核内表达高峰滞后于线粒体;AIF在其胞质、胞核内转位趋势与脑皮质凋亡细胞数变化在时间上一致;PARP-1不能转位到线粒体内直接诱导AIF的核转位.     

褪黑素在脂多糖致幼鼠脑损伤中的保护作用

目的 探讨褪黑素(MT)在不同时间点对脂多糖(LPS)致幼鼠脑损伤中的保护作用及意义.方法 160只1月龄Spragne-Dawley幼鼠(100-120 g)随机分为4组:LPS组、对照组、MT提前15 min给药组(A组)和MTO h给药组(B组).每组40只,各组均按观察时间分为24、48 h 2个时间点,各时间点20只,均有10只不注射伊文思蓝(EB),待观察至相应时间点采用免疫组织化学方法检测各组幼鼠脑组织神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达,原位末端标记法(TUNEL)检测神经细胞的凋亡阳性细胞数,余幼鼠于相应时间点经右颈外静脉近心端注入EB,采用甲酰胺法测定相应时间点脑组织中EB水平.结果 各组幼鼠脑组织24、48 h NSE阳性区面积、凋亡阳性区面积及EB水平比较,差异均有统计学意义(F=705.44,369.96,1 719.05,890.55,1041.46,219.06 Pa<0.01).A、B组幼鼠脑组织24、48 h NSE阳性区面积、凋亡阳性区面积及EB水平比较,差异均无统计学意义(t=0.474,0.588,0.842,0.855,0.732,0.90 Pa>0.05).结论 LPS可诱导幼鼠脑组织神经细胞凋亡;MT可抑制脑组织凋亡阳性细胞表达,具有显著的抗凋亡作用.实用儿科临床杂志,2009,24 (10):777-779     

缺氧缺血性脑损伤幼年大鼠血浆中促肾上腺皮质激素释放因子水平变化

目的 探讨缺氧缺血性脑损伤幼年大鼠血浆中促肾上腺皮质激素释放因子( corticotropin releasing factor,CRF)水平的变化.方法 将240只幼年大鼠随机分成3组:缺氧缺血性脑损伤模型组(模型组)、假手术组和正常对照组,每组80只.3组大鼠在缺氧缺血后1h、3h、6h、12 h、1d、3d、5d、18d8个时间点,按每10只为一亚组,分别观察血浆CRF水平的变化.采用放射免疫法测定幼年大鼠血浆CRF水平.结果 幼年大鼠在缺氧缺血后1h、3h、6h、12h这4个时间点,模型组与假手术组、正常对照组血浆CRF水平比较差异无统计学意义(P＞0.05);而模型组在缺氧缺血后第1天和第3天,血浆CRF水平显著低于假手术组和正常对照组(P＜0.001),在缺氧缺血后的第5天和第18天,模型组大鼠血浆CRF恢复到对照组水平(P＞0.05).结论 缺氧缺血影响幼年大鼠血浆CRF水平,与缺氧缺血后的时间有关.     

铁离子螯合剂对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑组织缺氧诱导因子1α表达的调节及机制

目的 探讨铁离子螯合剂(DFO)对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的调节作用及机制.方法 以10日龄SD大鼠48只为研究对象,分为假手术组、缺氧缺血(HI)组、DFO干预组和9 g·L-1盐水对照组,每组分为缺氧后 4 h、8 h及24 h 3个亚组,参照Rice模型制作HIBD动物模型,并经腹腔内注射DFO及9 g· L-1盐水干预.应用Western blot法检测分析其HIF-1α、Akt及p-Akt蛋白表达.RT-PCR检测分析HIF-1α mRNA表达.结果 HI组HIF-1α蛋白4 h 即明显增多,8 h达高峰,24 h开始下降,9 g·L-1盐水对照组与HI组有相同变化.而DFO干预组4 h达高峰,8 h及24 h仍在较高水平,与HI组比较各时间点HIF-1α蛋白表达均增多,差异均有统计学意义(Pa<0.05).DFO干预组和HI组各时间点HIF-1α蛋白表达与假手术组比较均增高(Pa<0.05).HI组与DFO干预组各时间点Akt蛋白表达无明显差异(P>0.05),2组p-Akt蛋白表达有相同趋势,缺氧 4 h HI组与DFO干预组p-Akt蛋白表达无显著性差异.然而与HI组比较,DFO组HIF-1α mRNA表达均有增加.结论 在新生鼠HIBD时,DFO可上调HIF-1α蛋白及mRNA表达,使HIF-1α蛋白表达高峰时间提前,且持续时间延长,在此过程中PI3K/Akt信号通路未参与DFO对HIF-1α的调节.     

缺氧缺血性脑损伤新生大鼠心肌细胞凋亡及凋亡蛋白Bax、Bcl-2表达的变化

目的 了解缺氧缺血性脑损伤新生大鼠心肌细胞凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达的变化.方法 通过结扎7 日龄新生大鼠一侧颈总动脉,吸入低浓度氧复制缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的动物模型,并没假手术对照(NC)组,两组分别于HIBD后1 h、4 h、12 h、24 h、48 h、72 h、7 d取心脏组织,应用TUNEL法检测心肌细胞凋亡,SP法检测心肌细胞Bax、Bcl-2蛋白的表达.结果 NC组偶见心肌阳性凋亡细胞1～4个/mm~2,各时间点阳性细胞数差异无统计学意义(F=0.5,P>0.05).HIBD组12 h心肌阳性凋亡细胞开始增多,为(14.40±3.21)个/mm~2;72h达高峰,为(26.80 ±2.28)个/mm~2,12～72 h各时间点阳性凋亡细胞明显高于NC组(P<0.05);7 d阳性细胞数减少,但仍高于NC组.NC组大鼠心肌组织Bax呈阳性表达,Bcl-2呈弱阳性表达.HIBD组Bax于24 h开始增高.72 h表达最明显,7 d时表达有所降低,24 h～7 d表达高于NC组(P<0.05);Bel-2于24 h表达开始增高,以后缓慢增高,72 h达高峰,24 h～7 d较NC组表达增高,差异有统计学意义(P<0.05).HIBD组Bcl-2/Bax比值逐渐降低.Bax、Bcl-2的表达与凋亡细胞数之间均星直线正相关(r=0.921、0.980,P均<0.01).Bcl-2/Bax的比值与凋亡细胞数无相关性(r=0.702,P>0.05).结论 HIBD新生大鼠心肌细胞存在凋亡,心肌细胞Bax、Bcl-2蛋白表达增加,且与心肌细胞凋亡有关.     

外源性血管内皮生长因子基因对新生鼠缺氧缺血性脑损伤脑细胞凋亡的影响

目的 探讨外源性血管内皮生长因子(VEGF)基因对新生鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)脑细胞凋亡的影响.方法 将36只7日龄新生大鼠随机分为对照组和治疗组,制备HIBD大鼠模型,经前囟分别注射空载质粒PCDNA 3.1和负载VEGF 120 cDNA的质粒PCDNA 3.1(100μg/只),应用流式细胞仪检测脑细胞的凋亡情况.结果 治疗组的脑细胞凋亡率为8.93±0.332,明显低于对照组的17.505±0.949,差异有非常显著性(P<0.01).结论 外源性VEGF可以减少脑细胞的凋亡,可能成为治疗HIBD的一条新途径.     

缺氧缺血性脑损伤新生大鼠核因子κB表达与脑细胞凋亡的关系

目的观察核因子κB（NF—κB）在缺氧缺血性脑损伤（HIBD）新生大鼠脑细胞凋亡中的表达，探讨其HIBD后NF—κB与细胞凋亡的关系。方法新生7日龄SD大鼠48只，随机分为2组：假手术组和缺氧缺血（HI）模型组，各24只。HI组大鼠采用Rice方法建立新生大鼠HIBD模型，分别于手术后6、24、48、72h取脑组织切片，用免疫组织化学方法检测NF—κB在海马区的表达、TUNEL方法检测神经细胞凋亡。假手术组不作缺氧缺血处理，采用同样方法检测NF—κB。结果假手术组海马区有少量NF—κB表达，且有少量凋亡细胞，各时间点无明显变化（Pa〉0．05）；HI组NF—κB的表达在6h后开始增加，48h达高峰，并持续至72h（P〈0．05），与假手术组相比较差异有统计学意义（Pa〈0．05）；细胞凋亡在6h即开始增加，在24、48、72h逐渐增加，随时间变化差异有统计学意义（Pa〈0．05），与假手术组相比差异有统计学意义（Pa〈0．05）；直线相关回归分析HI组NF—κB表达与细胞凋亡呈显著正相关（各时点的r=0.478，0.552，0.641，0.627 Pa〈005．缩诊HTBn后NF—κB在海马区的持续活化对促进神经细胞凋亡起重要作用。     

内毒素诱导幼年大鼠脑神经细胞凋亡及脑组织ERK表达的变化

目的 研究ERK在内毒素诱导脑神经细胞凋亡中的作用,为早期干预提供理论依据.方法 10日龄Wistar大鼠,随机分为LPS诱导脑损伤组(LPS组)和生理盐水组(NS组).于腹腔注射后6、12、72 h采用原位细胞凋亡检测法(TUNEL 法)检测脑组织细胞凋亡情况,采用免疫组织化学法检测脑组织ERK表达情况,阳性细胞的染色强度转变为量化指标,计算其平均光密度.结果 (1)LPS组6 h开始出现凋亡细胞,但凋亡指数与NS组差异无显著性(P＞0.05),12 h可见凋亡细胞数逐渐增多,72 h最多,明显高于NS组,差异有显著性(P＜0.05,P＜0.01).(2)6 h时LPS组ERK表达高于NS组,差异有非常显著性(P＜0.01).12 h时LPS组ERK表达下降,低于NS组,差异有非常显著性(P＜0.01).72 h时两组间差异无显著性(P＜0.05).结论 内毒素可以诱导幼年大鼠脑神经细胞凋亡,ERK被激活可能参与凋亡的发生.     

Effect of lipopolysaccharide on global gene expression in the immature rat brain

To improve the understanding of the molecular mechanisms whereby lipopolysaccharide (LPS) affects the immature brain, global gene expression following LPS exposure was investigated in neonatal rats. Brains (n = 5/time point) were sampled 2, 6, and 72 h after LPS and compared with age-matched controls. The mRNA from each brain was analyzed separately on Affymextrix GeneChip Rat Expression Set 230. The number of genes regulated after LPS were 847 at 2 h, 1564 at 6 h, and 1546 genes at 72 h. Gene ontology analysis demonstrated that, at both 2 and 6 h after LPS, genes associated with protein metabolism, response to external stimuli and stress (immune and inflammatory response, chemotaxis) and cell death were overrepresented. At 72 h, the most strongly regulated genes belonged to secretion of neurotransmitters, transport, synaptic transmission, cell migration, and neurogenesis. Several pathways associated with cell death/survival were identified (caspase-tumor necrosis factor alpha [TNF-alpha]-, p53-, and Akt/phosphatidylinositol-3-kinase (PI3 K)-dependent mechanisms). Caspase-3 activity increased and phosphorylation of Akt decreased 8 h after peripheral LPS exposure. These results show a complex cerebral response to peripheral LPS exposure. In addition to the inflammatory response, a significant number of cell death-associated genes were identified, which may contribute to increased vulnerability of the immature brain to hypoxia-ischemia (HI) following LPS exposure.     

血管内皮生长因子家族在缺氧缺血性脑损伤发病中的作用

血管内皮生长因子 (VEGF)家族在正常脑组织中呈低水平表达 ,脑缺氧缺血可诱导VEGF及其受体mRNA和蛋白的表达。内源性VEGF具有促进血管新生及神经保护作用。应用分子生物学及免疫组织化学技术动态观察新生鼠缺氧缺血性脑损伤 (HIBD)时VEGF家族的表达及其在脑组织中分布变化情况 ,有利于阐明HIBD的发病机制 ,为临床上应用VEGF治疗HIBD提供理论依据     

缬沙坦恢复哮喘大鼠气道肝细胞生长因子的生成及其意义

目的：探讨血管紧张素受体拮抗剂(AT1)缬沙坦,对恢复哮喘大鼠气道肝细胞生长因子(HGF)的生成与哮喘气道重塑的关系和意义。方法：SD清洁级大鼠32只,体重在100±10g,随机分为4组:A组:正常对照组,B组:卵蛋白(OVA)激发2周组,C组:OVA激发4周组,D组:OVA激发4周后缬沙坦干预组。用免疫组化法测定各组大鼠气道的HGF,AngII和TGF-β1的表达变化,苏木精-伊红染色观察气道病理变化。结果：A组HGF较B组有明显差异[(5.49±1.34)%vs(10.69±0.96)%,P<0.05],C组为(11.85±0.87)%,较A组升高(P<0.05),D组为(15.58±1.06)%,较B组、C组升高。AngII和TGF-β1的表达则随着OVA激发时间的延长而增加,在使用缬沙坦后两者都明显下降。经抗原致敏和激活的大鼠气道上皮脱落炎性细胞堆积呈现明显的病理改变,而缬沙坦干预组的病理改变较轻,上皮细胞较完整,炎性细胞和纤维细胞较少。结论：①HGF随着气道重塑变化浓度有所改变,说明早期HGF即有保护气道作用,和TGF-β1呈负相关性,有拮抗纤维化的作用;②AT1可改善气道重塑过程,可能是通过升高气道HGF水平达到抗纤维化的作用。     

外源性bFGF对缺氧缺血新生大鼠脑c-Fos表达影响的研究

探讨外源性碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠脑c-fos基因蛋白产物(c-Fos)表达影响,研究原癌基因c-fos表达与HIBD的关系,采用免疫组织化学染色及定量图像分析方法,观察c-Fos表达强度、染色灰度及面积的变化.结果显示正常生后7-14 d新生大鼠脑有c-Fos表达,以生后10 d最为明显;缺氧缺血20min后即刻c-Fos表达增强,并于缺氧缺血后4 h达高峰,持续至72 h;脑内不同部位c-Fos表达时间、强度、灰度及面积不同.连续腹腔注射外源性bFGF 3 d后鼠脑c-Fos表达增强.结论外源性bFGF可增强HIBD新生大鼠脑c-Fos的表达,bFGF及c-fos基因可能参与HIBD修复的病理生理过程.     

丹参减轻肠外营养所致新生兔肝细胞损害的实验研究

目的研究氧化损伤及肝细胞凋亡在肠外营养(PN)相关肝损害机制中的作用,并探讨中药丹参减轻PN相关肝损害的有效性。方法采用生后6-8 d的新西兰种白兔,体重80-110 g,随机分为3组:①正常对照组(n=10),母乳喂养;②PN组(n=10),持续输注静脉营养液(244)ml·kg-1·d-1)10 d;③PN+丹参组(n=10),在静脉营养液中加人丹参(0．2 ml·kg-1·d-1)。持续静脉营养10d后,分别取血作肝功能生化检测,取肝组织作光镜病理、电镜检查,氧化损伤(丙二醛MDA含量测定)及凋亡细胞(TUNEL法)检测。结果PN组血直接胆红素、胆汁酸均明显高于正常对照组和PN+丹参组(均P<0．05)。肝脏病理显示:PN组可见肝细胞空泡变性、脂肪变性,有多发细胞内淤胆和胆栓形成;PN+丹参组门脉区少量炎细胞浸润,无胆管扩张和胆汁淤积表现;病理学总评分3组分别为:8,22,15,组间两两比较P<0．01。电镜肝细胞细胞器超微结构变化与光镜病理改变相符, PN组可见毛细胆管扩张、微绒毛消失,线粒体肿胀、部分可见脂肪变性,以及早期凋亡表现。MDA检测PN组明显高于对照组(2．04±0．44比1．35±0．29mmol／mgpro,P<0．05)和PN+丹参组(2．04±0．44比1．19±0．14mmol／mgpro,P<0．05)。TUNEL,法检测3组肝细胞凋亡阳性率(％)分别为: 0．92±0．85、44．59±6．68、9．27±7．28,3组两两比较均P<0．01。结论PN可导致新生兔肝细胞出现氧化损伤及凋亡,产生肝损害;而中药丹参可明显减轻PN所致肝细胞损害。     

Decreased expression of hepatocyte growth factor in the nitrofen model of congenital diaphragmatic hernia

Purpose

Pleuroperitoneal folds (PPFs) are essential for normal diaphragmatic development, representing the only source of the diaphragm’s muscle connective tissue. Hepatocyte growth factor (Hgf), which is secreted in PPFs, plays a crucial role in the formation of the muscular diaphragmatic components by regulating the migration of myogenic progenitor cells into the primordial diaphragm. Hgf is also a known downstream target of Gata4 and it has been demonstrated that the expression of Hgf was significantly downregulated in PPF cells of Gata4 knockouts with congenital diaphragmatic hernia (CDH). Furthermore, mutations in PPF-derived cells have been shown to result in CDH. We hypothesized that Hgf expression is decreased in developing diaphragms of fetal rats with nitrofen-induced CDH.

Methods

Timed-pregnant rats were exposed to either nitrofen or vehicle on gestational day 9 (D9). Fetuses were harvested on selected time-points D13, D15 and D18. Dissected diaphragms (n = 72) were divided into control and nitrofen-exposed specimens (n = 12 per time-point and experimental group, respectively). Diaphragmatic gene expression of Hgf was analyzed by qRT-PCR. Immunofluorescence double staining for Hgf and the mesenchymal marker Gata4 or muscular progenitor marker Myogenin was performed to evaluate protein expression and localization in fetal diaphragms.

Results

Relative mRNA expression of Hgf was significantly downregulated in PPFs of nitrofen-exposed fetuses on D13 (3.08 ± 1.46 vs. 5.24 ± 1.93; p < 0.05), developing diaphragms of nitrofen-exposed fetuses on D15 (2.01 ± 0.79 vs. 4.10 ± 1.50; p < 0.05) and fully muscularized diaphragms of nitrofen-exposed fetuses on D18 (1.60 ± 0.78 vs. 3.21 ± 1.89; p < 0.05) compared to controls. Confocal laser scanning microscopy revealed markedly diminished diaphragmatic immunofluorescence of Hgf in nitrofen-exposed fetuses on D13, D15 and D18 compared to controls, which was associated with disruptions in muscle connective tissue formation and reduced myogenic progenitor cell invasion.

Conclusion

Decreased diaphragmatic expression of Hgf may disturb the formation of muscle connective tissue in PPFs and thus prevent essential migration of muscle progenitor cells into the developing diaphragm, leading to diaphragmatic defects in the nitrofen CDH model.

     

血管内皮细胞生长因子对脑损伤的保护作用研究近况

血管内皮细胞生长因子(VEGF)主要由血管内皮细胞产生,可促进新生血管形成.越来越多的研究发现ⅥⅫ对于中枢神经系统具有营养作用.可通过促有丝分裂作用增加神经元的生长和存活.在神经系统损伤后VEGF具有多效性的影响,能够保护缺氧状态下神经干细胞的存活,促进神经新生,为神经系统损伤的防治开辟了新的途径.