小鼠OX40原核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠OX40胞外段基因的原核表达载体并进行诱导表达。方法PCR扩增OX40胞外段基因并将其插入原核表达质粒pET32a（＋），重组pET32a—OX40经测序鉴定后转入表达菌株BL21（DE3）进行融合蛋白的小量诱导表达。结果出现新增蛋白条带，融合蛋白主要存在于包涵体中；Western Blotting分析表明该融合蛋白可与相应抗体发生特异性结合。结论构建了小鼠OX40基因的原核表达载体，获得OX40胞外段融合蛋白。     

人OX40融合蛋白的表达及其纯化

目的表达含有人OX40胞外段的融合蛋白,纯化目的蛋白,为下一步制备抗人OX40单克隆抗体及鉴定打下良好的基础。方法采用冰冷热击法将测序正确的pET32a—OX40胞外段的重组质粒转入表达菌株BL21（DE3）的感受态细胞,接种于含氨苄青霉素的培养基筛选出阳性克隆。将阳性克隆细菌用IPTG诱导培养,收集不同时间的培养产物,离心分离菌体,取菌体超声破菌,离心收集胞质上清和包涵体沉淀,进行SDS．PAGE分析,观察不同时间条件对目的蛋白表达的影响及目的蛋白分布情况,筛选优化表达条件。采用Ni离子亲合层析柱纯化目的蛋白,然后使用超滤管对蛋白进行脱盐处理,并用核酸蛋白检测仪测定目的蛋白的浓度。结果筛选到表达pET32a．OX40的阳性菌株。SDS．PAGE电泳表明,含有重组质粒的表达菌株经IPTG诱导后,在蛋白Marker的31．0～42．7kD之间出现了新的融合蛋白带,在胞质和包涵体中均有目的融合蛋白的表达。优化表达条件分析表明,在诱导的不同时间内新蛋白的表达量没有明显差别。用Ni离子亲和层祈柱纯化的蛋白经超滤管进行脱盐处理后,获得的目的蛋白含量为56．266g／L。结论成功获得表达pET32a—OX40的阳性菌株;表达产物经Ni离子亲和层析柱层析处理可获得纯度较高的目的蛋白。     

肝片吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白2（FhSAP-2）的原核表达及分离纯化

目的 建立肝片吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白2（FhSAP-2）原核表达系统.方法用生物信息学软件OptimumTM Codon优化密码子适应指数（CAI）、最优密码子频率（FOP）及GC含量以获得适合大肠杆菌BL-21表达的FhSAP-2基因序列,并克隆到原核表达载体pET22b和pET28a中,经IPTG诱导其表达并经亲和层析及离子交换色谱纯化后获得目的 蛋白.结果 OptimumTM Codon获得优化后的FhSAP-2序列,经测序及酶切鉴定结果表明重组质粒pET22b-FhSAP-2、pET28a-FhSAP-2构建成功,进一步实验结果表明FhSAP-2在pET28a中包涵体部位表达,可溶部位不表达;在pET22b中可溶部位表达量低,包涵体部位无表达.继而经Ni-NTA柱亲和纯化及离子交换色谱纯化获得电泳纯的FhSAP-2蛋白.结论成功建立FhSAP-2的原核表达系统.     

融合蛋白ScFv（3G11）-mms13在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的：构建抗Ⅳ型胶原酶单链抗体基因ScFv与磁小体膜蛋白基因mms13融合基因的原核表达载体pET30a（＋）-ScFv-mms13,在大肠杆菌中诱导表达并对融合蛋白进行初步鉴定。方法 PCR扩增融合基因ScFv-mms13,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆入原核表达载pET30a（＋）质粒,构建重组表达质粒。将重组质粒导入大肠杆菌DH5ɑ中,利用PCR、酶切筛选鉴定重组菌株。用异丙基疏代半乳糖苷（ IPTG）诱导表达融合蛋白,通过改变IPTG浓度、诱导时间优化表达条件。表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot法进行鉴定。结果重组质粒经PCR、酶切、测序证实重组质粒pET30a（＋）-ScFv-mms13构建成功。 SDS-PAGE电泳结果分析表明诱导菌株在43kDa左右处有明显异源蛋白表达,且确定了在IPTG终浓度为0．2mmol/L、诱导时间为6h时为表达稳定。对表达蛋白进行定位分析确定表达蛋白主要以包涵体形式存在,部分存在于可溶细胞质中。 Western blot结果实证该表达产物可与His-tag抗体发生特异性结合,提示为目的融合蛋白。结论成功构建pET30a（＋）-ScFv-mms13表达载体并表达获得目的融合蛋白。     

OX40基因原核表达及优化

目的 构建小鼠OX40胞外段基因的原核表达载体,进行诱导表达并优化表达条件.方法 PCR扩增OX40胞外段基因并将其插入原核表达质粒pET32a(+),重组pET32a-OX40经测序鉴定后转入表达菌株BL21(DE3)进行融合蛋白的小量诱导表达,并优化表达条件.结果 出现新增蛋白条带,融合蛋白主要存在于包涵体中;Western Blotting分析表明该融合蛋白可与相应抗体发生特异性结合.结论 构建了小鼠OX40基因的原核表达载体,获得OX40胞外段融合蛋白的最佳表达条件,为后续单抗制备等工作奠定了基础.     

小鼠CD25分子胞外段的原核表达载体的构建及表达鉴定

目的构建小鼠CD25分子胞外段的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。方法从BALB/c小鼠脾细胞中提取总RNA,利用RT-PCR方法获得CD25分子胞外段序列;将其亚克隆入原核表达载体PET-32a,构建好PET-32a-CD25胞外段,并进行酶切及测序鉴定;将PET-32a-CD25胞外段转染大肠杆菌BL21进行表达,并对表达产物进行纯化和鉴定。结果RT-PCR扩增出708 bp的CD25胞外段的基因片段;pET32a-CD25胞外段/BL21经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,相对分子质量约为47×103,重组蛋白用镍树脂纯化后经Western blot检测显示具有良好的免疫反应性,并且可以在体外有效刺激自体T细胞疫苗免疫小鼠脾细胞的增殖并高分泌IL-4。结论CD25胞外段蛋白在原核细胞中成功表达,纯化后的蛋白保持良好的免疫反应性。     

重组人脂联素融合蛋白在大肠埃希菌BL21中的表达

目的在大肠埃希菌BL21中对构建的重组人脂联素质粒pET－32a（＋）／AP进行诱导表达,并对产物进行纯化、鉴定。方法将pET－32a（＋）质粒和重组pET－32a（＋）／AP质粒转化到大肠埃希菌BL21中进行诱导表达,建立表达体系,筛选高表达的克隆子,用不同诱导时间和不同异丙基．p—D．硫代半乳糖苷诱导浓度确定最佳诱导条件,用Ni抖金属层析柱进行蛋白亲和层析,对纯化蛋白进行浓缩,蛋白质印迹鉴定所诱导的蛋白。结果得到分子量为43kD的新生蛋白,经蛋白质印迹鉴定为重组脂联素融合蛋白。结论将重组pET－32a（＋）／AP质粒转化到大肠埃希菌BL21中,建立表达体系,且获得高效表达。     

人清道夫受体A胞外段的原核表达

目的获得具有生物学活性的人清道夫受体A(SRA)胞外段蛋白。方法从人外周血单个核细胞(PBMC)中提取RNA,逆转录为cDNA,采用PCR技术从PBMC-cDNA中扩增出目的基因片段,将其克隆至原核表达载体pET41a(+),经PCR、限制性酶切和测序确证后,以IPTG诱导其在大肠杆菌中的表达。包涵体经变性、复性后以Ni-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,以SDS-PAGE、Western blotting进行分析鉴定。FCM及ELISA方法检测SRA胞外段对Con A诱导PBMC细胞增殖及分泌细胞因子IL-2的影响。结果 PCR扩增得到长约1 100 bp的目的基因片段,插入pET41a(+)载体所获重组表达载体pET41a-SRAECD的酶切图谱和序列与预期的一致。重组子经诱导表达,表达产物主要以包涵体形式存在。以Ni-NTA亲和层析柱纯化获得约75 000 Mr的SRA胞外段融合蛋白。纯化的人SRAECD蛋白能与抗人SRA单克隆抗体特异性结合并具有活性,可抑制T细胞增殖及细胞因子IL-2的分泌。结论获得了具有生物学活性的人SRA胞外段蛋白,为进一步探索SRA的效应功能提供了实验材料。     

人脂联素球状结构域的表达、纯化和功能鉴定

目的表达和纯化人脂联素（adiponectin,APN）球状结构域并观察其生物学活性.方法用PCR方法复制人脂联素球状结构域（globular domain of adiponectin,gAPN）的cDNA,并克隆于pET28a（＋）原核表达载体中.将重组表达质粒pET28a（＋）-gAPN转化大肠埃希菌BL21（DE3）,37℃培养至A600达到0.6时,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导目的蛋白的表达.细菌经超声破菌,得到粗提的包涵体洗涤变性后经镍柱亲和层析柱一步纯化,获得纯化的gAPN重组蛋白,复性后冻干保存.然后,用链佐星（streptozocin,STZ）诱导的小鼠高血糖模型检测其生物活性.结果IPTG诱导后有Mr约为17 000大小的目的蛋白表达,免疫印迹结果进一步表明,其具有人gAPN的抗原性.表达蛋白主要以包涵体形式存在,占菌体蛋白的30%以上,表达产物经变性、纯化、复性,可获得纯度90%以上的目的蛋白.该重组蛋白能够降低STZ诱导的小鼠高血糖模型的血糖水平.结论在大肠埃希菌BL21（DE3）中成功表达了人gAPN蛋白,经变性、纯化、复性后得到具有生物学活性的蛋白.     

人胰岛素样生长因子前体基因的重组、表达及其蛋白纯化

目的：构建含有人胰岛素样生长因子（human insulin-like growth factor-1，hIGF-1）前体编码全长cDNA的重组载体，使其在E-coli BL21（DE3）中表达，并对此表达菌株所表达的重组蛋白进行纯化，同时探讨其抗原性及应用价值。方法：采用PCR法，扩增编码hIGF-1前体cDNA的片段，通过双酶切、胶回收纯化、连接后得到pET32a（＋）／hIGF-1重组载体，然后将其转化入BL21（DE3）中，经IPrG诱导后表达的重组蛋白经镍柱亲和层析纯化，并用Western blot法检测重组蛋白的抗原活性。结果：重组质粒pET32a（＋）／hIGF-1经双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功。BL21（DE3）表达的重组蛋白经SDS-PAGE电泳后显示．其表达量占细菌总蛋白量的25％左右．该重组蛋白经镍柱亲和层析纯化后其纯度高达90％以上。Western blot结果显示非常清晰的免疫印迹条带，表明此重组蛋白具有免疫学特异性。结论：pET32a（＋）／hIGF-1重组载体构建成功，并能够高效表达。     

人肌纤生成调节因子1融合蛋白在大肠杆菌的表达和抗体制备

目的研究人肌纤生成调节因子1(MR-1)的表达,获得MR-1蛋白,制备MR-1抗体,为MR-1生物功能研究提供基础.方法利用大肠杆菌质粒pGEX-5X-1、pET30a( )及pET24a( ),分别构建MR-1及其两端与不同标签序列融合的表达载体.在大肠杆菌BL21(DE3)和BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中比较N端和/或C端融合标签序列对该基因表达的影响.通过凝胶蛋白电泳及电洗脱制备目的蛋白,免疫家兔.酶联免疫吸咐试验(ELISA)和Western b1ot检测所制备抗体的滴度和免疫原性.结果利用GST或T7-tag序列在其N端融合,使MR-1在大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL得到表达.利用所表达获得的MR-1-T融合蛋白,制备了针对此蛋白的多克隆抗体.ELISA检测所制备抗体滴度达到1:105,Western hlot显示所制备的多克隆抗体可用于检测天然细胞中的MR-1蛋白.结论MR-1蛋白需在N端与GST或T7-tag序列融合方可实现表达.利用在大肠杆菌表达纯化的蛋白所制备的抗体可用于MR-1生物学功能的研究.     

柯萨奇-腺病毒受体基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的利用原核基因工程克隆表达柯萨奇-腺病毒受体(CAR)胞外段,并制备多克隆抗体。方法从HeLa细胞中抽提总RNA,通过RT-PCR获得编码CAR胞外段的cDNA,与pQE31质粒连接,构建表达型重组质粒,测序证实后诱导表达,经Ni-NTA柱亲和纯化后,免疫新西兰兔,ELISA检测抗血清滴度。结果重组质粒转化的大肠杆菌M15经IPTG诱导表达及亲和纯化后得到滴度较高的融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot显示其分子量约为26 kd,具有特异的抗原性,主要以包涵体形式存在于菌体中。纯化的融合蛋白免疫新西兰兔后产生的抗体,经ELISA检测抗体滴度>1:32 000。结论CAR胞外段基因的克隆表达和多克隆抗体的制备,为进一步研究该受体在以腺病毒载体为基础的基因治疗中的作用及柯萨奇病毒的致病机制奠定了基础。     

BTBD10基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的 克隆和表达BTBD10基因,为进一步研究BTBD 10与胰岛细胞增殖功能提供工具.方法 制备兔抗BTBD10多克隆抗体,利用PCR方法扩增BTBD10全长,经Bam H I和Sal I酶切后连接入pET32a原核表达载体,将重组表达质粒pET32a-BTBD 10转化大肠杆菌ROSSET,经IPTG诱导表达蛋白,并以亲和层析的方法进行纯化,以纯化的BTBD10蛋白免疫新两兰大白兔,制备兔抗BTBD10的多克隆抗体,利用Western blot方法分析鉴定.结果 经双酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的BTBD10读码框.SDS-PAGE电泳分析显示IPTG诱导后表达约85kU的融合蛋白,与预期结果相符.将纯化的融合蛋白免疫家兔,获得兔抗BTBD10多克隆抗体血清,Western blot结果显示该抗体特异性好,效价高,目的条带位于56kU处.结论 成功构建人BTBD10原核表达载体,并获得了高纯度BTBD10重组蛋白及兔抗BTBD10多克隆抗体.     

固醇调控核因子bHLH-Zip的原核表达及其抗血清的制备

[目的]制备固醇调控核因子bHLH-Zip片段及其多克隆抗血清,为细胞固醇代谢及调脂药物研究提供材料。[方法]将人源固醇调节元件结合蛋白SREBP的N端第323-553位氨基酸残基的基因序列即bHLH-Zip片段克隆到表达载体pcDNA4/hismaxA,得到重组质粒pHis-bHLH-Zip,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达;裂解细菌并纯化目的蛋白;用纯化后的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗血清,采用间接ELISA法测定效价。[结果]获得纯化bHLH-Zip片段,并制备其多克隆抗血清。抗bHLH-Zip抗血清的效价为1:16000。[结论]bHLH-Zip核因子是一段可溶性蛋白,并可制备产生具有较高效价的多克隆抗血清,这为研究细胞固醇代谢及调脂药物对SREBP通路的影响奠定了基础。     

人巨细胞病毒US31蛋白特异性抗体的制备及鉴定

目的：探讨人巨细胞病毒（HCMV）US31蛋白及其多克隆抗体的制备及鉴定方法。方法：HCMV US31基因经原核密码子优化后进行全基因合成,克隆至pET21a（+）原核表达载体,构建pET21a（+）/HCMV US31重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导目的蛋白表达,Ni-NTA亲和层析法纯化US31蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA、Western blot及免疫荧光方法检测抗体效价和特异性。结果：在大肠杆菌中诱导出高表达的HCMV US31融合蛋白,经Ni-NTA亲和纯化后获得高纯度的目的蛋白;免疫新西兰兔诱导产生特异性的IgG抗体,效价为1:49 600;经ELISA、Western blot以及免疫荧光均证实制备的特异性抗体可识别细胞中表达的US31蛋白。结论：成功制备了HCMV US31蛋白及特异性抗体,为进一步研究US31蛋白的生物学功能奠定了基础。     

HBV 靶向核糖核酸酶基因的原核表达和纯化及多克隆抗体的制备

目的旨在获得HBV靶向核糖核酸酶,并制备其兔的多克隆抗体. 方法 将构建好的HBV靶向核糖核酸酶基因克隆入原核表达载体pET32a(+),转化入大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导6×His融合蛋白的表达并经Ni2+亲和层析纯化.通过SDS-PAGE 和 Western blot鉴定后,用纯化的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体,并以复性的蛋白作为抗原,用ELISA测定抗体的效价. 结果 成功地纯化和复性了HBV靶向核糖核酸酶,获得了较高效价的抗血清. 结论 获得纯化并复性的HBV靶向核糖核酸酶和多克隆抗体,为进一步研究奠定了基础.     

ATP5B原核表达和单克隆抗体的制备及其鉴定

目的：制备高纯度ATP合酶β亚基（ATP5B）单克隆抗体并进行鉴定,为其后续研究奠定基础。方法：应用PCR法扩增ATP5B基因,克隆入pET28a载体中并转入大肠杆菌BL21（DE3）。异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达并用镍亲和层析柱纯化融合蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测蛋白纯度。用纯化的融合蛋白免疫3只雌性Balb/C小鼠,取小鼠尾静脉血,间接酶联免疫吸附法（ELISA法）检测血清中ATP5B抗体效价。取血清效价最高的免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞混合培养建立杂交瘤细胞,采用间接ELISA法筛选融合细胞并行单克隆化培养,对阳性细胞进行核型分析。取12周龄Balb/C小鼠,腹腔注射杂交瘤细胞制备腹水模型,收集腹水,间接ELISA法检测效价,SDS-PAGE检测抗体纯度,应用ELISA法检测抗体亚型。结果：PCR扩增后得到1 455bp的特异性条带,连接pET28a空载体获得重组pET28a/ATP5B载体。IPTG诱导转化的菌液表达目的蛋白,SDS-PAGE检测,在相对分子质量为51 000处出现明显的诱导蛋白条带。间接ELISA法检测免疫小鼠静脉血,血清效价最高达1：64 000。杂交瘤细胞染色体核型分析,染色体总数约为骨髓瘤细胞与正常小鼠脾细胞之和。采用杂交瘤细胞株制备小鼠腹水,抗体最高效价为1：240 000,杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的亚型为IgG1。结论：通过克隆、表达和纯化重组蛋白,成功制备出抗ATP5B蛋白单克隆抗体。