人睾丸基因TDRG1重组真核载体的构建及其表达

目的 构建人睾丸基因TDRGl的真核表达质粒,并研究其表达.方法 取人新鲜正常睾丸组织,提取总RNA,采用逆转录.聚合酶联链反应(RT-PCR)扩增TDRG1基因编码序列;将该基因克隆到真核表达载体pYD5中,构建真核细胞表达载体pYD5-TDRG1,用限制性内切酶酶切分析,DNA序列分析鉴定重组质粒;将测序正确的重组质粒pYD5-TDRG1在脂质体介导下转染293细胞,间接免疫荧光法和Western Blot法鉴定目的 蛋白质的表达.结果 RT-PCR扩增出TDRGl基因编码序列,目的 插入片段长约303bp:产物行限制性内切酶酶切后连接到真核表达载体pYD5,重组质粒pYD5-TDRG1经酶切及DNA测序鉴定构建成功:该质粒转染293细胞48h后在荧光显微镜下可观察到绿色荧光,阳性细胞率96.42%;行Western blot分析检测到约39-8kD的目的 蛋白表达.结论 成功构建了人类睾丸基因TDRG1的真核表达载体pYD5-TDRG1,TDRG1基因在293细胞内成功表达.     

小鼠生长激素促分泌素受体真核表达载体的构建及表达鉴定

目的 构建小鼠生长激素促分泌素受体(GHS-R)真核表达系统,并观察其在瞬时转染的COS-7细胞系中的表达情况.方法 以小鼠基因组为模板,通过拼接PCR技术(SOE-PCR)克隆出GHS-R的编码序列(CDS),插入真核表达载体pcDNA3中,构建重组真核表达质粒pcDNA3-GHS-R,酶切鉴定并测序,瞬时转染COS-7细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能在真核细胞中表达相应的目的 蛋白.结果 成功扩增了小鼠GHS-R编码序列(CDS),酶切和测序证明pcDNA3-GHS-R构建正确,Western Blot方法证实转染的该质粒能在COS-7细胞中正确表达目的 蛋白.结论 成功构建了小鼠GHS-R真核表达载体,并正确表达蛋白,为进一步研究GHS-R的功能奠定了基础.     

WWOX基因真核表达载体的构建及其在SMMC-7721中的表达

目的克隆人WWOX基因及构建WWOX基因真核表达载体并研究其表达。方法取人新鲜正常肝组织，提取总RNA，采用逆转录-聚合酶联链反应（RT—PCR）扩增WWOX基因，将该基因定向克隆到真核表达载体pEGFP—N1中，构建真核细胞表达载体pEGFP—N1-WWOX，用限制性内切酶酶切分析，DNA序列分析鉴定重组质粒；将测序正确的WWOX基因通过脂质体介导下转染肝癌细胞SMMC-7721。结果重组质粒pEGFP—N1-WWOX经HindⅢ和BamHI双酶切后，获得4700bp片断和1234bp插入片断，序列分析表明插入的片段与Gene Bank发布的序列一致；荧光显微镜下可见转染的SMMC-7721细胞有绿色荧光蛋白的表达。结论成功构建了真核表达载体pEGFP—N1-WWOX，WWOX基因在SMMC-7721细胞内成功表达。     

Fibulin-5真核表达载体的构建及稳定转染人膀胱癌细胞的研究

目的 构建Fibulin-5真核表达载体并转染人膀胱癌5637细胞.方法 经聚合酶链反应(PCR)扩增Fibulin-5 cDNA,然后将其与pMD-19T载体连接.pMD-19T-Fibulin-5重组体经过限制性内切酶Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ的消化后产生Xho Ⅰ-Fibulin5-EcoR Ⅰ片段.将该片段插入增强型绿色荧光蛋白载体(p-EGFP N1)质粒的相似位点并最终合成p-EGFP-F5质粒重组体,并通过BgⅢ单酶切鉴定.通过脂质体介导法将p-EGFP-F5质粒转染至人膀胱癌5637细胞株内.结果 PCR扩增片段长度为1429 bp.Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切的片段经DNA测序显示Fibulin-5 cDNA插入正确.p-EG-FP-F5质粒重组体经BgⅢ单酶切出一约450 bp的条带.转染48 h后,pEGFP-Fibulin-5和pEGFP-N1转染成功的细胞均有不同程度的绿色荧光表达.结论 成功构建Fibulin-5绿色荧光蛋白真核表达载体并转染至人膀胱癌细胞内.     

人FHIT基因的克隆及其真核表达质粒的构建

目的克隆人脆性组氨酸三联体（FHIT）基因,构建其真核表达质粒pRcCMV-FHIT。方法提取人外周血总RNA,用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）技术扩增人FHITcDNA全长开放阅读框序列,PCR产物与中间载体pGEM-T连接后转化到大肠杆菌DH5α。然后对单菌落进行菌落PCR、限制性内切酶酶切鉴定和测序。用EcoRI将目的片段切下,插入真核表达载体pRc／CMV2的相应位点,构建表达质粒pRc／CMV2-FHIT,将该重组质粒转化到大肠杆菌DH5α后进行菌落PCR、酶切鉴定。结果测序结果表明从正常人外周血单个核细胞中所获得的FHITcDNA含有781个碱基,与Genbank（NM_002012．1）序列完全一致。pRc／CMV2-FHIT经酶切鉴定与预期结果一致。结论成功构建重组真核表达质粒pRcCMV-FHIT,为进一步研究脂质体转染FHIT基因对结肠癌细胞株SW480凋亡作用的影响奠定基础。     

可体内、外示踪的BMP2真核表达载体的构建和表达

目的 拟构建双顺反子增强型绿色荧光蛋白标记的人骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP2)真核表达载体,为其在真核细胞体内外示踪定位打下基础.方法 以重组质粒pcDNA3.1/CT-hBMP2为模板,结合已设计好的特异性引物,采用PCR方法获得BMP2片段,将其分别与克隆载体pTA2-T-easy和真核表达载体pSELECT-GFPzeo-MCS连接,转化入感受态DH5α细胞中,通过筛选得到含有绿色荧光蛋白的重组表达载体pSELECT-GFPzeo-hBMP2,并进行测序鉴定.将质粒转染CHO细胞后Western Blot检测BMP2蛋白表达,用RT-PCR检测BMP2mRNA表达.结果 琼脂糖电泳显示PCR产物为一条长约1216 bp的带,重组表达载体pSELECT-GFP zeo-hBMP2经双酶切可得到约1216 bp的片段,测序证实与Genebank中hBMP2序列完全相符,重组表达载体脂质体法转染CHO细胞48～72 h后荧光显微镜下证实转染成功,经RT-PCR证实CHO细胞中存在BMP2基因表达,采用免疫荧光化学方法证实载体中CHO细胞表达BMP2蛋白.经Western Blotting鉴定重组蛋白为分泌蛋白,相对分子质量在17×103左右.结论 成功构建可体内外示踪增强含双顺反子绿色荧光蛋白人BMP2真核表达载体.     

人VEGF-C基因荧光真核表达载体的构建和表达

目的:构建含有绿色荧光蛋白基因的人血管内皮生长因子C基因的真核表达载体,检测该基因在真核细胞中的表达,研究VEGF-C基因在淋巴管生成中的作用.方法:含有绿色荧光蛋白基因的质粒pEGFP-1通过末端平滑化,酶切获得5'(粘端)BamHI-EGFP-XbaI(平端)3'片断,已经构建的VEGF-C表达载体pcDNA3.1/VEGF-C通过末端平滑化,酶切获得5'-(粘端)BamHI-pcDNA3.1-目的基因-KpnI(平端)3',两片段连接构建含有绿色荧光蛋白的真核表达载体,琼脂糖凝胶电泳并测序检测插入片段的正确性.将该载体通过脂质体转染到真核细胞CHO中,观察绿色荧光蛋白在CHO细胞中的表达情况.通过G418筛选阳性转染细胞,提取总RNA,行RT-PCR,PCR产物琼脂糖凝胶电泳观察VEGF-C基因在CHO细胞中的表达情况.结果:琼脂糖凝胶电泳证实了插入EGFP片段的大小,测序结果证实了插入片段的正确性,CHO细胞中看到绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR产物中含有VEGF-C cDNA.结论:成功构建了含有绿色荧光蛋白基因的VEGF-C真核表达载体并检测到在真核细胞CHO中的表达.     

pVAX1-Ag85B的构建及其免疫原性的初步探索

目的构建以Ag85B基因为基础的DNA疫苗,并对其在小鼠体内的免疫原性进行初步分析。方法以pET28a-Ag85B基因组DNA为模板,PCR扩增获得Ag85B全长基因;将PCR产物构建成pUCm-Ag85B亚克隆;经限制性内切酶消化后克隆入pVAX1载体中构建真核表达质粒pVAX1-Ag85B,酶切、DNA测序鉴定。并将构建的DNA疫苗经肌肉免疫荷瘤小鼠,检测血清特异性抗体水平和脾淋巴细胞的增殖活性,并与BCG组、空白质粒组、生理盐水组相比较。结果经NheⅠ和HindⅢ双酶切、DNA测序鉴定后证实,Ag85B基因定向克隆入pVAX1载体,碱基无突变,序列完全正确。免疫荷瘤小鼠后,pVAX1-Ag85B组和BCG组均可提高淋巴细胞增殖活性,但效果不及卡介苗;pVAX1-Ag85B组的抗体滴度为1∶400,BCG免疫组的抗体滴度为1∶800。结论成功地构建了pVAX1-Ag85B质粒,为膀胱肿瘤的基因免疫治疗提供可靠的实验依据。免疫小鼠后,可提高小鼠免疫水平,但效果不及卡介苗。     

重组质粒pCR3.1-brZPC’的构建及其体内外表达

目的　构建重组质粒 pCR3 .1 brZPC’ ,检验其在细胞及动物体内的表达。　方法　应用反转录聚合酶链反应 (RT PCR)法克隆基因 ,与真核表达载体pCR3 .1相连 ,转化感受态菌后酶切鉴定重组质粒。脂质体法转染Hela细胞 ,RT PCR法检测重组质粒在细胞中mRNA水平的表达 ;免疫荧光法检测重组质粒在细胞中蛋白水平的表达。接种BALB/c小鼠 ,一周后提取其各组织的总RNA ,RT PCR检测重组质粒在被免疫动物体内mRNA水平的表达情况。　结果　重组质粒 pCR3 .1 brZPC’能在细胞和被免疫动物体内高效表达。被免疫动物可以产生相应的抗体 ,且与该重组蛋白在细胞外结合。　结论　重组质粒 pCR3 .1 brZPC’能在动物体内表达并激起相应的抗体反应     

靶向MUC1的siRNA表达载体的构建及鉴定

目的构建和鉴定针对黏蛋白1(MUC1)特异性的siRNA表达载体。方法人工合成一对互补并编码相应短发夹状MUC1-siRNA的寡核苷酸链,将其插入pGCsilencerTMU6/Neo/RNAi质粒载体中,用双酶切、阳性克隆聚合酶链反应(PCR)鉴定及DNA测序鉴定所构建的重组载体是否正确;以脂质体法将构建的重组载体导入人胆管癌细胞QBC939中,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)分别检测转染细胞中MUC1mRNA和蛋白的表达。结果双酶切、PCR鉴定及DNA测序证实MUC1-siRNA真核表达载体构建成功,转染该载体后的QBC939(干扰组)中MUC1mRNA及其蛋白质表达水平明显下调(P0.05)。结论成功构建的特异性siRNA表达载体,转染QBC939后可特异性地封闭MUC1的表达,为进一步研究MUC1-siRNA载体提供了实验基础。     

pVAX1-Ag85B质粒的构建及其免疫原性的可视化研究

构建以Ag85B基因为基础的DNA疫苗,并用活体红色荧光成像探讨其在动物体内免疫原性。方法：以pET28a—Ag85B基因组DNA为模板,用PCR扩增获得Ag85B全长基因;将PCR产物构建成pUCm—Ag85B亚克隆;经限制性内切酶消化后克隆人pVAX1载体中构建pVAX1-Ag85B,酶切、DNA测序鉴定。并将构建的DNA疫苗经肌肉免疫可视化膀胱癌移植瘤模型,通过活体红色荧光成像,从整体上直接、可视地观测Ag85B的免疫原性。结果：经NheI和HindⅢ双酶切、DNA测序鉴定后证实,Ag85B基因定向克隆人pVAX1载体,碱基无突变,序列完全正确。免疫小鼠后,pVAX1-Ag85B组和BCG组均可提高淋巴细胞增殖活性,但效果不及卡介苗。结论：成功地构建了pVAX1-Ag85B质粒,为膀胱肿瘤的基因免疫治疗提供可靠的实验方法。免疫小鼠后,可提高膀胱癌小鼠免疫水平,但效果不及卡介苗。     

人 Orail基因真核表达载体的构建及在足细胞中的表达

目的构建重组人 Orail基因真核表达载体,观察其在小鼠肾小球足细胞株（MPC5）中的表达。方法根据GenBank数据库检索到的人 Orail基因序列,人工合成法合成Orail基因编码区（coding sequence,CDS）全长序列,克隆至质粒表达载体PG-CMV-IRES-EGFP,构建重组质粒载体PC-CMV-Orail,通过PCR、双酶切及基因测序等方法进行鉴定;以脂质体转染法将重组质粒转染至MPC5细胞,应用荧光显微镜观察绿色荧光检测转染效率,RT-PCR、Western blot法分别检测Orail基因的转录与翻译。结果PCR扩增的片段长度为906bp,双酶切出现两条带,其中约906bp处可见目的条带。核酸测序结果与GenBank中所报道的人 Orail基因的CDS序列完全一致。转染后48h置荧光显微镜下观察,85％以上的足细胞中可见绿色荧光。RT-PCR及Western blot实验结果分别显示转染后的MPC5细胞在mRNA与蛋白水平表达Orail均有所增强。结论成功构建了重组人 Orail基因真核表达载体PG-CMV-Orail,并建立了过表达Orail基因的肾小球足细胞模型,为深入研究钙库操纵的Ca2’通道与足细胞病之间的关系奠定了良好的实验基础。     

反义MBD1基因片段真核表达载体的构建及鉴定

目的构建反义MBD1基因片段真核表达载体,为研究MBD1基因功能提供工具.方法根据MBD1基因cDNA序列中编码序列,设计PCR引物,在引物5＇端分别添加Xba Ⅰ和Kpn Ⅰ酶切位点,将PCR片段反向插入真核表达载体pcDNA3.1（＋）的多克隆位点上,构建反义MBD1基因片段真核表达载体,并用PCR、酶切法和DNA测序鉴定.结果PCR鉴定得到322 bp特异性条带,双酶切得到327 bp目的基因片段和5.4kb载体片段,DNA测序说明插入片段序列是正确的.结论采用基因克隆技术,成功构建了反义MBD1基因片段真核表达载体,为研究MBD1基因在DNA甲基化和肿瘤发生中的功能提供了实验工具.     

单核细胞趋化蛋白-1小分子干扰RNA真核表达质粒的构建及意义

目的构建单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）小分子干扰RNA（siRNA）表达载体，为进-步研究其对动脉粥样硬化（AS）的防治作用提供手段。方法设计并合成两端含有酶切位点两条DNA序列，经退火成互补双链，再克隆至载体pSilencer2．0-U6中构建重组表达载体，转化DH-5α菌株，提取质粒行双酶切鉴定，并进行序列测定。结果双酶切证实MCP-1siRNA表达载体克隆构建成功，插入片段测序结果与合成的siRNA结果-致。结论成功构建MCP—siRNA表达载体，为动脉粥样硬化的防治奠定实验基础。     

靶向人SIRT1基因的shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建针对人SIRT1基因的shRNA真核表达质粒,并筛选出对胰腺癌细胞系PANC-1基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体。方法针对SIRT1基因的mRNA序列设计,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经大肠杆菌扩增,酶切,PCR,测序鉴定,转染胰腺癌PANC-1细胞,实时荧光定量PCR和Western blot检测SIRT1 mRNA和蛋白的被抑制情况。结果经测序证实,成功构建SIRT1-shRNA真核表达质粒,插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致。重组质粒转染PANC-1细胞后,SIRT1 mRNA和蛋白水平明显下调;其中以1号重组质粒效应最强。结论成功构建了携带以SIRT1为靶向的shRNA的重组质粒。其对胰腺癌PANC-1细胞SIRT1的表达具有显著抑制效应。该实验为进一步研究SIRT1的功能和肿瘤的基因治疗提供了实验基础。     

Stat3靶向RNA干扰重组体的构建及鉴定

目的设计针对Stat3的发夹样RNA干扰重组体,通过脂质体转染结肠癌细胞HCT116观察其干扰效果,为探索肿瘤基因治疗的新途径奠定基础。方法设计针对Stat3编码区的有短发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,克隆到载体Pavu6 27中构建重组体Pavu6 27-Stat3,再对重组质粒进行酶切鉴定、DNA测序分析。脂质体法转染重组体至大肠癌HCT116细胞株中,以空质粒(Pavu6 27)转染为对照;RT-PCR法观察Stat3基因表达改变。结果酶切鉴定和测序分析均提示Stat3靶向RNA干扰重组体的构建成功,Pavu6 27-Stat3转染后HCT116细胞Stat3基因表达较空载体Pavu6 27转染的对照组显著下降。结论Stat3靶向RNA干扰重组体成功构建,并能有效抑制HCT116细胞中Stat3基因表达。本实验为下一步利用RNAi技术沉默肿瘤细胞中Stat3基因的表达,诱导肿瘤细胞凋亡或抑制其增生,为探索肿瘤基因治疗的新途径打下基础。     

HBx基因大鼠卵圆细胞株的建立及鉴定

目的 构建带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达质粒pEGF-HBx,建市稳定、高效表达乙型肝炎病毒x基因(HBx)的大鼠卵圆细胞株,以便进一步研究HBx基因和卵圆细胞在肝癌发牛过程中的作用和机制.方法 用PCR方法从质粒pcDNA3.1-HBx中扩增含Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点的HBx基因序列.对增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-NI)及扩增的HBx目的 基因片段进行双酶切,纯化后用连接酶连接得到重组体pEGFP-HBx,将其转化大肠杆菌DHSα,抗生素筛选培养得到阳性克降,提取质粒后用双酶切和基因测序进行鉴定.通过脂质体介导将质粒pEGFP-HBx转染到大鼠卵圆细胞株(LE/6)中,经G418筛选,尤限传代后得到稳定表达EGFP-HBx融合蛋白的细胞株.分别采用RT-PCR和免疫细胞化学技术检测细胞株中HBx基凶的表达情况.结果 双酶切及基因测序结果均显示构建的pEGFP-HBx质粒中含有完整的HBx基因片段.将得到的抗性细胞株培养传代20次后仍表达强的荧光;RT-PCR及免疫细胞化学检测均发现HBx基因在抗性细胞(LE/6)中得到了稳定转录和翻译.结论 已成功构建带HBx基因的真核表达质粒pEGFP-HBx,获得了稳定、高效表达EGFP-HBx融合蛋白的大鼠卵圆细胞株,为进一步研究HBx基凶和卵圆细胞在肝癌发生过程中的作用和机制奠定了实验基础.     

重组质粒pEGFP-N2-GPC3的构建及GPC3对生长因子FGF2、IGF2促进细胞增殖的影响

目的 构建GPC3基因真核表达重组质粒,观察GPC3对生长因子FGF2、IGF2促进肝癌细胞增殖的影响.方法 自行设计引物从GPC3原核扩增重组质粒pDNR-LIB.GPC3中获得编码GPC3的基因片段.应用基因重组技术,将GPC3基因片段克隆到真核表达载体pEGFP-N2中,然后经脂质体介导转染SK-Hep-1,并通过C418(600 mg/L)筛选出抗性克隆,应用荧光显微镜及逆转录-聚合酶链反应(RT-PER)法对转染细胞内pEGFP-GPC3的表达进行鉴定,采用噻唑蓝(MTT)比色法研究GPC3对生长因子FGF2、IGF2促细胞增殖效应的影响.结果 限制性内切酶酶切分析、重组质粒测序鉴定表明为正确重组子,荧光显微镜下可见转染的SK-Hep-1胞膜区发出强绿色荧光,RT-PCR表明GPC3在SK-Hep-1中成功表达,生长因子实验中,GPC3明显抑制FGF2促细胞增殖效应,与空质粒转染组比较差异有统计学意义(P<0.05),IGF2实验组与空质粒转染组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 测序表明,编码的氨基酸序列与人GPC3完全一致;构建完成真核表达重组质粒pEGFP-N2-GPC3;GPC3基因在SK-Hep-1中成功表达;GPC3在FGF2信号通路中可能发挥负性调控因子的作用.