CRKL基因反义寡核苷酸对K562细胞增殖的影响

目的：通过研究CRKL基因反义寡核苷酸对K562细胞增残活性的影响,探讨CRKL基因在Ph^ 慢性粒细胞性白血病（CML）发病中的作用,方法： 脂质体为载体,CRKL基因反义寡核苷酸转染K562细胞,通过活细胸记数,H^3-TdR掺入,RT－PCR等方法观察K562细胞的增殖活性及基因表达的变化,结果,CRKL反义寡核苷酸对K562细胞的增殖有抑制作用,结论：CRKL基因在Ph^ CML的发病中可能有重要作用,可作为CML治疗的新靶点。     

survivin反义寡核苷酸对K562细胞增殖的抑制作用

目的:采用反义寡核苷酸技术研究凋亡抑制基因survivin对白血病细胞增殖的影响.方法:1.细胞抑制率实验分5组:111nmol/L反义寡核苷酸组、333nmol/L反义寡核苷酸组、555nmol/L反义寡核苷酸组、777nmol/L反义寡核苷酸组、空白组.转染后24、48、72h收集细胞进行检测:用台盼蓝染色进行活细胞计数,计算细胞抑制率.2.细胞周期及survivin蛋白表达实验分4组:555 nmol/L寡核苷酸组、544nmol/L无义组、脂质体组、空白组,转染后24、48h流式细胞仪检测细胞周期;免疫组织化学方法检测survivin蛋白水平.结果:不同浓度的反义寡核苷酸对K562细胞的细胞抑制率均高于空白组(P<0.05),并随反义寡核苷酸的浓度增大抑制率增加;随作用时间延长,抑制作用越明显,抑制率与浓度及时间呈正相关;555nmol/L反义寡核苷酸作用后,K562细胞被阻滞在G0/G1期,细胞周期进程受到明显阻滞,而无义、脂质体、空白组细胞周期进程无明显变化(P<0.05);反义寡核苷酸作用48h后survivin蛋白表达水平明显降低,与各对照组比较有显著性差异(P<0.05).结论:survivin反义寡核苷酸能抑制K562细胞的增殖.     

Survivin反义寡核苷酸诱导K562细胞株凋亡的实验研究

目的 探讨Survivin反义寡核苷酸对K562细胞株凋亡的影响.方法 将K562细胞分为四组:反义组、无义组、脂质体组及空白对照组,通过脂质体将Survivin反义寡核苷酸转染入各组K562细胞,用免疫组化法测定转染前后K562细胞Survivin基因及Caspase-3的表达差异,用Tunel及Annexin V-FITC测定各组细胞的凋亡率.结果 Survivin基因在K562细胞高表达,转染反义核苷酸后其表达下降,转染Survivin基因反义核苷酸后Caspase-3的表达较其它各组升高,K562细胞生长受抑,细胞凋亡率升高.结论 Survivin反义寡核苷酸能够下调Survivin基因的表达,促进白血病细胞株K562的凋亡.     

反义bcr/abl寡核苷酸诱导K562细胞凋亡时Caspase3表达及活性的变化

用反义bcr／abl寡核苷酸片段诱导K562细胞凋亡,观察Caspase3表达及活性变化,以阐明Caspase3在慢性髓性白血病(CML)发病机制中的作用。方法用反义bcr／abl寡核苷酸片段AS和对照无义片段NS处理CML急变细胞系K562,检测细胞凋亡及Caspase3表达和活性的变化。结果K562细胞经AS处理72h,流式细胞仪检测未见亚二倍体细胞增多。原位末端标记法显示AS组24h始出现细胞凋亡增多,72h达高峰,为(78.50＋6.60)％,较对照组(18.21土3.32)％及NS组(24.13土4.17)％明显增多(P     

分化抑制因子Id4对K562细胞株凋亡的影响

目的探讨Id4基因的反义核酸对人红白血病K562细胞凋亡的影响。方法采用脂质体介导的反义寡核苷酸转染DNA重组技术,将人反义Id4基因插入到真核表达载体pXJ41-neo上,重组质粒和空载体分别转染K562细胞,加入凋亡诱导剂三尖杉酯碱(HT)后采用流式细胞术、TUNEL和免疫印迹(Western blot)技术检测细胞的凋亡率以及相关蛋白Bcl-xl、c-Myc、p27的表达变化。结果获得了pAId4(反义基因重组质粒)和pK562(对照)克隆细胞株;加入诱导剂HT后,反义寡核苷酸组的凋亡率明显增高到43.5%;检测K562细胞凋亡过程中,Bcl-xl蛋白在pAId4细胞株中表达减低。结论反义Id4基因的转入对K562细胞起到诱导凋亡作用,并推测Id4在K562细胞中可能通过影响Bcl-xl的表达量,进一步诱导细胞凋亡。     

Survivin反义寡核苷酸对K562细胞耐药性的影响

目的 探讨Survivin反义寡核苷酸(antisense oligodeoxg nucleotide,ASODN)与传统化疗药物对白血病K562细胞耐药性的影响.方法 实验分为反义核苷酸组(ASODN)、无义核苷酸组(SODN)、脂质体组(Lip)、空白对照组,以脂质体转染Survivin ASODN,用RT-PCR检验SurvivinmRNA表达;用MTT法检测K562细胞对阿霉素(driacin,ADM)、柔红霉索(daunorubicin.DAM)及联合用ASODN耐药性;用流式细胞仪检测单独用ADM、DAM和联合用ASODN时K562细胞内ADM和DAM的浓度.结果 ASODN组Survivin mRNA表达较对照组降低(P<0.05);ADM和ASODN ADM对K562细胞的半数抑制细胞(IC50)分别为0.5457 mg/L和0.1933 mg/L,DAM和ASODN DAM对K562细胞的IC5.分别为0.5408 mg/L和0.2027 mg/L,联合用药组ICso低于单用药组(P<0.05);用ADM和ASODN ADM时K562细胞内药物的荧光强度分别为51.64、89.92,DAM和ASODN DAM时K562细胞内药物的荧光强度分别为63.71、88.47,联合用药组细胞内药物浓度高于单用药组(P<0.05).结论 Survivin反义寡核苷酸可下调K562细胞Survivin mRNA的表达;Survivin反义寡核苷酸与阿霉素和柔红霉索联合作用可提高K562细胞内药物浓度,降低细胞生存率,降低细胞耐药性.     

Bcr/abl同靶点小干扰RNA与反义寡核苷酸对K562细胞的作用比较

目的比较靶向Bcr／abl基因b3a2融合位点的小干扰RNA（small interferon RNA,SiRNA）及作用靶点完全相同的反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,ASODN）对人白血病K562细胞的增殖抑制作用,并联用三氧化二砷（As2O3）,比较二者对K562细胞化疗增敏作用。方法体外转录方法合Bcr／abl b3a2融合住点SiRNA,lipofectamine^TM2000转染,改良MTT法检测药物对K562细胞增殖的抑制作用。结果SiRNA和相同作用靶点的ASODN均显示出明显的细胞增殖抑制效应,SiRNA抑制K562细胞的IC50为97．47nmol／L,ASODN抑制K562细胞的IC50为10．71μmol／L;50nmol／L SiRNA与As2O3联用后,明显提高K562细胞对As2O3的敏感性,相同浓度的ASODN对细胞无明显化疗增敏作用。结论本实验结果提示针对Bcr／abl基因融合位点设计的极低浓度的SiRNA即能显著抑制K562细胞增殖,提高细胞对化疗药物的敏感性,其效果明显强于同靶位点的ASODN,显示了RNAi技术应用于慢性髓系白血病的良好前景。     

多药耐药相关蛋白-2在白血病耐药细胞株K562/A02的表达

目的:研究多药耐药相关蛋白-2（MRP-2）与白血病细胞耐药的关系,并探讨其在白血病多药耐药中的意义。方法：应用RT-PCR方法检测白血病细胞株K562与耐药细胞株K562/A02中MRP-2 mRNA的差异表达,然后将MRP-2反义及正义寡核苷酸片段分别用脂质体转染至耐药细胞株K562/A02,采用MTT法、流式细胞术及RT-PCR法检测转染后细胞内阿霉素的荧光强度、耐药指数及MRP-2 mRNA的表达情况。结果：耐药细胞株K562/A02中MRP-2 mRNA表达水平明显高于白血病细胞株K562（P<0.05）。MRP-2反义寡核苷酸片段转染后耐药细胞株K562/A02细胞内的阿霉素浓度升高,耐药指数较未转染细胞明显降低（P<0.05）;转染后耐药细胞株K562/A02细胞MRP-2 mRNA表达水平较未转染细胞下降了67.5%,两者比较差异具有显著性（P<0.05）。结论：MRP-2的高表达导致白血病耐药细胞内化疗药物浓度降低,可能是其导致白血病多药耐药的机制之一。     

阳离子脂质体LipofectinTM对WT1反义核酸在K562细胞的摄入和胞内分布的影响

目的探讨阳离子脂质体LipofectinTM对WT1反义寡核苷酸(反义核酸)细胞摄入和胞内分布的影响. 方法采用阳离子脂质体介导WT1反义核酸转染K562细胞,应用流式细胞仪、荧光显微镜分别观察反义核酸的细胞摄入和胞内分布,RT-PCR检测处理前后WT1 mRNA表达水平. 结果 (1)脂质体提高K562细胞对反义核酸的摄入,细胞摄入率达70.9%,平均荧光强度提高6倍以上;脂质体介导转染反义核酸时其细胞浆中类核内体或溶酶体中的点状结构较非脂质体处理时大,胞核内有明显的荧光物质分布;(2)脂质体介导WT1反义核酸可下调WT1 mRNA水平. 结论阳离子脂质体可提高反义核酸的细胞摄入并改变其胞内分布,这可能是它增强反义核酸生物活性的机制.     

反义VEGF cDNA转染联合应用IFNα或信号转导抑制剂571(STI571)对K562细胞的协同抑制

目的：探讨转染反义VEGF Cdna及联合应用IFN α或STI571对慢性髓性白血病（chron ic myeloid leukemia ，CML）急变细胞株K562的作用。方法：利 用转染反义(AS)、正义(S) VEGF121cDNA及空载体（V，pcDNA3）的K562细胞株，采用台盼蓝拒染法、流式细胞 术Annex inVFITC/PI双标技术，观察IFNα或STI571（CGP57148B）对转染后K562细胞增殖及凋亡 的影响。结果： IFNα(100 u·ml-1)能抑制K562/AS细胞生 长，增加其凋亡。STI571（0.1 μmol·L-1） 对K562/V、K562/S和K562/AS细胞生长均有抑制作用。低剂量VP16（10 mg·L-1） 或低剂量STI5 71（0.1 μmol·L-1）在24 h就对K562/AS细胞有诱导凋亡的作用，且VP16（10 mg ·L-1）与STI571（ 0.1 μmol·L-1）的联合应用具有协同诱导K562/AS细胞凋亡的作用。在72 h时， 0.1 μmol·L-1的STI5 71对K562/V、K562/S和K562/AS细胞均有诱导凋亡的作用。结论：转染反义VEGF121Cdna联合 应用IFNα能协同抑制细胞增殖，转染反义VEGF121Cdna能增加K562细胞对VP16或STI5 71的敏感性。提示抗VEGF药物可能成为治疗CML的新策略。     

VEGF反义寡核苷酸抑制C6胶质瘤细胞VEGF表达的作用和效果

目的:设计了针对VEGF的第Ⅲ外显子(exon,E3)的反义、错义和正义寡核苷酸,观察VEGF反义寡核苷酸抑制C6胶质瘤细胞VEGF表达的作用.方法:免疫细胞化学法观察反义、正义、错义寡核苷酸对C6胶质瘤细胞VE GF表达的影响;观察制备反义、正义、错义寡核苷酸的条件培养液对内皮细胞生长的抑制作用.结果:VEGF反义寡核苷酸对C6胶质瘤细胞VEGF的表达有明显抑制作用.结论:反义VEGF寡核苷酸通过抑制C6胶质瘤细胞VEGF的表达,进而抑制内皮细胞的生长.     

雷公藤甲素通过调节microRNA21的表达干预K562/A02细胞的化疗敏感性

目的: 研究雷公藤甲素对K562/A02细胞多药耐药性的逆转作用,并探讨其机制。方法: 四甲基偶氮唑盐比色（MTT）法检测雷公藤甲素细胞毒性;采用非毒性浓度雷公藤甲素作用于K562/A02细胞,AnnexinV/PI双标法检测细胞凋亡;荧光定量PCR检测microRNA21表达水平;蛋白印迹法检测Bcl-2蛋白表达水平。microRNA21反义寡核苷酸转染K562/A02细胞,观察细胞增长率,凋亡率和Bcl-2表达的变化。结果: 非毒性浓度（5 nmol/L）雷公藤甲素明显增强K562/A02细胞对多柔比星的敏感性,并能增强多柔比星诱导细胞凋亡的作用,使K562/A02细胞平均凋亡率由4.3%明显上升到18.5%（P< 0.05）;雷公藤甲素作用后,microRNA21和Bcl-2蛋白水平降低;microRNA21反义寡核苷酸转染K562/A02细胞后,降低了Bcl-2表达,提高多柔比星敏感性和多柔比星诱导的细胞凋亡。 结论: 雷公藤甲素增强K562/A02细胞对多柔比星的敏感性,并诱导其凋亡,可能与下调microRNA21水平有关。     

反义核酸对人白血病HL—60细胞中c—myc基因表达的抑制

研究两个反义核酸（18mer，21mer）对人白血病HL—60细胞中c－myc基因表达的抑制作用。用HL－60活细胞计数，RNA含量的RT－PCR测定和c－myc基因蛋白的免疫组化染色检查。结果：两个反义寡核苷酸都能抑制HL－60细胞的增殖，增殖抑制率为11％～75％。反义核酸还抑制c－mycmRNA和Myc蛋白的表达，而对c－mcy基因正常表达的红白血病细胞K562的增殖和PHA刺激的人淋巴细胞的增殖没有影响。结论：反义寡核苷酸能抑制c－myc基因的过度表达。     

VEGF对白血病树突状细胞抗原提呈能力的影响

目的 探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial cell growth factor,VEGF)对白血病源树突状细胞(dendritic cell,DC)抗原提呈能力的影响及其分子机制.方法 K562细胞经5 μmol/L VEGF反义寡核苷酸(AS-ODN)处理24 h,ELISA和免疫组化检测VEGF蛋白水平.以正常K562细胞诱生的白血病DC作为对照组,利用流式细胞术和混合淋巴细胞反应,观察AS-ODN处理的白血病DC的免疫表型及其刺激T细胞增殖的能力.采用荧光素酶检测系统和RT-PCR分析培养12 h时白血病DC内NF-κB转录活性和Flt-1 mRNA水平.结果 AS-ODN处理使K562细胞VEGF蛋白分泌量较K562细胞组显著下降(P＜0.05).与K562-DC比较,AS-ODN处理的免疫表型(CD40、CD86、CD83、HLA-DR)表达明显上调.在不同DC/T值(1:10～1:40)时,MLR实验中AS-K562-DC组刺激指数(SI)明显高于对照组(P＜0.05).此外,培养12 h时AS-K562-DC NF-κB转录活性较K562-DC明显增高(P＜0.05),而Flt-1 mRNA水平未见明显改变.结论 反义寡核苷酸可抑制白血病细胞VEGF表达,下调VEGF能够增强白血病DC免疫表型的表达,提高DC抗原提呈能力.     

Bcl-2反义核酸增强青蒿琥酯诱导K562细胞凋亡

目的:研究bcl-2反义核酸增强青蒿琥酯对人慢性粒细胞白血病K562细胞株诱导凋亡效应. 方法:合成bcl-2反义核酸(ASON)导入K562细胞,应用Western blot法检测bcl-2蛋白的表达,TUNEL技术、流式细胞仪法(FCM法)检测细胞凋亡. 结果:bcl-2反义核酸(ASON)能明显抑制bcl-2蛋白的表达. 青蒿琥酯在1～7 mg/L浓度范围内能分别明显抑制K562细胞的增殖,并具有时间和浓度依赖性, 7 mg/L青蒿琥酯作用72 h的K562细胞株A值最低. 原位细胞凋亡检测可见细胞变小,核固缩为一个或多个染色质团块,与未经ASON转染的K562细胞株相比,经bcl-2 ASON转染的K562细胞株对青蒿琥酯的诱导凋亡作用更加明显;FCM法出现低于G1期DNA含量的亚二倍体凋亡峰,细胞凋亡主要发生在G1/S期,与未经ASON转染的K562细胞株相比,经bcl-2 ASON转染的K562细胞凋亡率显著增加. 结论:青蒿琥酯在体外一定浓度范围内可诱导K562细胞株凋亡,bcl-2反义核酸可增强青蒿琥酯诱导K562细胞凋亡的作用.     

人端粒酶RNA反义寡核苷酸对顺铂诱导K562细胞凋亡的影响

目的研究人端粒酶RNA(hTR)反义寡核苷酸(ASODN)可否增强K562细胞对顺铂的敏感性。方法采用与hTR模板区互补的硫代ASODN处理K562细胞,用端粒酶重复扩增分析-PCR-ELISA检测法观察端粒酶活性的变化;琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡的DNA断裂;Annexin V PI双染后流式细胞仪检测凋亡细胞百分率。结果经ASODN作用后,K562细胞端粒酶活性明显下降。ASODN作用K562细胞24 h,再加入顺铂作用72 h,琼脂糖凝胶电泳可见DNA梯形条带,而正义寡核苷酸(SODN)与顺铂联合作用组及单用顺铂组均未见到明显的DNA梯形条带。ASODN作用K562细胞24 h,再加入5 μmol/L 顺铂作用48、72 h的凋亡细胞百分率(18.3%和31.6%)分别与SODN联合顺铂作用组(9.6%和10.5%)、单用顺铂组(7.1%和9.4%)比较,差异有显著性(P<0.01)。结论以hTR模板区为靶点,ASODN能抑制端粒酶活性并促进顺铂诱导K562细胞的凋亡。     

bcl-2反义寡核苷酸对小细胞肺癌细胞NCI-H69放射敏感性的影响

目的研究bcl-2反义寡核苷酸对人小细胞肺癌细胞NCI-H69放射敏感性的影响。方法将NCI-H69细胞培养传代,然后将细胞分为反义寡核苷酸组、正义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组和空白对照组,通过脂质体将不同寡核苷酸导入细胞中,用Western-Blot法检测Bcl-2蛋白的表达。采用直线加速器分别以不同剂量（0、2、4、6、8、10 Gy）X线照射4组细胞。收集照射后的细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率,MTT法测定细胞存活分数。结果Western-Blot杂交显示反义寡核苷酸组无Bcl-2蛋白表达,相对正义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组及空白对照组Bcl-2蛋白表达明显受到抑制（F=7.24-15.31,q=5.03-7.80,P〈0.01）。细胞经X线照射后,反义寡核苷酸组细胞凋亡率明显高于空白对照组,差异具有显著性（F=7.24-15.31,q=5.03-7.80,P〈0.01）;正义寡核苷酸组和无义寡核苷酸组与空白对照组相比无统计学差异。4组细胞接受辐射后,反义寡核苷酸组在未照射和照射不同剂量后的存活分数均低于空白对照组,差异有统计学意义（F=11.04-45.56,q=5.10-14.75,P〈0.01）,而正义寡核苷酸和无义寡核苷酸组与空白对照组比较则无统计学差异。结论bcl-2反义寡核苷酸能有效封闭bcl-2基因的表达,增强小细胞肺癌细胞NCI-H69对X线的敏感性。     

bcl-2反义寡核苷酸对小细胞肺癌细胞NCI-H69放射敏感性的影响

目的 研究bcl-2反义寡核苷酸对人小细胞肺癌细胞NCI-H69放射敏感性的影响.方法 将NCI-H69细胞培养传代,然后将细胞分为反义寡核苷酸组、正义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组和空白对照组,通过脂质体将不同寡核苷酸导入细胞中,用Western-Blot法检测Bcl-2蛋白的表达. 采用直线加速器分别以不同剂量(0、2、4、6、8、10 Gy)X线照射4组细胞.收集照射后的细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率,MTT法测定细胞存活分数.结果 Western-Blot杂交显示反义寡核苷酸组无Bcl-2蛋白表达,相对正义寡核苷酸组、无义寡核苷酸组及空白对照组Bcl-2蛋白表达明显受到抑制(F=7.24～15.31,q=5.03～7.80,P＜0.01).细胞经X线照射后,反义寡核苷酸组细胞凋亡率明显高于空白对照组,差异具有显著性(F=7.24～15.31,q=5.03～7.80,P＜0.01);正义寡核苷酸组和无义寡核苷酸组与空白对照组相比无统计学差异.4组细胞接受辐射后,反义寡核苷酸组在未照射和照射不同剂量后的存活分数均低于空白对照组,差异有统计学意义(F=11.04～45.56,q=5.10～14.75,P＜0.01),而正义寡核苷酸和无义寡核苷酸组与空白对照组比较则无统计学差异.结论 bcl-2反义寡核苷酸能有效封闭bcl-2基因的表达,增强小细胞肺癌细胞NCI-H69对X线的敏感性.     

阳离子脂质体增加造血系统恶性肿瘤细胞株对寡核苷酸G3139的摄入

目的观察阳离子脂质体DOSPER介导或Bcl-2反义寡核苷酸G3139直接作用时,造血系统恶性肿瘤细胞株对G3139的摄入,为阳离子脂质体和反义寡核苷酸的进一步应用提供依据.方法利用异硫氰酸荧光素标记的G3139,流式细胞仪(FCM)测定造血系统恶性肿瘤细胞株HL60、K562、U937、CA46和CEM细胞内的平均荧光强度.结果 G3139直接作用于细胞时,细胞内荧光强度U937>HL60>CA46>K562>CEM(P<0.05);DOSPER介导转染时,各细胞内的荧光强度均显著高于直接转染时(P<0.01),而且当DOSPER/G3139(μg/μg)为2～3∶1时,转染效率最佳,但此时各细胞间细胞内平均平均荧光强度无明显的差别(P>0.05).结论不同造血系统恶性肿瘤细胞株对G3139的摄入不同,阳离子脂质体DOSPER可普遍提高细胞对G3139的摄入.     

依硫磷酸对人慢性髓细胞白血病K562细胞系增殖的抑制作用

目的观察依硫磷酸对人慢性髓细胞白血病K562细胞系增殖的抑制作用。方法将依硫磷酸（粉末）以1640培养液稀释成0.2mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml、1.0mg/ml、1.6mg/ml、3.2mg/ml共6个浓度组,分别处理增殖期人慢性髓细胞白血病K562细胞,镜下观察不同时间点各浓度组细胞生长情况,应用CCK-8法检测细胞增殖能力,绘制生长曲线,计算抑制率和半数抑制浓度（IC50）。结果依硫磷酸对K562细胞增殖具有抑制作用,细胞倍增时间为48h,并且具有时间和剂量依赖性。在给药48h〉0.75mg/ml浓度的依硫磷酸对K562细胞增殖具有抑制作用（P〈0.05）,而3.2mg/ml浓度的依硫磷酸与K562细胞培养72h后对其增殖抑制作用最强,抑制率为91%。结论依硫磷酸对K562细胞增殖具有抑制作用,为临床应用依硫磷酸治疗慢性髓细胞白血病提供了实验基础。