切割穹窿海马伞大鼠海马内Brn-4 mRNA的表达变化——原位杂交法

目的 探讨大鼠穹隆海马伞切割侧与正常侧海马内Brn-4 mRNA表达的差异.方法 切割大鼠右侧穹窿海马伞,切割后14d制备海马冰冻切片,用体外转录法制备地高辛标记的Brn-4 RNA探针进行原位杂交.每只动物随机计数3张切片切割侧和正常侧Brn-4 mRNA的阳性细胞,测定其吸光度(A)值,进行配对t检验分析.结果 切割侧和正常侧海马锥体细胞层和齿状回颗粒层均见Brn-4 mRNA阳性细胞,两侧细胞数无明显差异,但切割侧阳性细胞平均吸光度值较正常侧明显增加(P＜0.01);而在齿状回门区和颗粒下层,切割侧Brn-4 mRNA阳性细胞数和平均吸光度值均较正常侧升高(均P＜0.01).结论 穹窿海马伞切割侧海马锥体细胞层和齿状回颗粒层细胞中Brn-4 mRNA的表达量明显增强,而在齿状回门区和颗粒下层中,其阳性细胞数和表达量均较正常侧明显升高.结合本课题组以往的工作,提示切割穹窿海马伞后,海马中Brn-4 mRNA表达的增高可能与促进其中的神经干细胞向神经元分化有关.     

去神经支配大鼠海马内MTSS1的表达变化

目的:探讨切割穹窿海马伞去神经支配大鼠海马内转移抑制蛋白1(metastasis suppressor 1,MTSS1)的表达变化。方法:SD大鼠随机分成正常组和切割穹窿海马伞后1、3、5、7、14 d组,采用Real-time PCR和免疫荧光组织化学技术观察穹窿海马伞切割后海马内MTSS1 mRNA的表达变化和MTSS1阳性细胞的分布情况。结果:(1)Real-time PCR结果显示:海马内MTSS1 mRNA的相对表达量在切割后3 d开始升高(P<0.05),5 d达到最高水平(P<0.01),7 d恢复至正常水平;(2)免疫荧光组织化学染色结果显示:MTSS1阳性细胞主要表达于海马齿状回门区及颗粒下层中,切割后5 d MTSS1阳性细胞数开始增多(P<0.01),7 d继续增多并达到高峰(P<0.01),14 d时开始下降至正常水平。结论:结合本课题组以往的工作,上述结果提示切割穹窿海马伞后MTSS1的高表达可能与海马神经再生过程中神经干细胞向神经元的分化有关。     

切割穹窿海马伞大鼠海马内Lhx8 mRNA表达的变化

目的:探讨切割穹窿海马伞大鼠切割侧与正常侧海马内Lhx8 mRNA表达的差异。方法:切割SD大鼠右侧穹窿海马伞。切割后7d制备海马冰冻切片,用体外转录法制备地高辛标记的Lhx8 RNA探针进行原位杂交,分析切割侧和正常侧海马锥体细胞层和齿状回颗粒层中及齿状回门区和颗粒下层中的Lhx8 mRNA阳性细胞的数量和平均光密度值。结果:切割侧和正常侧海马锥体细胞层和齿状回颗粒层Lhx8 mRNA阳性细胞数量无明显差异,但切割侧平均光密度值较正常侧明显增加;在齿状回的门区和颗粒下层,切割侧Lhx8 mRNA阳性细胞数和平均光密度值均较正常侧升高。结论:切割穹窿海马伞后海马中Lhx8 mRNA表达上调,可能与其中的神经干细胞向胆碱能神经元分化的神经再生机制有关。     

Jagged1在大鼠切割穹窿海马伞后海马内的表达变化

目的:探讨切割穹窿海马伞后不同时相点海马内Jagged1的动态表达变化。方法:切割SD大鼠双侧穹窿海马伞,于切割后第3、7、14、21 d分别提取海马组织总RNA和总蛋白,应用RT-PCR和Western Blot的方法分别检测Jagged1基因和蛋白的表达变化;切割SD大鼠右侧穹窿海马伞,7 d后通过免疫组织化学的方法检测海马齿状回颗粒下层和门区中Jagged1阳性细胞的数目和平均光密度值(MOD)。结果:Jagged1基因和蛋白在切割穹窿海马伞后的第3 d表达开始增高,第7 d时达到最高水平,第14 d后表达下降至正常水平;切割穹窿海马伞后的第7 d,切割侧海马齿状回颗粒下层和门区中Jagged1阳性细胞数为167.89±22.11,平均光密度值为0.11±0.02;正常侧阳性细胞数为140.45±22.63,平均光密度值为0.06±0.01;切割侧阳性细胞数和平均光密度值与正常侧均明显增高(P0.05)。结论:切割穹窿海马伞后Jagged1基因和蛋白的表达呈现出先增高后降低的变化趋势,提示Jagged1是切割穹窿海马伞后海马内微环境的重要组成分子。     

切割穹窿海马伞大鼠海马内BLBP的表达变化

为了观察切割大鼠右侧穹窿海马伞后,切割侧与正常侧海马齿状回内脑脂结合蛋白(BLBP)的表达变化,本研究应用Western blot和免疫组织化学方法检测双侧海马内BLBP蛋白表达水平的变化,以及海马齿状回门区和颗粒下层中BLBP免疫阳性细胞数和灰度值。结果显示:正常大鼠双侧海马各区和颗粒下层细胞BLBP仅有微量表达,切割穹窿海马伞后第1 d双侧差异不明显;3 d时切割侧颗粒下层阳性细胞及染色深度较正常侧加深;5 d时切割侧颗粒下层阳性细胞数量明显增多,染色较深,并达到最高水平;7 d后BLBP免疫阳性细胞的数量和染色深度开始降低,14 d时接近正常侧水平。而切割后3、5 d时双侧门区BLBP免疫阳性细胞的数量差异不大,但切割侧染色较深,7 d后也逐渐降低,14 d时降至正常侧水平。上述结果提示,切割穹窿海马伞阻断了隔区与海马齿状回的纤维联系后,可引起海马齿状回门区和颗粒下层BLBP表达增强,可能引发了放射状胶质细胞的增殖和激活,构成的支架有助于神经干细胞的迁移和向神经元的分化。     

穹隆海马伞切割后大鼠海马内RUNX1T1 mRNA和蛋白的表达变化

目的 观察穹隆海马伞切割后不同时间点海马内RUNX1T1 mRNA和蛋白的表达变化及定位。方法 行穹隆海马伞切割术,制备模型大鼠。实验分为正常组、切割3d组、切割7d组、切割14d组、切割21d组、切割28d组。1.提取海马组织总mRNA,用Real-time PCR 检测大鼠海马组织中RUNX1T1mRNA 的表达;2.提取海马组织总蛋白,用Western blotting 检测海马内RUNX1T1蛋白的表达;3.行脑冷冻切片,行RUNX1T1免疫荧光检测和Hoechst标记,观察海马齿状回中RUNX1T1/Hoechst双标阳性细胞。 结果 Real-time PCR检测显示,切割3d组海马组织中RUNX1T1 mRNA的表达明显上调,其余各组差异不明显;Western blotting检测结果显示,正常组海马中有微量RUNX1T1蛋白表达,而切割3d组海马组织中RUNX1T1蛋白表达量明显上升,并达到高峰,7d时仍有较多的表达,此后,14d、21d、28d组中RUNX1T1蛋白表达很快又恢复到正常水平;免疫荧光检测结果表明,正常组海马齿状回中有少量的RUNX1T1/Hoechst阳性细胞,切割3d组海马齿状回中RUNX1T1/Hoechst阳性细胞数量最多,切割7d组逐渐减少,切割14d组、21d组和28d组与正常组差别不明显。结论 穹隆海马伞切割后海马内RUNX1T1 mRNA和蛋白表达在早期呈短暂性上调,并定位于海马齿状回颗粒下层,推测可能与海马神经再生过程中神经干细胞向神经元分化有关。     

切割穹窿海马伞后海马齿状回内Lhx8的表达变化及其对RGCs向胆碱能神经元分化的影响

目的:明确Lhx8在SD大鼠切割穹窿海马伞后海马齿状回颗粒下层和门区中的表达变化。方法:切割SD大鼠穹窿海马伞,成功制备海马去神经支配动物模型后,通过Western Blot的方法检测切割后第1、3、7、14、21、28 d海马中Lhx8蛋白的表达变化;通过免疫组织化学方法检测切割后第7天海马齿状回颗粒下层和门区中Lhx8阳性细胞的表达定位,并通过免疫荧光化学方法检测Lhx8/ChAT双标阳性细胞的共定位情况;切割SD大鼠穹窿海马伞并制备海马提取液,将其加入至细胞培养液中,模拟体内海马神经再生微环境,检测培养的海马放射状胶质细胞(radial slia cells,RGCs)向胆碱能神经元分化的情况。结果:切割穹窿海马伞后第7 d,Lhx8蛋白表达量较其他各时相点明显增高;海马齿状回颗粒下层和门区中Lhx8阳性细胞数目和光密度也明显高于正常侧,Lhx8/ChAT双标阳性细胞数目也较正常侧增多;体外细胞培养,切割穹窿海马伞侧海马提取液也较正常侧海马提取液更能促进海马放射状胶质细胞向胆碱能神经元的分化。结论:切割穹窿海马伞后,Lhx8表达明显上调,与海马齿状回的胆碱能神经再生有关。     

神经生长因子对穹窿海马伞切割后海马自体神经干细胞增殖和向神经元分化的影响

目的 探讨切割穹窿海马伞及脑室给予神经生长因子(NGF)后,对大鼠海马自体神经干细胞增殖和分化为神经元的影响.方法 12只SD大鼠,随机分成给药组和对照组,每组6只,切割右侧穹窿海马伞,两组切割后即时及第2d、4d向侧脑室分别注射NGF和人工脑脊液, 并在术后第3～7d每日腹腔注射2次BrdU.于术后28d灌注取脑、冷冻切片,行BrdU/NF-200免疫荧光双标检测.结果 海马齿状回内BrdU阳性细胞数,给药组和对照组切割侧明显多于正常侧,给药组切割侧和正常侧分别多于对照组切割侧和正常侧;海马齿状回内的BrdU/NF-200双标神经元数,给药组切割侧最多,给药组正常侧和对照组切割侧较少,而对照组正常侧则无.结论 切割穹窿海马伞后,可致大鼠海马齿状回自体神经干细胞增殖加快并向神经元分化,脑室施加 NGF可促进其增殖和分化.     

穹窿海马伞切割侧海马提取液对神经干细胞分化为神经元的促进作用

目的 探讨穹窿海马伞切割侧海马提取液对神经干细胞分化为神经元和AchE阳性神经元的影响。方法 切割SD大鼠右侧穹窿海马伞，14d后取两侧海马制成提取液；将神经干细胞接种于3块24孔培养板中，每板分成切割组、正常组和对照组各8孔，前2组分别加入切割侧和正常侧海马提取液。第1、2块分别于第7d和14d时行MAP-2免疫荧光检测；第3块于10d时行AChE组织化学染色。计数MAP-2和AChE阳性神经元数，观察胞体大小和突起长度。结果 切割组第7d时MAP-2阳性神经元较多，胞体大、突起长，14d时细胞进一步迁移、成熟；正常组第7d时仅见少量突起短的MAP-2阳性神经元，14d时细胞稍增多，突起稍增长：对照组第7d时未见MAP-2阳性神经元，14d时仅有少量胞体小、突起短的MAP-2阳性神经元。第10d切割组AChE阳性神经元较多，突起多而长，正常组仅见少量无突起的AChE阳性神经元，对照组未见AChE阳性神经元。结论 穹窿海马伞切割侧海马提取液可明显促进神经干细胞分化为神经元和AChE阳性神经元。     

切割穹窿海马伞大鼠海马IGF2及其受体IGF2R蛋白的表达变化

目的:观察穹窿海马伞切割后不同时间点海马胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor,IGF2)及其受体IGF2R蛋白的表达变化及定位。方法:应用ELISA、Western blot和免疫荧光组织化学方法检测海马内IGF2及其受体IGF2R蛋白,以及齿状回门区和颗粒下层中IGF2/Hoechst和IGF2R/Hoechst阳性细胞的数量及形态学变化。结果:(1)ELASA结果显示:IGF2在切割后7 d表达开始上升,14 d达最高水平,随后缓慢下降,28 d时降至正常水平。(2)Western blot结果显示:IGF2R也存在一个相应的表达升高与消退的过程,说明两者具有明显的相关性。(3)免疫荧光染色结果显示:正常组海马齿状回门区和颗粒下层IGF2及其受体IGF2R阳性细胞的数量较少,切割穹窿海马伞后第3 d数量稍有增多,但差异不明显;7 d时阳性细胞明显增多;14 d时阳性细胞继续增多,并达到最高水平;21 d后阳性细胞的数量开始下降,28 d时接近正常组水平。结论:切割穹窿海马伞后IGF2及其受体IGF2R的高表达可能与海马神经再生中抑制神经干细胞和放射状胶质细胞增殖,从而启动其向神经元等分化有关。     

Brn-4在大鼠海马神经干细胞向神经元分化中的作用

为探讨Brn-4在海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)向神经元分化过程中的作用,分别制备切割海马伞侧和正常侧海马提取液,将鼠胚海马神经干细胞球分成3组:(1)切割组加入含切割侧海马提取液的DMEM/F12无血清培养基;(2)正常组加入含正常侧海马提取液的DMEM/F12无血清培养基;(3)对照组加入单纯的DMEM/F12无血清培养基。培养后第14d行Brn-4/MAP-2免疫荧光双标染色。在荧光显微镜下分别计数每个视野下Brn-4单标神经元和Brn-4/MAP-2双标神经元的数量,并测量双标神经元的胞体面积、细胞周长以及Brn-4的免疫荧光强度。用图像处理系统和Stata7.0软件对所得数据进行统计学分析。结果显示:Brn-4/MAP-2双标神经元数在切割组中较多、胞体较大、突起较丰富,且Brn-4的免疫荧光亦较强;正常组次之,对照组最差。上述数据经组间比较分析,3组间差异有显著性意义(P<0.01)。本研究结果提示Brn-4在海马神经干细胞向神经元分化过程中可能发挥重要作用。     

Brn-4抗体对大鼠海马神经干细胞分化为神经元的影响

为探讨Brn-4在海马神经干细胞(NSCs)向神经元分化过程中的作用,分别制备成年SD大鼠海马伞切割侧和正常侧海马提取液;将从鼠胚海马中分离、克隆和扩增的神经干细胞球分成6组:(1)切割组:加入含切割侧海马提取液的DMEM/F12培养基;(2)切割阻断组:在切割组培养基中加入Brn-4多克隆抗体;(3)正常组:加入含正常侧海马提取液的DMEM/F12培养基;(4)正常阻断组:在正常组培养基中加入Brn-4多克隆抗体;(5)空白组:加入单纯的DMEM/F12培养基;(6)空白阻断组:在空白组培养基中加入Brn-4多克隆抗体。培养后第14d对NSCs分化的神经元进行MAP-2免疫荧光检测,图像处理系统计数各组MAP-2阳性神经元数、处理胞体面积和细胞周长,STATA7.0软件进行统计分析。结果显示:各组以上三项形态学指标从优到劣的排列顺序为:切割组、正常组、切割阻断组、正常阻断组、空白组和空白阻断组。统计分析结果表明,除空白组与空白阻断组三项指标无显著性差异外,其余各组间差异均有显著性意义(P<0.05)。上述结果提示,Brn-4多克隆抗体在体外能部分地阻断切割海马伞侧海马提取液促进NSCs向神经元分化的作用,因而Brn-4在海马NSCs向神经元分化过程中可能发挥重要作用。     

海马中56 kD蛋白诱导人神经干细胞向神经元分化的作用

在已证明切割海马伞海马中差异表达的56kD蛋白具有诱导神经干细胞迁移作用的基础上,进一步探讨其诱导神经干细胞向神经元和AChE阳性神经元分化的作用。取切割SD大鼠海马伞后14d及正常海马组织的匀浆进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)。将用无血清培养技术获取的人胚神经干细胞球分别与切割海马伞后14d和正常海马56kD差异蛋白的胶条及空白对照胶条共培养,在倒置显微镜下观察神经干细胞球中细胞的迁移和分化情况,于第21d分别应用MAP-2免疫荧光和AChE组织化学方法检测人神经干细胞分化为神经元和AChE阳性神经元的情况,并进行神经元的计数、细胞面积、细胞周长的图像处理和统计学分析。结果显示,分化的MAP-2阳性神经元的数量、细胞面积及细胞周长三项指标切割组最好,正常组次之,而空白对照组最差;三组AChE组织化学染色均为阴性结果。上述结果提示切割海马伞后海马中差异表达的56kD蛋白具有诱导神经干细胞向MAP-2阳性神经元分化的作用,但不能诱导神经干细胞向AChE阳性神经元分化。     

大鼠海马神经元核受体-盐皮质激素受体于穹窿切断后表达的变化

目的:建立大鼠穹窿切断模型,研究海马神经元核受体-盐皮质激素受体(MR)表达的变化.方法:建立大鼠穹窿切断模型,于穹窿切断术后0、4、7、10 d取材;同时取材假手术组(非穹窿切断术)、正常组作为对照,应用免疫组织化学、免疫印迹方法分别进行各组海马神经元MR表达变化的观察及定量检测.结果:穹窿切断7 d后,免疫组织化学和免疫印迹结果显爪海马神经元MR表达下调,10 d下调更为显著.结论:穹窿切断后,海马MR表达下调,提示海马对下丘脑-垂体-肾上腺轴的抑制作用可能在穹窿切断后减弱.