EB病毒的BARF1基因在人支气管上皮细胞恶性转化和肿瘤形成中的作用

目的探讨EBV-BARF1基因对人支气管上皮细胞生长特性的影响,并初步探讨其作用机制。方法构建真核重组表达载体pcDNA3-BARF1,转染人支气管上皮细胞(HBEC),检测BARF1基因的表达,观察细胞生长状况、生长速度,在软琼脂中集落形成能力及对裸鼠的致瘤能力。结果EBV-BARF1基因转染细胞生长旺盛,失去接触抑制能力,生长速度增快,在软琼脂中形成多个集落,并在裸鼠体内成瘤。结论EBV的早期基因BARF1能明显地改变上皮细胞的生物学行为,使细胞发生恶性转化、获得肿瘤细胞的生长特性,该基因不仅与上皮细胞的早期永生化有关,在细胞的恶性转化及肿瘤形成过程中亦可能起重要的作用。     

EB病毒潜伏膜蛋白1对人支气管上皮细胞转化作用机理的研究

背景与目的：目前许多研究显示潜伏膜蛋白1(latent membrane proteinl,LMPl)在一些上皮源性肿瘤的发生中可能起重要作用,但有关LMP1对正常上皮细胞作用的研究并不是很多。因而,本研究拟观察EBV-LMP1对人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial,HBE)的转化作用,并初步探讨其作用机制。方法：将LMP1单独或与hTERT逆病毒表达载体共同转染HBE细胞,经抗性药物筛选获得阳性细胞克隆;通过绘制细胞生长曲线,进行软琼脂集落形成试验、端粒酶活性检测和cyclin A、p2l、CDK4蛋白表达的检测,研究LMPl对HBE细胞生物学特性的影响。结果：共同转染LMP1和hTERT的HBE细胞生长旺盛。各组细胞HBE／LMP1 hTERT、HBE／LMP1和HBE／pLNsx pBabe的软琼脂集落形成率分别为22．98％、16．94％和8．85％;端粒酶活性分别为2．825、2．44l、1．876。我们进行Western blot检测发现前两组细胞cyclin A表达上调、p2l表达下调,且两组之间无明显差异;而CDK4蛋白在各组之间表达一致。结论：在转化HBE细胞的过程中,LMP1和hTERT可能具有协同作用,通过调节cyclin A和p2l蛋白的表达水平,引起细胞异常增殖,使细胞向恶性化转变。     

TPA对EB病毒体外转化人胚鼻咽上皮细胞的影响

ＴＰＡ对ＥＢ病毒体外转化人胚鼻咽上皮细胞的影响贺智敏，陈主初，邵细芸，何春梅（湖南医科大学肿瘤研究所长沙４１００７８）流行病学资料显示：鼻咽癌（ＮＰＣ）地理区域分布与含ＴＰＡ植物分布明显相关。ＴＰＡ属佛波醇二酯（ＰｈｏｒｂｏｌＥｓｔｅｒ）类，是肿瘤高...     

人支气管上皮细胞恶性转化相关基因的克隆

[目的]根据克隆的大鼠气管上皮细胞恶性转化EST片段（GenBane Accession Number AF011363)克隆相应的人全长基因并探索其功能。[方法]根据大鼠EST序列进行生物素探针标记,cDNA文库筛选,cDNA快速终扩增延伸目的基因直到获得全长序列。[结果]HRNT－1全长cDNA 4256bp,开放阅读框架2760bp,位于254bp-3016bp之间,编码区内含有9个TRP序列;位于人类染色体Xq13;cDNA序列收录于GenBank中（Accession Number AF223393).HRNT-1在人支气管上皮恶性转化细胞以及肺癌细胞中具有较高表达。[结论]HRNT－10为一功能基因,其高表达与上支气管上皮细胞恶性转化有关。     

miR-27a在猿猴病毒小T抗原诱导支气管上皮细胞恶性转化中的作用

目的:检测猿猴病毒40(simian virus 40,SV40)小T抗原(small T antigen,ST)诱导人支气管上皮细胞(human bronchialepithelial cell,HBE)恶性转化中miRNAs的表达谱,寻找与细胞转化相关的miRNAs。方法:选择HBE、HBER和HBERST细胞株,提取总RNA,利用miRNA芯片和实时荧光定量PCR技术检测和验证永生化HBE、HBER和HBERST细胞中差异表达的miRNAs。通过细胞生长曲线检测、细胞周期分析、细胞克隆形成试验等确证与SV40 ST诱导HBE细胞恶性转化相关的miRNAs。结果:在HBE、HBER和HBERST细胞856个miRNA的表达谱中筛选出6个与SV40 ST诱导细胞转化相关的miRNA,2个表达上调(miR-20a和miR-27a).4个表达下调(let-7d,let-7f,miR-1246和miR-3746)。抑制miR-27a能减缓HBERST细胞的增殖速度(P0.01),延长细胞在G0～G1期的停留时间(P0.01)和降低HBERST细胞在软琼脂上形成克隆的数目(P0.01)。结论:miR-27a的异常表达参与了SV40ST诱导的HBE细胞恶性转化。     

抗EB病毒口服液对EB病毒转化力的抑制作用

目的：探讨抗EB(Epstain-Barr)病毒口服液对EB病毒转化人脐血B淋巴细胞能力的抑制作用。方法：用台盼蓝拒染法检测抗EB病毒口服液对脐带血B淋巴细胞的细胞毒作用；用克隆形成法测定药物对EB病毒转化B淋巴细胞的抑制作用。结果：用0．625、1．25、2．50、5．00和10．00mg／mL的生药提取物浓度分别预处理EB病毒1h，药物对EB病毒转化B淋巴细胞转化的抑制率分别为29．3％、49．9％、65．3％、68．2％和81．2％。药物在上述5种浓度下与EB病毒和B淋巴细胞共同作用，药物对EB病毒转化B淋巴细胞转化力的平均抑制率分别为27．4％、36．9％、46．5％、56．6％和69．9％。结论：抗EB病毒口服液对EB病毒转化B淋巴细胞能力有抑制作用。     

抗EB病毒口服液对EB病毒转化力的抑制作用

目的 :探讨抗EB(Epstain Barr)病毒口服液对EB病毒转化人脐血B淋巴细胞能力的抑制作用。方法 :用台盼蓝拒染法检测抗EB病毒口服液对脐带血B淋巴细胞的细胞毒作用 ;用克隆形成法测定药物对EB病毒转化B淋巴细胞的抑制作用。结果 :用 0 62 5、1 2 5、2 5 0、5 0 0和 10 0 0mg/mL的生药提取物浓度分别预处理EB病毒 1h ,药物对EB病毒转化B淋巴细胞转化的抑制率分别为 2 9 3 %、49 9%、65 3 %、68 2 %和 81 2 %。药物在上述 5种浓度下与EB病毒和B淋巴细胞共同作用 ,药物对EB病毒转化B淋巴细胞转化力的平均抑制率分别为 2 7 4%、3 6 9%、46 5 %、5 6 6%和 69 9%。结论 :抗EB病毒口服液对EB病毒转化B淋巴细胞能力有抑制作用     

DNMT1高表达在MNNG诱导哈萨克族食管上皮细胞恶性转化中的作用

目的：利用已构建的哈萨克族食管上皮DNMT1高表达细胞模型,探讨DNMT1高表达在MNNG诱导食管上皮细胞恶性转化中的作用,为研究食管癌发病机制提供理论依据。方法：以MNNG为诱导剂,MTT法和克隆形成实验确定MNNG的恶性转化剂量;对哈萨克族食管上皮DNMT1高表达细胞和正常上皮细胞采用隔代染毒的方式进行染毒,每次染毒1 h,软琼脂集落形成实验观察不同染毒和传代次数的细胞集落形成情况;裸鼠成瘤实验观察哈萨克族食管上皮DNMT1高表达细胞及其转化细胞的恶变程度。结果：MTT法和克隆形成实验发现MNNG转化浓度为1.50×10^-5 mol/L,软琼脂集落形成实验发现染毒14次第27代的哈萨克族食管上皮DNMT1高表达细胞在软琼脂上有细胞集落形成,并且随着MNNG染毒剂量、次数和细胞传代次数的增加,出现细胞形态不规则等恶性转化特点,接触抑制逐渐消失,耐受性逐渐增强,生长速度逐渐增加,而正常上皮细胞未出现阳性结果,细胞固缩死亡。接种哈萨克族食管上皮DNMT1高表达细胞的裸鼠出现局部肿块,但病理鉴定仅为结构紊乱,并未出现鳞癌,而接种转化细胞的裸鼠出现肿瘤,经病理鉴定为鳞癌。结论：成功构建了哈萨克族食管上皮DNMT1高表达细胞恶性转化模型,DNMT1高表达可促进MNNG致细胞恶性转化,加快其恶变速率和恶变程度。     

人永生化食管上皮细胞恶性转化的验证

目的 检查永生化人胚食管上皮细胞系（SHEE）的恶性表型、成瘤性和侵袭力,证实此细胞系传至85代（SHEE85）已完全恶性转化。方法 培养的SHEE85细胞用光镜和电镜观察细胞形态;以流式细胞仪检查细胞周期;行细胞软琼脂培养;以裸小鼠和SCID小鼠接种检测其成瘤性;以细胞培养于羊膜的体外方法和移植至SCID小鼠腹腔的体内方法测定其侵袭力。结果 SHEE85在光镜下细胞生长拥挤,大小不一;电镜下见细胞呈增殖状态。DNA组方图统计细胞增殖指数为47％,高倍体细胞12％。软琼脂培养多细胞大集落形成率4％。接种的4只裸小鼠和4只SCID小鼠皆成瘤。结论 SHEE85已完全恶性转化,并且有较强侵袭力。此细胞系可作为研究食管癌癌变细胞和分子机制可靠的模型。     

EB病毒潜伏膜蛋白1在鼻咽癌形成中的作用

EB病毒潜伏感染在鼻咽癌的形成中起着重要的作用。现综述近年来研究EB病毒潜伏膜蛋白1在鼻咽癌形成作用中的进展情况，并着重介绍其对细胞信号传导通路、血管生成及转移等的影响。     

Synergism of BARF1 with Ras Induces Malignant Transformation in Primary Primate Epithelial Cells and Human Nasopharyngeal Epithelial Cells

Although it is well known that nasopharyngeal carcinoma (NPC) is closely related with Epstein-Barr virus (EBV), few data are available about which and how EBV-expressed gene is involved in the carcinogenesis of human nasopharyngeal epithelial cells. EBV-encoded BARF1 (BamH I-A right frame 1) gene has been shown to be oncogenic and capable of inducing malignant transformation in BALB/c3T3 and NIH3T3 cells as well as in human B-cell lines Louckes and Akata. It remains unclear, however, whether BARF1 can transform primate or human epithelial cells. Here, we have shown that overexpression of H-Ras gene transformed BARF1-immortalized PATAS cells into malignant cell line. Furthermore, we found that cooperation of BARF1 with H-Ras and SV40 T antigens was sufficient to transform nonmalignant human nasopharyngeal epithelial NP69 cells when serially introduced BARF1 and H-Ras into the SV40 T antigens-immortalized NP69 cells. Taken together, these results demonstrated that the cooperation of BARF1 with Ras suffices to transform primary primate epithelial cell PATAS. Similarly, BARF1 together with H-Ras and SV40 T can transform human epithelial cell NP69, thereby indicating that BARF1 could be involved in the NPC pathogenesis in combination with additional genetic changes.     

人支气管上皮细胞恶变过程中生物学特性及超微结构的研究

目的:探讨烟草特异性亚硝胺(NNK)诱发人支气管上皮细胞(BEAS-2B)恶性转化过程中生物学特性及超微结构变化情况.方法:以500μg/ml的NNK处理BEAS-2B细胞24小时后,细胞在体外连续传代培养,在此过程中观测细胞生物学特性及超微结构的变化情况.结果:第5代细胞显示抗血清生长,细胞在裸鼠体内不成瘤.与对照细胞相比,细胞及细胞核形态、细胞器形态及数量无显著变化;第15代细胞在半固体琼脂中克隆形成率(0.032%)为对照细胞(0.0023%)的13.9倍,细胞在裸鼠体内不成瘤.细胞超微结构显示转化细胞特征;第25代细胞在裸鼠体内成瘤,组织学证实为鳞癌(Ⅰ～Ⅱ级).细胞超微结构显示具有明显的肿瘤细胞特征.结论:浓度为500μg/ml的NNK可成功诱发BEAS-2B细胞恶性转化,在此过程中,细胞超微结构及生物学特性逐步改变,提示人支气管上皮细胞恶性转化过程是一个多步骤、多阶段的发展过程.     

人支气管上皮细胞恶变过程中生物学特性及超微结构的研究

目的：探讨烟草特异性亚硝胺（NNK）诱发人支气管上皮细胞（BEAS-2B）恶性转化过程中生物学特性及超微结构变化情况。方法：以500μg/ml的NNK处理BEAS-2B细胞24小时后，细胞在体外连续传代培养，在此过程中观测细胞生物学特性及超微结构的变化情况。结果：第5代细胞显示抗血清生长，细胞在裸鼠体内不成瘤。与对照细胞相比，细胞及细胞核形态、细胞器形态及数量无显著变化；第15代细胞在半固体琼脂中克隆形成率（0．032％）为对照细胞（O．0023％）的13．9倍，细胞在裸鼠体内不成瘤。细胞超微结构显示转化细胞特征；第25代细胞在裸鼠体内成瘤，组织学证实为鳞癌（Ⅰ-Ⅱ级）。细胞超微结构显示具有明显的肿瘤细胞特征。结论：浓度为500μg/ml的NNK可成功诱发BEAS-2B细胞恶性转化，在此过程中，细胞超微结构及生物学特性逐步改变，提示人支气管上皮细胞恶性转化过程是一个多步骤、多阶段的发展过程。     

α粒子诱发人支气管上皮细胞癌变的DNA修复基因表达谱研究

背景与目的 :DNA修复系统在细胞基因组完整性维持中发挥重要作用 ,本研究探讨α粒子辐射诱发人支气管上皮细胞癌变的DNA修复基因表达谱变化。 材料与方法 :采用Cy5和Cy3分别标记的癌变细胞BERP35T4和亲本细胞BEP2D的cDNA探针与DNA修复基因cDNA微矩阵杂交、ScanArray3000扫描仪扫描和ImaGene3.0软件分析比较基因表达差异。 结果 :分析比较了人支气管上皮细胞癌变前(BEP2D)和后(BERP35T4)126个DNA修复相关基因的表达谱 ,发现细胞癌变后有10个修复基因的表达降低 ,这些基因分别参与DNA链断裂修复、核苷酸切除修复和碱基切除修复反应 ,3个基因(DNA_PKcs、SMUG和RAD18)表达上调。结论 :细胞DNA修复表达改变是辐射诱发细胞恶性转化的机制之一。     

凝血酶诱发人支气管上皮细胞恶性转化的信号转导

[目的]探讨凝血酶恶性转化人支气管上皮细胞时丝裂原激活蛋白激酶（p^44/42MAPK）信号通路活化状态。[方法]逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测凝血酶受体在BEP2D细胞的表达水平及凝血酶刺激后原癌基因c-fos、c-myc转录表达情况。用免疫印迹法（Western blot）检测不同浓度凝血酶刺激后不同时间p^44/42MAPK磷酸化状态。[结果]凝血酶受体PAR1、PAR3、PAR4在BEP2D细胞均有表达。凝血酶刺激后出现p^44/42MAPK激活。相应地,c—fos、c-myc基因转录上调。[结论]凝血酶与其受体结合后可激活p^44/42MAPK信号转导通路,原癌基因转录扩增导致BEP2D细胞基因组不稳定性增加,细胞出现癌变。     

Why Are Human Cells Resistant to Malignant Cell Transformation in vitro?1

Transformation of human cells, both induced and spontaneous, is an extremely rare event, whereas rodent cells are relatively easily transformed when treated with a single carcinogenic agent. The present review addresses the question of why human cells are resistant to malignant transformation in vitro. To facilitate understanding of the problem, the process of transformation is divided operationally into two phases, i.e. phase I, immortalization; and phase II, malignant transformation. In human cells, one-phase transformation, i.e., the consecutive occurrence of phases I and II due to the action of a single carcinogenic agent, is observed only rarely. Once human cells are immortalized, however, malignant transformation by chemical carcinogens or oncogenes proceeds, suggesting that for human cells, phase I immortalization is a prerequisite for such transformation to take place. To date, about 20 papers have been published describing protocols for the two-phase transformation of a variety of human epithelial cells and fibroblasts. In most experiments, SV40, human papilloma viruses and their transforming genes are utilized for induction of phase I (immortalization) followed by the use of chemical carcinogens or activated oncogenes for induction of phase II (malignant transformation). Possible mechanisms that would render human cells refractory to transformation are discussed below.     

CGB5对卵巢癌OVCAR-3细胞血管生成拟态形成的影响

目的 探讨β绒毛膜促性腺激素的第5号亚基（chorionic gonadotropin beta polypeptide 5, CGB5）对卵巢癌OVCAR-3细胞血管生成拟态形成的影响。方法 采用慢病毒载体转染的方法,在卵巢癌OVCAR-3细胞中分别转入CGB5过表达载体、空载体、CGB5 siRNA及无关序列siRNA。另将未处理的OVCAR-3细胞作为空白对照,高表达CGB5的绒癌细胞BeWo作为阳性对照。将两种细胞分别注入随机分组的裸鼠右侧腋窝皮下构建皮下移植瘤模型,取肿瘤组织用HE染色及CD34-PAS双染色观察各组中血管生成拟态（vasculogenic mimicry, VM）的形成,并用透射电子显微镜观察各组肿瘤中血管生成拟态的形成。结果 CGB5过表达组的血管生成拟态形成的数量较对照组明显增加,而CGB5干扰组的血管生成拟态形成的数量较对照组明显减少。结论 CGB5能促进卵巢癌OVCAR-3细胞血管生成拟态的形成,这将有望为卵巢癌的治疗提供新的靶标和思路。     

热疗对食管癌细胞株EC-1放疗的增敏作用

目的 初步探讨热疗对食管癌细胞株EC-1放射增敏作用及其可能机制,为热疗与放疗联合治疗食管癌提供理论依据。方法 采用平板克隆形成分析法计算各组细胞存活分数SF,“多靶单击数学模型”拟合细胞存活曲线。流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期的变化。结果 热疗对食管癌细胞株EC-1放疗有显著的增敏作用,热疗30 min的放射增敏比为1.060。热疗可使细胞阻滞在G2/M期,使G₀/G₁期、S期细胞比例减少,增加细胞凋亡,与对照组相比差异有统计学意义 (P<0.05)。结论 热疗对食管癌EC-l细胞具有增敏作用,热疗可通过影响食管癌EC-l细胞周期,诱导细胞凋亡,增强放射线对细胞的杀伤作用。