聚合酶链反应掺入法制备标记地高辛探针检测间日疟原…

根据间日疟原虫环子孢子蛋白基因设计合成特异性引物一对，采用ＰＣＲ技术，以Ｄｉｇ－１１－ｄＵＴＰ代替部分ｄＴＩＰ直接扩增并标记含间日疟原虫环子孢子蛋白基因中央重复序列的基因片段作为ＤＮＡ探针并用于检测间日疟原虫感染，结果表明；（１）采用ＰＣＲ法直接制备并标记地高辛探针的方法较ＰＣＲ扩增后再标记的方法更为快速，简便和经济；（２）探针只与间日疟中层得血样核到抽提物杂交阳性，而与其亲缘关系相近的三株恶性疟     

间日疟原虫环子孢子蛋白基因片段的扩增应用于诊断间日疟感染的研究

根据间日疟原虫环子孢子蛋白（ＣＳＰ）基因序列，设计并合成间日疟原虫特异性引物一对，采用聚合酶链反应技术，进行间日疟原虫感染的检测。结果：（１）从间日疟原虫患者的全血ＤＮＡ中扩增出约７７２ｂｐ的基因片段，经限制性内切酶切，证实为间日疟原虫ＣＳＰ基因片段；（２）与间日疟原虫亲缘关系相近的三株恶性疟原虫、弓形虫、利什曼原虫和正常人全血核酸抽提物经扩增后均未见特异性的扩增条带；（３）该检测体系可检测出间日疟原虫感染血样中２．８虫／μｌ血的水平；（４）将该检测体系用于深圳地区及湖北随州地区间日疟感染患者血样的检测，１４７份患者的血样中１４４份检出阳性，可见一条特异性扩增带，与镜检的符合率达９８％，而２０正常人血样均为阴性。上述结果表明该法灵敏、特异且稳定性好，适用于间日疟感染的检测。     

质粒型pBF_4DNA探针用于疟疾诊断的研究

质粒pBF_4DNA 用~(32)P 标记后,与现场采集的50份疟疾病人血样进行斑点杂交,9份镜检为恶性疟者杂交全为阳性,与镜检符合率为100%;41份镜检为间日疟的标本,有3份出现杂交弱阳性;10份正常人血两者检查均为阴性。DNA 探针检测恶性疟原虫的灵敏度为0.001%原虫血症。血样存放2年之久,仍可用于 DNA 杂交。     

疟疾复合PCR检测系统的建立

目的：建立简易、快速的复合ＰＣＲ系统,用于检测间日疟、恶性疟及混合感染。方法：以疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计疟原虫属特异性上游引物Ｓ１和间日疟原虫、恶性疟原虫种特异性下游引物Ｓ２和Ｓ３,建立双温度点复合ＰＣＲ扩增系统并用于临床血样的检测。结果：从间日疟原虫和恶性疟原虫感染血样中分别扩增出７０５ｂｐ和５７５ｂｐ特定扩增带,而食蟹猴疟原虫、诺氏疟原虫及健康人血样均未见扩增带。检测原虫水平达２－１０虫／μｌ全血。限制性内切酶酶切分析证实扩增产物为目的片段。检测１０４份镜检确诊疟疾患者血样,其中８１份与镜检结果相符,并查出镜检未发现的１７份混合感染和２份虫种鉴别失误的恶性疟。结论：本系统敏感性高,特异性强,操作简便,可在一次扩增中同时检出间日疟和恶性疟两种原虫。     

聚合酶链反应掺入法制备标记探针检测弓形虫感染的研究

本文采用聚合酶链反应（PCR）技术，以Dig一i1—dUTP代替部分dTTP直接制备标记弓形虫特异性rDNA基因片段作为探针，用于检测弓形虫感染。该探针和弓形虫核酸抽提物杂交阳性，而与恶性疟原虫、间日疟原虫、杜氏利什曼原虫以及正常人血样核酸抽提物杂交阴性，该探针至少可检测出相当于156虫数的水平，结果表明：PCR掺入法是一种简便、有效的制备标记探针的方法，以该法制备的弓形虫rDNA基因探针适用于弓形虫感染的诊断及流行病学调查研究。     

PCR／DNA探针检测系统用于间日疟原虫检出及基因型检测？…

根据间日疟原虫环子孢子表面蛋白（ＣＳＰ）基因序列研制了ＰＣＲ／ＤＮＡ探针检测系统,试验证明该检测方法对间日疟原虫特异,检出原虫密度为０．２个／μｌ病人阳性检出率为９６．２％,试验中对不同ＰＣＲ操作过程及试验样本不同处理方法的检测结果进行了比较。     

间日疟原虫环子孢子蛋白基因片段的扩增应用于诊断间日…

根据间日疟原虫环子孢子蛋白（ＣＳＰ）基因序列，设计并合成间日疟原虫特异性引物一对，采用聚合酶锭反应技术，进行间日疟原虫感染的检测。结果：（１）从间日疟原虫患者的全血ＤＮＡ中扩增出约７７２ｂｐ的基因片段，经限制性内切酶切，证实为间日疟原虫ＣＳＰ基因片段；（２）与间日疟原虫亲缘上近的三株恶性疟原虫，弓形虫，利什曼原虫和正常人全血核酸抽提物经扩增后均未见特异性的扩增条带；（３）该检测体系可检测出间日疟原     

PCR-ELISA检测疟原虫DNA的研究

目的：介绍一种诊断疟疾的新方法ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ。方法：根据业已报道的疟原虫ＳＳＵｒ－ＲＮＡ基因保守序列，设计并合成一对通用于恶性疟原虫和间日疟原虫的引物，其中一引物的５’端加以生物素标记。经ＰＣＲ扩增后，携带有生物素的扩增产物与先期包被于ＥＬＩＳＡ板上的亲和素结合，再经与恶性疟原虫、间日疟原虫特异、荧光素标记的寡核苷酸探针分别杂交，底物显色等步骤，使ＰＣＲ产物得以半定量地检出。结果：对于恶性疟原虫和间日疟原虫，本法检出最低原虫密度阈值分别为４和１０个原虫／μｌ血（取血２０μｌ），本法检测两种疟原虫未发现交叉反应。结论：本试验具有较高的敏感度和特异性，可望用于疟疾流行病学调查     

套式PCR扩增特定SSrRNA基因片段诊断间日疟及混合感染的研究

根据间日疟原虫（Ｐ．ｖ．）小亚单位核糖体核糖核酸（ＳＳｒＲＮＡ）基因序列，设计并合成两对特异引物，采用套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，扩增出一条长１２０个碱基对（ｂｐ）的间日疟原虫ＳＳｒＲＮＡ基因特定片段，并用于云南间日疟患者的血样检测。结果表明：该系统特异性强，除间日疟原虫外，恶性疟原虫（Ｐ．ｆ．）、三日疟原虫（Ｐ．ｍ．）及正常人血ＤＮＡ样本均无此扩增带出现。该系统检测原虫的敏感度为０．１个疟原虫／ｌμｌ血，大大高于常规镜检。在进行间日疟检测中，该系统与镜检的阳性符合率为１００％，更重要的是发现镜检漏诊的４例Ｐ．ｖ．和Ｐ．ｆ．的混合感染病例。鉴于该系统具有特异、敏感、稳定、简便的特点和鉴别疟原虫种类、判定混合感染等优点，故对疟疾的诊断、大规模流行病学研究及疫情监控具有应用价值     

重组质粒DNA探针用于间日疟诊断的研究

用＾３２Ｐ标记含间日疟原虫ＤＮＡ片段的重组质粒ｐＶＡ１作为探针，通过ＤＮＡ打点杂交试验检测红内期间日疟原虫。该探针检测间日疟原虫基因组ＤＮＡ的敏感度达１ｎｇ；与现场采集的２５份间日疟患者血样（原虫血症为０．００３％－０．７％）的杂交阳性率为７２％；与６例恶性疟和３例食蟹猴疟血样中各１例杂交阳性；与３例约氏疟和６例正常人血样均为阴性。     

PCR/DNA探针检测系统用于间日疟原虫检出及基因型检测的研究

根据间日疟原虫环子孢子表面蛋白（ＣＳＰ）基因序列研制了ＰＣＲ／ＤＮＡ探针检测系统。试验证明该检测方法对间日疟原虫特异,检出原虫密度为０．２个／μｌ,病人阳性检出率为９６．２％。试验中对不同ＰＣＲ操作过程及试验样本不同处理方法的检测结果进行了比较。在样本的原虫基因型检测分析中,基因优势型ＰＶ２１０阳性率为８８．５％,基因变异型ＰＶ２４７阳性率为１１．５％,混合型阳性率为３．８％,基因变异型均出现在云南省采集的血样中     

重组质粒DNA探针用于间日疟诊断的研究

用~(32)P标记含间日疟原虫DNA片段的重组质粒pVA1作为探针,通过DNA打点杂交试验检测红内期间日疟原虫。该探针检测间日疟原虫基因组DNA的敏感度达1ng;与现场采集的25份间日疟患者血样(原虫血症为0.003％～0.7％)的杂交阳性率为72％,与6例恶性疟和3例食蟹猴疟血样中各1例杂交阳性;与3例约氏疟和6例正常人血样均为阴性。     

应用聚合酶链反应在海南检测间日疟原虫的效果

目的： 建立适合疟疾流行区现场应用的ＰＣＲ 检测间日疟的方法, 并在现场与常规涂片镜检法进行比较。方法： 通过改良血样的采集及模板处理, 设计引物及优化反应条件等, 建立简便、敏感与特异的ＰＣＲ检测间日疟原虫的方法, 并在海南省疟疾流行区对３１０ 例间日疟患者与镜检法进行比较。结果： ＰＣＲ 检测间日疟原虫具有特异性, 其敏感性为１０ 个原虫／μｌ。ＰＣＲ检测和镜检法的阳性率分别为３４．２％ 和３１．９％ , 与ＰＣＲ比较, 镜检法有５ 例误诊或漏诊。结论： 此ＰＣＲ 法可用于现场检测间日疟患者。     

合成间日疟DNA探针在疟疾监测中的应用研究

本文报道了应用合成间日疟ＤＮＡ片段经同位素末端标记作为探针，检测了２ｌ份经镜检确诊的间日疟病人血样，结果全部阳性，敏感性可测出０．００１３３％的原虫血症，与培养的恶性疟及正常人血没有交叉反应。随后将该探针应用到疟疾监测中，在山东采集的３１０份四热病人血和２４５份流动人口血，应用本探针检测，未出现阳性结果，经镜检复核，结果相符。在安徽省滁州市采集３５２份病灶点人群血，有２８份出现了阳性，阳性率为７．９５％。对以上血样经ＩＦＡ方法进行抗体测定，显示合成间日疟ＤＮＡ探针杂交结果与抗体阳性率具有明显的一致性。结果表明本合成间日疟ＤＮＡ探针可应用于灭疟后期的疟疾监测，特别对流动人口集中检查和传染源侦查具有一定潜力。     

聚合酶链反应（PCR）技术在恶性疟诊断中的应用

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测云南疟疾病人血样５３份，结果均为阳性，可出现一条４９２ｂｐ的特异条带，与镜检符合率达１００％；同时检测间日疟血样８份及上海正常人血样１２份，均为阴性，表明本法具有高敏感性及特异性。     

套式PCR法检测间日疟原虫的研究

以滤纸采集间日疟原虫患者血样，煮沸法萃取ＤＮＡ模板，用间日疟原虫ＳＳＵｒＤＮＡ特异序列为内外引物，进行双温度点套式ＰＣＲ扩增，其检测原虫率水平为０．８４×１０＾－６，特异性强。检测云南疟区发热患者血样１６６份，检出率为６３．９％，显著高于镜检法的４８．２％。以镜检法为参照，本法的敏感性为９７％，特异性为６１％，阳性预期值和阴性预期值分别为６５％和９７％，表明是检测间日疟原虫感染的一个良好手段，可作     

逆转录聚合酶链反应检测和鉴定疟原虫的研究

在同一反应体系中建立能同时检测和鉴定恶性疟、间日疟及混合感染的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法,并用于现场采集血样检测。先以恶性疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计1对针对恶性疟原虫的特异性引物,建立RT-PCR检测恶性疟原虫方法,在此基础上,增加1条针对间日疟原虫的种特异性引物,使在同一反应体系中,能够同时扩增恶性疟原虫和间日疟原虫的特异片段。恶性疟原虫和间日疟原虫模板在同一反应体系中分别被扩增出预期大小为359bp和449bp特定扩增带,健康人血样和空白对照均未见扩增带。用建立的RT-PCR检测方法对现场采集128份血样进行检测,与镜检的阳性符合率为9609%,14份镜检为阴性的发热病人全血标本中2份RT-PCR检测为间日疟阳性。RT-PCR检测疟原虫方法具有敏感性高、特异性强的特点,对疟疾诊断、镜检质量控制和流行病学研究具有较大的实用价值。     

PCR检测疟疾混合感染的现场应用研究

目的 评价PCR检测技术在间日疟与恶性疟混合感染区诊断疟疾的现场应用价值。方法 采集海南省疟疾混合感染流行区304份滤纸干血滴样本，根据红内期疟原虫SSUrRNA基因序列，设计合成3条引物．采用PCR技术在同一反应体系中扩增出间日疟原虫和恶性疟原虫不同的DNA片段，检测现场所采样本中的间日疟原虫或恶性疟原虫DNA；同时与镜检法进行比较。结果 在304份样本中，PCR法阳性15份，其中间日疟7份．恶性疟8份；镜检法阳性11份，其中间日疟6份，恶性疟5份。镜检阳性的样本PCR均为阳性；镜检阴性而PCR阳性的4份样本，其扩增产物经限制性酶切鉴定，证实为间日疟原虫或恶性疟原虫DNA。结论 此PCR检测体系灵敏、特异．对诊断或鉴别诊断间日疟原虫和恶性疟原虫混合感染具有实用价值。     

PCR鉴别诊断间日疟及恶性疟的研究

目的 :在同一反应体系中建立能鉴别诊断间日疟与恶性疟的 PCR检测方法。方法 :根据红内期疟原虫 SSUr RNA编码基因序列 ,设计合成 3个引物 ,采用聚合酶链反应技术 ,在同一反应体系中 ,间日疟原虫和恶性疟原虫分别预期被扩增出 34 1bp和 4 31bp的 DNA条带。结果 :间日疟原虫和恶性疟原虫模板在同一反应体系中分别被扩增出预期大小的 DNA片段 ,并经限制性酶切证实 ;杜氏利什曼原虫、弓形虫、健康人血及空白对照均无特异性扩增条带 ;以该检测体系至少可检出原虫血症为 2 .56× 10 ^-7间日疟原虫感染和 1.0 8× 10 ^-5恶性疟原虫感染 ;69份镜检阳性的间日疟和 2份恶性疟患者血样 PCR检测均为阳性 ,1例发热待查患者PCR诊断为间日疟 ,与镜检复查结果一致 ,所有疟疾阳性标本中未检出混合感染 ,2 0份健康人血 PCR均为阴性。结论 :该检测体系灵敏、特异 ,对于诊断间日疟和恶性疟以及鉴别间日疟原虫和恶性疟原虫混合感染具有一定的应用价值。     

末端标记间日疟寡核苷酸探针在疟疾监测中的应用

本文报道了应用合成间日疟ＤＮＡ片段经同位素末端标记作为探针．检测了２１份经镜检确诊的间日疟病人血样，结果全部阳性．敏感性可测出０．００１３３％的原虫血症，与培养的恶性疟及正常人血没有交叉反应。随后将该探针应用到疟疾监测中，在山东采集的３１０份发热病人血和２４５份流动人口血，应用本探针检测，未出现阳性结果，经镜检复核．结果相符．在安徽省滁州市采集３５２份病灶点人群血，有２８份出现了阳性，阳性率为７．９５％。对以上血样经ＩＦＡ方法进行抗体测定，显示合成间日疟ＤＮＡ探针杂交结果与抗体阳性率具有明显的一致性。结果表明本合成间日疟ＤＮＡ探对可应用于灭疟后期的疟疾监测．特别对流动人口集中检查和传染源检索具有潜在的应用价值。