人干燥综合征B抗原在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达研究

目的：通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母中表达人干燥综合征B抗原（SS—B）。方法：PCR扩增SS—B基因，与酵母表达载体pPIC9k重组，构建表达质粒pPIC9k—SS—B。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168，在MD平板上筛选重组克隆，用G418快速筛选高拷贝转化子，阳性克隆经甲醇诱导表达后，培养上清用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和免疫酶斑点法（immunodot）鉴定。结果：PCR产物约为1200bp，与预期1224bp接近，pPIC9k—SS—B重组阳性克隆测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致，双酶切鉴定正确。表达产物SS—B的分子量约48000，高拷贝毕赤酵母转化菌的表达水平明显高于低拷贝的。表达量占分泌总蛋白60％以上。产物浓度为800—900mg／L。免疫酶斑点法证实表达产物具有天然SS—B分子的免疫原性。阴性对照菌未见目的表达条带。结论：SS—B在巴斯德毕赤酵母中获得高效分泌表达，为下一步研究打下了基础。     

斑点免疫金渗滤试验检测淋球菌抗原的应用研究

目的：建立一种简易快速的斑点免疫金渗滤试验（ＤＩＧＦＡ）用于检测淋球功抗原。方法：用抗淋球菌单克隆抗体为包被抗体,以胶体金标记兔抗淋球菌ＩｇＧ作探针,制成ＤＩＧＦＡ反应盒。持异性强。与脑膜炎球菌、葡萄球菌、肺炎球菌、大肠杆菌等无交交丸反应,淋球菌抗原最低检出量为６３．００ｎｇ／ｍｌ。经５１例临床分离株测定,敏感性为９８．０４％,特异性１００％。结论：检测淋球菌抗原的ＤＩＧＦＡ是一种简易快速、敏感、     

U1RNP70KD,Sm-D,SSB及β2GP1自身抗原的重组表达及临床研究

目的 制备Ｕ１ＲＮＰ７０ＫＤ,Ｓｍ－Ｄ,ＳＳＢ及β２ＧＰ１重组自身抗原,探讨自身免疫性疾病的机理及提高临床自身抗体检测的敏感性和特异性。方法 应用逆转录ＰＣＲ方法克隆β２ＧＰ１及其第５功能区（Ｄ５）,Ｕ１ＲＮＰ７０ＫＤ及其Ｕ１ＲＮＡ结合功能区（ＢＤ）,Ｓｍ－Ｄ和ＳＳＢ的编码基因,经原核表达系统（ＰＧＥＸ－２Ｔ）进行表达、鉴定及纯化,并分析β２ＧＰ１及Ｕ１ＲＮＰ７０ＫＤ抗原表位的定位,进而以重组抗原     

B型流感病毒斑点金免疫渗滤法的建立和临床应用

目的制备和鉴定B型流感病毒单克隆抗体（McAb）,建立斑点金免疫渗滤法（DIGFA）,用于B型流感病毒的临床检测。方法以B型流感病毒抗原免疫BALB/c小鼠制备McAb,利用胶体金标记技术对抗体进行标记,建立快速检测B型流感病毒抗原的斑点金免疫渗滤法,并对实验条件进行探讨。用建立的DIGFA法与酶联免疫吸附试验（ELISA）同时检测128例患者鼻咽部分泌物,比较敏感性、特异性,以评价检测效果。结果 DIGFA法与ELISA法对比检测了128例样本中B型流感病毒抗原,本方法的敏感性为94.4%,特异性为96.4%,两法总符合率为96.1%。结论 DIGFA法操作简单、方便、快速、特异、灵敏,在B型流感病毒感染的辅助诊断中具有较好的应用价值。     

检测抗HSV-1IgG的斑点金免疫渗滤方法的建立

目的：建立检测人血清中抗单纯疱疹病毒Ⅰ型IgG（抗HSV-1 IgG）的斑点金免疫渗滤法（DIGFA）。方法：增殖纯化HSV-1抗原并包被于硝酸纤维素膜，自制胶体金并用于标记羊抗人IgG，自制斑点金免疫渗滤检测装置，用于检测血清中抗HSV-1 IgG。结果：当血清样本中抗HSV-1 IgG为阳性时，滴加的金标羊抗人IgG可使检测装置膜上出现红色斑点。以DIGFA与酶联免疫吸附试验（ELISA）用于检测血清样本41份，两法差异无显著性（X^2=0.01，P〉0.05）。结论：建立了检测抗HSV-1 IgG的斑点金免疫渗滤方法，该法较其他方法检测时间短，操作简便快捷。     

基于斑点免疫金渗滤法的蛋白微矩阵

目的:开发一种低成本、简单易用的基于免疫金渗滤法的蛋白微矩阵用于平行检测分析血清中多种靶分子.方法:用点样仪将人IgG和多种抗原点到硝酸素纤维膜上,经小牛血清白蛋白封闭后垫以高分子吸水材料,随后滴加血清样本,免疫金显色,CCD阅读仪分析相对灰度值,并与ELISA法的检测结果进行对比. 结果:微矩阵的IgG检测范围在1～50 ng之间;按照400份阴性血清相对灰度值的均数加上3倍标准差制定临界值.在186份随机血清试验中,与ELISA试剂盒比较,检测结果无显著性差异,总体灵敏度和特异度均大于90%.结论:蛋白微矩阵与ELISA方法相比,检测效果相当,且具有操作步骤简单,易于使用,检测成本低,耗时少的优点,适合于在临床检验上的应用.     

斑点免疫金渗滤法检测抗荚膜组织胞浆菌抗体的研究

目的 研究快速检测荚膜组织胞浆菌抗体的方法.方法 荚膜组织胞浆菌素纯蛋白衍生物(P-HTPM)为包被抗原,以葡萄球菌A蛋白(SPA)标记的免疫胶体金为检测标记物,采用斑点免疫金渗滤试验(DIGFA)检测荚膜组织胞浆菌(HC)免疫小鼠血清中抗HC抗体以及其他真菌免疫血清中抗体.结果 DIGFA检测20份HC小鼠免疫血清,结果全为阳性,与ELISA检测结果一致,敏感性为100%.检测8份正常小鼠血清出现1份假阳性,特异性为87.5%.检测其他真菌免疫血清结果为:念珠菌属和马尔尼菲青霉菌免疫血清结果全为阴性;8份皮炎芽生菌血清出现1份阳性,9份副球孢子菌血清出现2份阳性.结论 斑点免疫金渗滤法检测抗HC抗体有较高的敏感性和特异性,快速简便.经临床标本扩大验证后将对荚膜组织胞浆菌病的快速诊断有应用价值.     

肿瘤相关抗原17-1A在毕赤酵母中的表达与鉴定

目的利用Pichia pastoris酵母表达系统表达糖基化的肿瘤相关抗原17-1A,为进一步设计肿瘤蛋白疫苗提供研究基础。方法通过RT-PCR从小鼠肾组织中扩增17-1A的cDNA,将其定向克隆到pPICZαA质粒上,获得重组质粒pPICZαA-17-1A,测序正确后,重组质粒电转化到Pichia pastoris酵母菌株GS115中,在甲醇诱导下,利用其AOX I基因的α信号肽,分泌表达17-1A抗原糖蛋白,并对获得的蛋白进行SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。结果构建了pPICZαA-17-1A重组质粒,通过电转化将目的基因整合人酵母基因组中,重组毕赤酵母表达能够表达17-1A抗原并检测到抗原发生了糖基化。结论能够通过毕赤酵母表达系统稳定表达糖基化的肿瘤相关抗原17-1A。     

人血管抑素K1-3在毕赤酵母胞内表达的研究

目的:构建人血管抑素K1-3的重组酵母胞内表达质粒PHIL-D2/K1-3,获得重组目的蛋白.方法:从胎儿肝脏组织用RT-PCR方法扩增人血管抑素K1-3目的基因,克隆至酵母胞内表达质粒PHIL-D2中,线性化后转化到毕赤酵母GS115胞内,经PCR和Sourthern杂交筛选出阳性转化子,并用甲醇诱导表达.表达产物进行SDS-PAGE(12%)和Western blot检测,经赖氨酸亲和层析柱纯化后,用Lowry法测定蛋白含量,并进行生物活性测定.结果:SDS-PAGE和Western blot结果显示,表达蛋白质的相对分子量为30kd左右,低糖基化.Lowry法测定蛋白表达量为6.8mg/L.活性测定实验表明重组血管抑素能特异抑制人血管内皮细胞的增殖.结论:在毕赤酵母GS115胞内成功表达了人血管抑素K1-3重组蛋白.     

人干燥综合征B抗原在巴斯德毕赤酵母菌中的高效分泌表达研究

目的：通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母菌中表达人干燥综合征B（SS—B）抗原。方法：PCR扩增SS—B基因，与酵母菌表达载体pPIC9k重组，构建表达质粒pPIC9k—SS—B。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168，在MD平板上筛选重组克隆，用G418快速筛选高拷贝转化子，阳性克隆经甲醇诱导表达后，培养上清用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和免疫酶斑点法鉴定。结果：PCR产物约为1200bp，与预期1224bp接近；pPIC9k—SS-B重组阳性克隆测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致，双酶切鉴定正确。表达产物SS-B的相对分子质量约48000，高拷贝毕赤酵母菌转化菌显著高于低拷贝的表达水平，表达量占分泌总蛋白的60％以上，产物浓度为800～900mg／L。免疫酶斑点法证实表达产物具有天然SS—B分子的免疫原性。阴性对照菌未见目的表达条带。结论：SS—B存巴斯德毕赤酵母菌中获得高效分泌表达，为下一步研究打下了基础。     

SP-A1在甲醇酵母中的分泌表达及产物的鉴定

目的：研究人肺表面活性物质相关蛋白A1(SP-A1)在甲醇酵母Pichia pastoris(P．pastoris)中的分泌表达、产物的分离纯化及免疫活性测定。方法：将人SP-A1基因克隆至P.pastoris的分泌表达质粒pPIC9K上，获得重组表达质粒pPIC9K／SP-A，转化P.pastoris GS115、KM71。通过G418筛选获得高拷贝转化子(HIS4Mut^ )，在摇瓶中培养、甲醇诱导表达SP-A1，纯化目的蛋白，并免疫小鼠，ELISA法和western blotting分析SP-A1的免疫活性。结果：SDS-PAGE结果显示，在P.pastoris中经甲醇诱导，SP-A1获得表达，其表达量在上清中为200mg／L。经过纯化可获得纯度达95％以上的蛋白质。ELISA法和western blotting结果表明，目的蛋白可被多克隆抗体识别。可刺激小鼠产生抗体。结论：人组织特异性蛋白SP-A1可在P.pastoris中表达，表达产物具有免疫原性。