抗人大肠癌单克隆抗体的制备及应用

目的制备和纯化抗人大肠癌单克隆抗体(ND-1),分析其在大肠癌诊断中的应用价值。方法常规免疫小鼠制备腹水,腹水经离心和过滤后,应用G蛋白亲和层析法进行纯化。采用SDS-PAGE、间接免疫荧光(IFA)、间接ELISA检测纯化后抗体的纯度、活性、效价和特异性。并用免疫组织化学SP法检测在大肠癌组织中的表达。结果经SDS-PAGE分离可见两条相对分子质量(Mr)分别为55 000和25 000明显的两条蛋白条带。间接ELISA检测抗体效价为1∶1 000 000,ND-1抗体对表达相应抗原的大肠癌细胞株具有特异结合活性。人大肠癌组织切片经ND-1抗体免疫组织化学染色阳性率为82.9%,其中高分化腺癌阳性率为100%。结论应用G蛋白亲和层析法可以很好分离纯化鼠腹水中的IgG1亚型的单克隆抗体,抗体的纯度高,特异性强,生物学活性好,可望成为有效的肿瘤诊断和治疗的手段。     

腹水型单克隆抗体纯化方法的研究

目的：比较不同纯化方法对腹水型抗体的纯化效果,探索出最适合实验室抗体生产的纯化方法。方法制备的 IgG1单克隆抗体腹水（4-D10）分别利用两步硫酸铵沉淀法（AS 法）、辛酸-硫酸铵沉淀法（CA-AS法）、辛酸-硫酸铵沉淀法联合 DEAE 阴离子交换层析法与辛酸-硫酸铵沉淀法联合蛋白 G 亲和层析法纯化处理后,经蛋白纯度、回收率、抗体免疫活性鉴定分析后,比较不同的纯化方法对腹水型抗体的纯化效果。结果① AS 法的蛋白纯度为25%,低于 CA-AS 法（44%）;AS 法回收率为63%,高于 CA-AS 法（41.8%）;比较抗体效价表明,AS 法（1.024×106）与 CA-AS 法（1.024×106）两者相当。②粗提后纯化效果表明,蛋白 G亲和层析法回收率明显降低,DEAE 纯品虽纯度略低,但回收率较高,且效价（5.12×105）高于蛋白 G 亲和层析法（1.28×105）。结论 CA-AS 联合 DEAE 离子交换法是适合实验室生产单抗的低成本、纯化效果和回收效果较佳的方法。     

抗极低密度脂蛋白受体单克隆抗体的大量制备及纯化

背景：极低密度脂蛋白受体被认为是一种“瑞士军刀”样多功能受体,对该受体的研究很广泛,但其商品化抗体种类较少,价格偏贵。 目的：获得研究可用的抗极低密度脂蛋白受体的单克隆抗体。 方法：为了获得抗极低密度脂蛋白受体单克隆抗体,选用可分泌针对极低密度脂蛋白受体胞内段的单克隆抗体的杂交瘤细胞IgG 6A6。通过将杂交瘤细胞IgG 6A6注入Balb/c小鼠腹腔内,2周后收集腹水,分别通过盐析法(正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法)初步纯化和亲和层析进一步纯化目的蛋白,获得针对极低密度脂蛋白受体胞内段的单克隆抗体。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其相对分子质量和纯度,酶联免疫吸附实验检测其活性。 结果与结论：未纯化腹水Western Blotting结果显示条带较多,背景不干净;而经正辛酸-饱和硫酸铵法初步纯化的腹水、经Protein A进一步纯化得到的抗体均可特异识别极低密度脂蛋白受体。提示经盐析法和Protein A Agarose纯化可获得较纯和有活性的单克隆抗     

纯化小鼠IgM腹水单克隆抗体方法的探索

本文选用IgM的杂交瘤细胞系(PS-1)在BALB/c小鼠腹腔产生的腹水单克隆抗体,摸索并比较了三种提纯方案的效果。 抗体经低速离心去除纤维蛋白后,分别用盐析、低渗透析和腹水二次过柱三种方案提纯,盐析后的沉淀、低渗透析后的上清和沉淀物以及原腹水,四种样品分别经Sephacryl S-200柱层析(床体积-1.7×ll5cm;洗脱液-0.001MEDTA,0.01M Tris,0.5M NaCl pH=7.4;     

抗鸡免疫球蛋白(IgM、IgG)单克隆抗体的制备与鉴定

本文报道将SRBC免疫鸡的血清经33％硫酸铵沉淀,再经Sephadex G-200凝胶柱两次层析,收集第Ⅰ,Ⅱ蛋白峰作为免疫原免疫BALB/c小鼠。建立了2株(3A7、1C4)分泌抗鸡IgG和4株(6AS、5E2、6C7、6B1)抗鸡IgM特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系;琼脂扩散试验表明6株细胞系分泌的单克隆抗体均为IgG1亚类。所制腹水的ELISA滴度达10~5～10~6。用免疫印迹技术(IB,Immunobllotting)对其中2株(3A7和6A5)的特异性作了进一步鉴定。     

三种方法提纯小鼠单克隆IgM抗体的比较研究

本文报道用聚乙二醇(PEG)沉淀、超速离心和SephacrylS-200柱层析三种方法从小鼠腹水中提纯单克隆IgM抗体,并比较了它们的纯度、免疫活性和回收率。其中,纯化IgM的纯度以Sephacryl S-200柱层析最高;免疫活性以PEG沉淀最好;而超速离心的回收率较高。我们认为用PEG沉淀提纯单克隆IgM是一种简单、快速、有效的方法,可推广。     

抗重组人白细胞介素18单克隆抗体的制备与特性研究

目的 :获得有生物活性的小鼠抗重组人白细胞介素 18(rhIL 18)单克隆抗体。方法 :采用重组hIL 18免疫BALB C小鼠 ,应用杂交瘤技术 ,ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株并经多次克隆化。结果 :建立了 2株小鼠抗hIL 18单克隆抗体杂交瘤细胞 1C7和 1F5 ,染色体数目分别为 92条和 90条 ,所分泌的抗体分别为IgG2a和IgG1,轻链均为κ型 ,腹水IgG抗体经亲和层析法纯化后纯度达 95 %以上 ,效价为 1× 10 - 4和 1× 10 - 5,Westernblot显示 2株单抗均能特异性识别 18 3kD处的rhIL 18蛋白。 1C7单抗的亲和常数Ka=1 7× 10 5,1F5的亲和常数Ka=1 3× 10 5。 2株单抗识别不同抗原表位。结论 :制备的 2株单抗为进一步研究IL 18的分子结构、生物学功能及其与免疫相关性疾病的关系提供了实验材料。     

亲和层析一步纯化IgM类单克隆抗体

本文介绍采用免抗鼠IgM血清制备的亲和层祈柱从小鼠腹水中一步提纯单克隆抗体IgM的方法。提纯的IgM应用琼脂糖电泳检测，为一个区带；应用还原条件下的SDS—PAGE检测．分离为分子量～80K的重链和～25K的轻链两条区带，几未见其他杂带；应用免疫印染法鉴引．进一步确证为IgM，不合常见的杂质IgG。实验过程还发现提她的IgM不够稳定，在贮存过程有降解现象。另外厘用同一亲和柱从吸附IgG后的小鼠血清中提取多克隆抗体IgM的效果也是良好的，经用还原条件下的SDS—PAGE检测，同样也只分离为轻，重链两条区带，未见混有其他杂蛋白。     

三种方法提纯小鼠单克隆ⅡgM抗体的比较研究

本文报道用聚乙二醇（PEG）沉淀、超速离心和Sephacry1S-200柱层析三种方法从小鼠腹水中提纯单克隆IgM抗体，并比较了它们的纯度、免疫活性和回收率，其中，纯化IgM的纯度以Sephacry1S-200柱层析最高；免疫活性以PEG沉淀最好；而超速离心的回收率较高。我们认为用PEG沉淀提纯单克隆IgM是一种简单、快速、有效的方法，可推广。     

亲和层析一步纯化IgM类单克隆抗体

本文介绍采用兔抗鼠IgM血清制备的亲和层析柱从小鼠腹水中一步提纯单克隆抗体IgM的方法。提纯的IgM应用琼脂糖电泳检测,为一个区带;应用还原条件下的SDS—PAGE检测,分离为分子量～80K的重链和～25K的轻链两条区带,几未见其他杂带;应用免疫印染法鉴别,进一步确证为IgM,不含常见的杂质IgG。实验过程还发现提纯的IgM不够稳定,在贮存过程有降解现象。另外应用同一亲和柱从吸附IgG后的小鼠血清中提取多克隆抗体IgM的效果也是良好的,经用还原条件下的SDS-PAGE检测,同样也只分离为轻、重链两条区带,未见混有其他杂蛋白。     

TLR2和TLR4单克隆抗体对DSS诱导的小鼠结肠炎肠黏膜细胞因子及肠道菌群的影响

目的 研究Toll样受体2单克隆抗体(Toll-like receptor 2 monoclonal antibody,TLR2McAb)、Toll样受体4单克隆抗体(TLR4McAb)对葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的小鼠急性期溃疡性结肠炎组织学改变及肠道菌群结构的影响.方法 雄性BALB/c小鼠分为正常对照组(A)、急性期溃疡性结肠炎模型组(B)、TLR2McAb干预组(C)、TLR4McAb干预组(D)、TLR2McAb+TLR4McAb共同干预组(E),每组10只.A组饮用蒸馏水,B～E组饮用5%DSS水溶液以产生急性期溃疡性结肠炎,造模开始同时,每隔48 h予A、B两组小鼠腹腔内注射生理盐水,C～E组小鼠分别予以10μg的TLR2McAb、TLR4McAb、TLR2McAb+TLR4McAb,期间观察小鼠的疾病活动指数(disease activity index,DAI).干预7 d后处死小鼠,HE染色观察结肠炎症,并进行结肠组织病理学评分(histopathological score,HS);使用real-time PCR法检测各组结肠黏膜中IFN-γ、IL-4、IL-17表达;留取盲肠内粪便对大肠杆菌、双歧杆菌及乳酸杆菌进行培养并比较各菌群菌落计数(colony forming units,CFU)的变化.应用SPSS13.0软件进行统计学分析,以P<0.05为差异有统计学意义.结果 (1)与A组比较,B组的DAI及HS显著增高(DAI:9.700±2.406 vs 0.500±0.707,P<0.01;HS:16.500±2.991 vs 6.400±3.273,P<0.01);C、D组与B组比较DAI及HS差异均无统计学意义(P>0.05);E组的DAI及HS明显低于B组(DAI:5.700±3.498 vs 9.700±2.406,P<0.05;HS:9.500±3.308 vs 16.500±2.991,P<0.01).(2)与A组比较,B组小鼠结肠黏膜IFN-γ、IL-4及IL-17的mRNA表达明显增高;而C～E组结肠黏膜三种细胞因子的表达均有不同程度的降低.(3)A组大肠杆菌数量较少,B～E四组大肠杆菌均明显生长(与A组比较P<0.05),C～E组大肠杆菌数值与B组比较有所下降,但差异无统计学意义(P>0.05);B组双歧杆菌及乳酸杆菌数量均明显少于A组及C～E组(P<0.05),使用TLR2McAb、TLR4McAb干预后,C～E组双歧杆菌及乳酸杆菌数量上升,与A组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 TLR2McAb、TLR4McAb同时干预对DSS诱导的小鼠急性期溃疡性结肠炎有显著改善作用;两种McAb均能明显提高小鼠肠道内双歧杆菌及乳酸杆菌的菌群数量,从而改善肠道菌群结构,但对大肠杆菌数量无明显影响,且两抗体同时干预对肠道菌群结构的改善未见显著协同作用.     

人胎盘层粘连蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的获得能特异性识别人层粘连蛋白（hLN）的单克隆抗体（McAb）。方法用纯化的人层粘连蛋白（hLN）作抗原免疫Balb/C小鼠,以细胞融合、酶联免疫吸附实验（ELISA）筛选和克隆化技术获得抗hLN的杂交瘤细胞株;用生物学方法鉴定杂交瘤细胞,用免疫学方法鉴定McAb的特异性。结果获得4株稳定分泌抗人LN的杂交瘤细胞株（2A1、3B5、2C4、4D1）,培养上清的ELISA效价分别为：1∶512、1∶1024、1∶512、1∶256;腹水效价分别为：1×10^6、1×10^7、1×10^6、1×10^5;采用ELISA相加法表明2A1、4D1与3B5、2C4识别的hLN上的抗原决定簇和识别的不同,4株单抗均属实IgG。结论成功建立了4株稳定分泌抗人LNMcAb的杂交瘤细胞株,它们分别识别hLN上2个不同的抗原位点,有望作为hLN定量检测的特异性抗体。     

抗人C4结合蛋白单克隆抗体的制备及某些方法的改进

用易于获得的C4BP/C4混合抗原免疫小鼠,EAC1q4C4BP血球间接血凝法作为筛选手段,获得了分泌抗C4BP抗体的杂交瘤细胞株。用单克隆抗体制成的亲和柱分离的C4BP,有C4BP的电泳特性和抑制EAC14与C2形成C3转化酶的活性。本文同时报告单克隆抗体制备方案的某些改进:1.小鼠免疫过程中用尾尖近似定量微量采血法对血中抗体水平定期监测,选择合适的小鼠供脾;2.用戊二醛固定的检测血球筛选杂交瘤,方法简便迅速,改变了杂交瘤筛选工作繁重的局面;3.用单细胞分离法达到单克隆化,缩短工作周期。     

重组人α干扰素单克隆抗体的研制及其应用

目的　研制抗干扰素的单克隆抗体 (McAb)及其应用。方法　应用杂交瘤技术 ,获得 4 0株抗重组人α干扰素的单克隆抗体细胞株 ;用ELISA方法检测腹水滴度 ,用辛酸法纯化McAb。结果　 4 0株细胞中 2E9、4G1能稳定分泌抗重组人α1b干扰素的单克隆抗体 ,2C9为抗重组新型干扰素 ,2A7、4G10分泌抗重组人α干扰素 (α1b、α2b、α2a、)和重组集成干扰素、重组新型干扰素的单克隆抗体细胞系 ;体外连续传代 6个月 ,分泌抗体能力不变 ,特异性专一。 5株单克隆抗体均为IgG。采用辛酸方法提纯抗体纯度达到 95 %以上。粗制的重组人α干扰素经 4G10单克隆抗体亲和层析柱提纯后 ,获得的干扰素纯度 95 %以上 ,平均收率 93% ,残余鼠IgG含量 <10 0ng 剂量 (5 0 μg)。 2C9单克隆抗体亲和层析柱适用于纯化新型干扰素。结论　 4G10单克隆抗体亲和层析柱可以应用于大规模重组人α干扰素生产。     

空肠弯曲菌与可提取核抗原的分子交叉反应

取空肠弯曲菌（ＣＪ－Ｓ１３１）免疫的Ｂａｌｂ／ｃ小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞ＳＰ２／Ｏ融合，制备出４种能与空肠弯曲菌和可提取核抗原（ＥＮＡ）起反应的单抗。以Ｈｅｐ－２细胞作基质的免疫荧光染色表明，４种单抗均呈阳性结果，证实为抗核抗体。当单抗腹水被空肠弯曲菌菌体吸收后，其抗ＥＮＡ的活性明显降低，证明这４种单抗与空肠弯曲菌ＣＪ－Ｓ１３１和ＥＮＡ存在交叉反应性。免疫印渍试验表明，４种单抗均与空肠弯曲菌ＣＪ－Ｓ１３１的４３ｋＤ外膜蛋白反应。这一结果提示：空肠弯曲菌ＣＪ－Ｓ１３１的４３ｋＤ外膜蛋白与ＥＮＡ之间可能存在相似的分子构象，这为自身免疫病发机制的分子模拟假说提供了实验的依据。     

人促甲状腺激素单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备特异性强、灵敏度高的人促甲状腺激素（hTSH）单克隆抗体,为建立高灵敏性和高特异性的hTSH检测方法奠定基础。方法：人工合成人促甲状腺激素（hTSH）上的28个氨基酸,采用戊二醛交联法与牛血清白蛋白（BSA）构建完全抗原。用人工免疫原免疫BALB／c小鼠,利用杂交瘤技术建立分泌抗hTSH单克隆抗体的杂交瘤细胞,并对得到的单抗进行鉴定。结果：建立了一株杂交瘤细胞4E5,制备了腹水单抗,经鉴定,抗体重链属于IgG1类型,轻链属于K型,McAb腹水ELISA效价达1：1．6×10^5,与促黄体生成激素（LH）、促卵泡激素（FSH）、人绒毛膜促性腺激素（HCG）无明显交叉反应,细胞株冻存复苏后抗体分泌稳定。结论：本实验建立的细胞株显示稳定性好,特异性高,McAb腹水效价高,为进一步提高hTSH检测的灵敏性和简便性提供依据。     

抗人IL-11单克隆抗体的研制及生物学特性研究

以rhIL 11作为免疫原常规免疫BALB/c小鼠 ,采用细胞融合、ELISA检测和杂交瘤细胞克隆筛选等方法获得了 2株鼠抗人IL 11的单克隆抗体 (5A4、 1G12 ) ,分别属于IgG1亚类和IgG2a亚类。MTT法和细胞增殖试验分析表明 ,5A4、 1G12均不同程度地抑制IL 11对其依赖株细胞B9 11的增殖效应。表明成功地研制成了 2株鼠抗人IL 11的中和功能性单克隆抗体     

小鼠CTL体外非特异性扩增对其杀瘤活性的影响

目的 在体外用抗CD3单抗、抗CD28单抗和白细胞介素2（IL－2）扩增肿瘤特异性CTL,为肿瘤过继治疗提供足够数量的、具有高度杀瘤活性的效应细胞。方法 采用两种方案培养肿瘤细胞免疫的小鼠脾细胞。（1）抗CD3单抗刺激48h后,加入抗CD3单抗和20U／mlrIL－2（抗－CD3＋IL－2组）;（2）抗CD3单抗和抗CD28单抗同时刺激48h后,加入抗CD3单抗、抗CD28单抗和20U／ml rIL－2（抗－CD3＋抗－CD2＋IL－2组）。分别检测2组效应细胞的增殖水平、杀瘤活性及表型。结果 抗CD3＋IL－2组细胞的^3H－TdR掺入量在第6天、12天、20天分别为22126、52426、2072,抗－CD3＋抗－CD28＋IL－2组细胞的^3H-TdR掺入量在第6天、12天、30天分别为32168、12922、3265,后者明显高于前者。在培养12d时,抗－CD3＋IL－2组细胞对FBL03的最大杀伤活性为66．4％,抗－CD3＋抗－CD28＋IL－2组细胞对FBL－3的最大杀伤活性为77．8％。细胞表型FACS分析结果表明,抗－CD3＋抗－CD28＋IL－2组培养12d后的细胞90％以上为Thy1.2^ 细胞,且CD25^ 细胞在抗－CD3＋抗－CD28＋IL－2组、抗－CD3＋IL－2组分别为23．00％、8．15％。结论 抗CD3单抗、抗CD28单抗和低剂量IL－2同时非特异性刺激,可获得大量扩增的、具有高度杀瘤活性的肿瘤特异性CTL。     

Production and characterization of monoclonal antibodies specific to atrazine group compounds: effects of coating ligand structure on the variation of sensitivity and specificity

Hybridoma cells were prepared by immunizing mice with carboxylic derivatives of atrazine conjugate to bovine serum albumin. After the screening of culture supernatant of hybridomas, five cell lines producing monoclonal antibodies were established and 1.8-5.3 ml of ascitic fluid per mouse was obtained from each cell line. The protein A affinity purification yielded 0.35-0.65 mg per ml of ascitic fluid from each cell line. The characterization studies in terms of sensitivity and specificity indicate that MAb 2F9 and MAb 4B9 showed the best responses with atrazine and its group of ametryne and cyanazine, using microtiter plate coated with simazine derivative of 6-amino hexanoic acid; no cross-reactivity was shown with simazine and cyanuric chloride.     

抗抗CD3 ScFv单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备抗抗CD3 ScFv单克隆抗体并研究其生物活性.方法：分离纯化后的抗CD3 ScFv蛋白免疫BALB/c小鼠,采用传统杂交瘤技术制备抗抗CD3 ScFv单克隆抗体;采用ELISA和Western blot鉴定其亚类和抗原结合特异性;采用FACS测定抗抗CD3 ScFv单克隆抗体对Jurkat细胞特异活性.结果：成功筛选出一株能稳定分泌抗抗CD3 ScFv单克隆抗体的杂交瘤细胞株（10B7）,其分泌的抗体亚类为IgG1.该抗抗CD3 ScFv单克隆抗体直标后可特异性结合抗CD3 ScFv蛋白和抗CD3抗体.结论：文中所研制的抗抗CD3 ScFv单克隆抗体具有与抗CD3抗体、抗CD3 ScFv蛋白特异结合的活性,在肿瘤导向治疗中抗CD3/抗肿瘤双特异抗体的亲和层析纯化、药代动力学监测等方面具有广泛的应用前景.