20例人早孕绒毛滋养细胞的体外培养

目的建立快速、有效的绒毛滋养细胞体外培养的方法。方法采用0．25％胰酶和Ⅱ型胶原酶混合消化法消化绒毛组织,用胰蛋白酶消化传代体外培养,通过光镜对培养出的细胞进行形态评价;用细胞角蛋白和波形蛋白单克隆抗体检测细胞纯度。结果联合消化法的细胞生长迅速,接种6～8d可以传代,原代细胞生长时间明显缩短,所得细胞纯度达95％。结论联合消化法是一种较有效的人早孕绒毛滋养细胞培养方法。     

混合酶消化法大鼠颅盖骨细胞的原代培养和鉴定

目的通过不断的摸索,寻找一种获得细胞数量较多且纯的原代成骨细胞的体外培养方法,为下一步实验研究奠定基础。方法取出生24h内的sD大鼠脱臼处死,取出颅盖骨,剪成1mm×1mm×1mm大小的组织片;采用胰酶和I型胶原酶混合酶消化法分离获得原代成骨细胞;采用“差速贴壁法”进行纯化。通过对细胞形态学的镜下观察,碱性磷酸酶染色及I型胶原免疫组化法等对细胞进行鉴定。结果镜下观察所获得的细胞具有成骨细胞的典型特征,细胞多为单核,呈三角形、多边形、长梭形等形态,并伸有粗大伪足;碱性磷酸酶染色及I型胶原免疫组化染色呈阳性。结论采用混合酶消化法可获得数量较多且活性较好的细胞,再采用“差速贴壁法”可以去除成纤维细胞等杂质细胞,获得纯度较高的成骨细胞。     

两种人早孕绒毛滋养层细胞的原代培养方法

目的:比较两种不同方法进行人早孕绒毛滋养层细胞原代培养的异同。方法:分别用组织块培养法和3种酶联合消化法(Ⅳ型胶原酶、低浓度胰酶及DNaseⅠ)、Ficoll 400梯度密度离心法对人早孕绒毛滋养层细胞培养。结果:两种方法进行早孕滋养层细胞的培养均获得成功,其生长率比较差异无显著性意义(P>0.05)。结论:组织块培养法简单易行,但细胞数量少,生长缓慢,难以完成后续实验;3酶联合消化、Ficoll 400梯度密度离心法相比较而言,可获得数量更多的活力好、纯度较高的具有不同分化功能的滋养层细胞,为进一步研究其侵袭、增殖能力等生理、病理作用提供了坚实的基础。     

新生大鼠心肌细胞原代培养

目的探讨酶法分离新生大鼠心肌细胞过程中的各种影响因素,对Simpson经典方法进行改进,提高原代心肌细胞存活率及搏动率。方法采用低浓度的胰酶消化3～4次后,再用低浓度的Ⅱ型胶原酶消化一次,用短时间的2次差速贴壁法分离培养心肌细胞。结果在分离培养新生鼠心肌细胞过程中,胰酶和胶原酶合用,并改变差速贴壁时间,得到高存活率和高纯度的心肌细胞,细胞搏动率高,持续时间久。结论分离培养大鼠心肌细胞时,低浓度的胰酶和胶原酶合用,并用2次差速贴壁,可提高原代心肌培养的存活率和纯度,使细胞搏动良好。     

4种不同方法培养小鼠阴道粘膜干细胞的比较

目的探讨4种不同方法体外分离、培养小鼠阴道粘膜干细胞(VMSCs)所得结果的差异,确定最适合体外培养VMSCs的方法。方法选择组织块培养法、胰酶消化培养法、胶原酶消化培养法、胰酶和胶原酶混合培养法对小鼠VMSCs进行原代培养,并通过HE染色、SP免疫组化法鉴定VMSCs,分析4种方法的优劣。结果 4种培养法中,胶原酶消化培养法细胞生长很差,无法得到VMSCs;组织块培养法培养时间较长,培养出的细胞包含成纤维细胞较多;单纯胰酶消化培养法,可获取较单一的VMSCs,但细胞活性相对较差;只有胰酶、胶原酶混合培养法,在适当的比例和浓度时,可发挥最佳作用,获取数量多、较纯的VMSCs。且经HE染色、免疫组化法鉴定结果均显示培养出的细胞即是VMSCs。结论 4种方法中有3种体外分离培养VMSCs的方法,均可得到VMSCs,其中以胰酶、胶原酶混合培养法效果最佳。     

输卵管妊娠绒毛滋养层细胞的体外培养与鉴定

目的建立输卵管妊娠绒毛滋养层细胞有效的培养与鉴定方法。方法通过胰酶消化法培养滋养细胞,差异贴壁法分离滋养细胞,通过光镜、电镜和免疫荧光细胞化学染色法对所培养的细胞进行形态和细胞骨架评价。结果倒置显微镜下可见细胞呈上皮样细胞形态;透射电镜、扫描电镜观察,细胞的超微结构具有典型滋养层细胞结构;直接免疫荧光双标记染色检测到角蛋白染色为阳性,波形蛋白为阴性。结论该法切实可行,可获得合乎实验要求的输卵管妊娠滋养细胞,可供后续实验研究。     

子宫内膜异位症和子宫腺肌病在位、异位内膜间质细胞原代培养与形态学观察

目的:探讨子宫内膜异位症(endometriosis,EMT)和子宫腺肌病(adenomyosis,AM)在位、异位子宫内膜间质细胞(ESC)的原代培养方法,并比较EMT及AM在位、异位ESC与正常对照ESC形态的差异。方法:采用胶原酶酶解、分段消化,单次筛网分离,贴壁法分离子宫内膜细胞,采用免疫细胞化学法进行细胞鉴定,光镜下观察细胞形态差异。结果:原代培养正常对照ESC和EMT在位、异位ESC及AM在位、异位ESC各15例,分离、培养成功率分别可达93.3%、93.3%、80.0%、93.3%、86.7%。得到的细胞数量较多,纯度较高,经鉴定ESC纯度可达95%以上。EMT、AM在位、异位ESC与正常在位ESC大小不一,与在位及正常ESC细胞相比异位ESC细胞核较大,细胞膜表面有很多胞浆突起,边界不清。结论:采用胶原酶酶解、分段消化,单次筛网分离,贴壁法分离可以获得数量较多、纯度较高的EMT和AM在位、异位ESC。EMT、AM异位ESC与正常妇女及EMT、AM在位ESC的形态差异可能与EMT、AM具有恶性肿瘤样的侵袭特征有关。     

兔子宫平滑肌细胞的原代培养与鉴定

目的研究子宫平滑肌细胞(MSMC)的培养方法及一些生物学特性。方法运用酶消化后组织贴块法及胶原酶Ⅰ消化法进行兔子宫平滑肌细胞的培养,并用倒置生物显微镜、HE染色进行形态学观察和用免疫组化对培养细胞进行鉴定。结果运用此两种方法成功培养了兔子宫平滑肌细胞,培养的细胞呈典型“峰-谷”样生长,HE染色观察细胞呈梭形,胞浆丰富,核大圆形或椭圆形。免疫组化S-P法检测a-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(a-SMActin)表达强阳性。经传代纯化,纯度达99%以上,细胞生长特性未见异常改变。结论酶消化后组织贴块法及胶原酶Ⅰ消化法培养的兔子宫平滑肌细胞生长稳定性好,培养与纯化能同步进行,方法简便,经济。     

人胎盘滋养细胞分离培养及HPV6感染研究

目的研究人胎盘滋养细胞分离纯化培养及人乳头瘤病毒6型(HPV6)感染后其生物学特性的变化。方法用酶消化法和Percoll密度梯度离心分离培养人胎盘滋养细胞,免疫细胞组化染色鉴定其纯度,以HPV6感染后检测滋养细胞凋亡率。结果获得纯化的滋养细胞,HPV6感染48h后检测其凋亡率为(38.26±6.38)%。结论人乳头瘤病毒6型能感染滋养细胞并诱导其凋亡。     

人子宫肌瘤细胞原代培养方法的比较研究

目的:比较体外培养人子宫肌瘤细胞组织块法和胶原酶消化法的优缺点,探索子宫肌瘤细胞原代培养的最佳方法,为在子宫肌瘤生理和病理等方面的研究提供一种更有效、简便的细胞培养技术。方法:采用组织块法和胶原酶消化法对人子宫肌瘤组织进行体外培养,运用光学倒置显微镜、HE染色观察细胞生物学特性,免疫荧光法进行细胞鉴定。结果:倒置显微镜及HE染色观察两种细胞的形态均多成梭形,平滑肌肌动蛋白免疫荧光染色均呈阳性。结论:组织块培养法与胶原酶消化法作为人子宫肌瘤细胞体外培养的两种方法,均可成功建立子宫肌瘤细胞有限细胞系。通过比较发现,消化法虽相较于组织块法方法稍复杂,但具有短期内可获得大量细胞且细胞纯度较高的优势。     

人胎盘滋养层细胞的分离和鉴定

目的:体外分离足月妊娠胎盘滋养层细胞,观察其形态学特点,检测人类白细胞抗原-E(HLA-E)在滋养层细胞的表达情况。方法:采用0.25%胰酶和胶原酶I联合消化法及Percoll密度梯度分离法分离人足月妊娠胎盘组织中滋养层细胞,光学显微镜观察分离出的细胞形态,透射电镜观察分离出的细胞超微结构;RT-PCR技术检测分离出的滋养层细胞HLA-E的表达。结果:光学显微镜下初分离的细胞呈大圆形,以单个核为主;透射电镜下可见细胞表面的微绒毛丰富,胞质丰富,内质网扩张明显,有丰富的糖原颗粒、髓样小体和明显的脂滴。在分离的细胞上检测到HLA-E的表达。结论:采用胰酶和胶原酶I联合消化及Percoll密度梯度分离法可获得高纯度的滋养细胞,在透射电镜下可见到超微结构,同时检测到滋养层细胞上表达HLA-E。     

人脐静脉内皮细胞的培养与鉴定

对血管内皮细胞体外培养的常规方法进行了改进 ,采用胰蛋白酶 胶原酶 (1∶1)混合酶液消化方式分离人脐静脉内皮细胞 ,简化完全培养液的组成成分 (不添加血管内皮细胞生长因子、肝素等辅助因子 ) ,机械刮擦法分离单层细胞进行传代培养。培养细胞用形态学、超微形态学和免疫组织化学染色法进行鉴定 ,证实培养的细胞是血管内皮细胞。     

卵巢癌相关成纤维细胞和正常卵巢成纤维细胞的基因表达差异

目的:对卵巢癌相关成纤维细胞(Carcinoma-associated fibroblasts,CAFs)及卵巢正常成纤维细胞(Normalfibroblasts,NFs)进行分离、培养、纯化,并分析两者多种基因表达的差异。方法:①用组织块贴壁培养法获得原代卵巢癌CAFs和卵巢NFs,通过胰酶消化法和反复传代法进行细胞的纯化;②观察细胞形态,多种基因的免疫细胞化学染色检测及相应mRNA的半定量分析,对CAFs和NFs进行初步鉴定;③应用RT-PCR的方法对CAFs和NFs中多种基因进行分析比较。结果:①获得了纯化的卵巢CAFs和NFs;②卵巢CAFs的细胞免疫化学染色α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)染色呈阳性,角蛋白呈阴性,卵巢NFs波形蛋白(Vimentin)阳性,而α-SMA和细胞角蛋白阴性;③卵巢CAFs与NFs中Vimentin与α-SMA的mRNA发现均有表达,但CAFs中表达增加,差异有统计学意义(P<0.05);④与NFs相比,CAFs中多种mRNA的表达增加,其中包括生长因子,血管生成促进因子,细胞因子等。结论:与NFs相比,CAFs在mRNA、蛋白表达等方面均有统计学差异;卵巢癌中CAFs基因表达的检测表明,其基因表达有显著变化,提示这些成纤维细胞可能为卵巢癌细胞的生长提供了最适合的微环境。推测卵巢-宿主界面微环境在上皮性卵巢癌的发展中可能起重要作用。     

改良的人脐带间充质干细胞培养方法

目的:建立人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)的分离和培养方法,探讨hUCMSCs的成脂成骨分化潜能。方法:用酶消化法、传统组织块法和改良组织块法从人脐带中分离间充质干细胞,流式细胞仪检测其免疫表型;用不同的培养体系诱导hUCMSCs向成骨细胞及成脂细胞分化,并对其进行鉴定。结果:改良的hUCMSCs培养方法培养细胞纯度更高,在相同的培养时间内,改良组织块法所获得的细胞数量是酶消化法的2～3倍,是传统组织块法的20～30倍,细胞呈长梭形生长;高表达CD73、CD90、CD44、CD105,不表达CD31、CD45、CD34;茜素红染色及油红O染色证实了hUCMSCs可分化为脂肪细胞和成骨细胞。结论:建立了hUCMSCs的培养新方法,证实了hUCMSCs的增殖能力和多向分化潜能,为其治疗应用提供支持。     

大型成年哺乳类动物绵羊阴道平滑肌细胞的原代培养改进方法研究

目的探索原代培养成年大型哺乳动物绵羊阴道平滑肌细胞(vaginal smooth muscle cells,VSMC)改良方法。方法成年绵羊阴道平滑肌取材,利用预消化组织块法(将组织剪碎呈1 mm3大小组织块,0.1%Ⅰ型胶原酶消化20 min,0.1%胰酶-EDTA与0.1%Ⅰ型胶原酶混合溶液再次消化30 min,将组织块种于培养瓶)原代培养VSMC,并与传统组织块法和酶消化法进行细胞萌出速度及增殖速度比较,提高VSMC原代培养效率;免疫荧光染色法和western bloting法检测平滑肌细胞标志物calponin及a-SMA表达鉴定VSMC。结果预消化组织块法获得原代VSMC速度快于传统组织块法和酶消化法,3 d可见细胞萌出,9 d可达80%细胞融合,"峰谷"特征明显,而酶消化法至12 d增殖至80%细胞汇合,传统组织块法约7 d可见细胞萌出,14 d可达80%细胞汇合;VSMC平滑肌标志物calponin和a-SMA均呈阳性表达(P0.05);VSMC可扩增代数有限,扩增7代后即表现出细胞形态改变,增殖缓慢,胞核内出现空泡,死亡细胞增加等表现。结论预消化组织块法可较快速多量获得绵羊VSMC。     

乳鼠心肌细胞原代培养方法

目的:探讨新生乳鼠心肌细胞原代培养的条件和方法,培养纯度高、存活时间长的心肌细胞。方法:参照Simpson等的方法加以改进,采用含0.05%EDTA的胰蛋白酶多次消化心肌,差速贴壁1.5 h纯化心肌细胞进行培养,培养过程在37℃、5%CO2条件下进行。用台盼蓝染色法检测培养细胞的存活率,倒置显微镜下观察细胞形态变化,记录3 d、6 d、9 d、12d心肌细胞搏动频率,测定细胞活力。结果:原代培养乳鼠心肌细胞生长良好,培养3 d、6 d、9 d、12 d时,用台盼蓝染色法检测心肌细胞的存活率均大于96%,培养12 d时仍为97.02%。在倒置显微镜下观察,培养48 h左右的细胞之间相互连接的并有细胞搏动。培养6 d、9 d、12 d的细胞与培养3 d的相比,活力增强,差异显著(P<0.05),从6 d开始,细胞活力并未显著增强,两两比较均无统计学差异(P>0.05)。结论:应用此方法培养的心肌细胞纯度高,存活时间长,是一种稳定、可靠的原代心肌细胞培养方法。     

小鼠睾丸支持细胞的原代培养和鉴定

目的 建立小鼠睾丸支持细胞培养方法，为从细胞和分子水平研究环境化合物对雄性生殖系统的影响提供条件。方法 采用两步胶原酶消化，提取出生10d的ICR雄性小鼠睾丸支持细胞，用Tris-HCl处理后除去生精细胞，进一步纯化。倒置相差显微镜和苏木精-伊红（HE）染色观察细胞生长和形态。Feulgen染色法鉴定支持细胞。结果 培养的支持细胞增生活跃，纯度〉95％，Feulgen染色后明显可见支持细胞核内的双极小体。结论 酶消化法分离和Feulgen染色法鉴定大鼠支持细胞简单易行，且细胞纯度较高。为今后研究生殖毒理提供了条件和方法。     

Evaluation of serum-free culture conditions for primary human nasal epithelial cells

Defined culture conditions are essential for the interpretation of effects caused by volatile substances on human nasal epithelial cells (HUNEC) cultured in vitro. Conventionally, serum-containing media are used. However, the results of these experiments are of restricted value as serum contains many unknown and undefined substances. Not all serum-free media on the market are suitable for culturing primary HUNEC. Therefore, serum-free defined cell culture media were compared to evaluate optimal conditions for HUNEC and their cell lines. HUNEC were generated by trypsin digestion of mucosal tissue of the inferior turbinate. Cells were cultured on uncoated polystyrene dishes adding pre-warmed medium. Viability was controlled by trypan blue dye exclusion; colony forming units and cell morphology were controlled microscopically. The expression of different cytokeratins was studied immunocytochemically. Dulbecco's modified Eagle's medium was not suitable to grow HUNEC and passage them. HUNEC cultured in bronchial epithelial growth medium presented a more homogeneous cell morphology compared to other media and had a doubling time of 1.2 days. The maximum number of cell passages was 11 with bronchial epithelial growth medium.     

大鼠肾细胞分离制备及培养方法的比较

目的比较胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法和胶原酶、胰蛋白酶两步消化法(简称两步消化法)对大鼠肾细胞分离效果及细胞产量的影响,以及不同培养基(MEM、RPMI1640)、鼠龄(乳鼠、成年鼠)对细胞产量、质量、增殖率和乳酸脱氢酶(LDH)漏出量的影响。方法分别对两组Wistar大鼠(乳鼠和成年鼠)用三种不同的消化方法制备大鼠肾组织细胞悬液,分别在MEM培养液和RPMI1640培养液中原代培养,培养48小时之后第一次传代,观察细胞质量,计算细胞产量,MTT法检测传代细胞24~48小时之间的增殖率,生化分析仪检测传代细胞第1~7天培养液中LDH漏出量。结果胶原酶消化法和两步消化法的肾细胞产量显著高于胰蛋白酶消化法(P<0.01),两步消化法的细胞质量优于胶原酶消化法,MEM培养液和RPMI1640培养液对细胞产量、增殖率和LDH漏出量的影响均无显著性差异,乳鼠的肾细胞产量显著高于成年鼠(P<0.01)。结论两步消化法对于肾细胞的分离制备尤为适合,MEM培养液和RPMI1640培养液均适于肾细胞的培养,乳鼠比成年鼠更适合肾细胞的制备。