结核分枝杆菌热休克蛋白HtpG基因的原核表达与鉴定

目的 克隆并表达结核分枝杆菌 ＨｔｐＧ 分子，并鉴定其免疫反应性。 方法 采用聚合酶链式反 应扩增结核分枝杆菌 Ｈ３７Ｒａ ＨｔｐＧ 基因，并克隆至 ｐＥＴ２２ｂ 质粒，测序筛选到重组成功的质粒。 重组质粒 ｐＥＴ２２ｂ － ＨｔｐＧ 转化大肠埃希菌 ＢＬ２１（ＤＥ３），表达的 ＨｔｐＧ 重组蛋白通过镍柱纯化。 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 鉴定表达 蛋白，并使用 ＨｔｐＧ 重组蛋白经 ＥＬＩＳＡ 法检测肺结核患者血清特异性抗体水平。 结果 成功构建了 ｐＥＴ２２ｂ － ＨｔｐＧ 重组质粒； 在大肠埃希菌中表达出分子质量约 ７３ｋＤａ 的重组蛋白。 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 鉴定该重组蛋白具 有良好免疫反应性，ＥＬＩＳＡ 法检测肺结核患者血清中存在特异性抗 ＨｔｐＧ 抗体。 结论 在大肠埃希菌内成功 表达 ＨｔｐＧ 重组蛋白，为将该蛋白用于结核免疫诊断试剂的研制奠定了基础。     

人源性乙型肝炎表面抗体Fab段的表达及纯化的研究

通过噬菌体显示技术 ,获得人源性抗 ＨＢｓＦａｂ片段基因 ,重组至大肠杆菌中分泌表达该抗体的可溶Ｆａｂ片段 ,并对此Ｆａｂ片段进行纯化和研究。构建成噬菌体显示文库 ,经ＨＢｓＡｇ特异性淘筛获得Ｆａｂ片段基因。在大肠杆菌中进行分泌表达 ,经ＦＰＬＣ纯化 ,用ＳＤＳ ＰＡＧＥ及蛋白印迹法分析、鉴定 ,并用固相放射免疫法检测其活性单位。再用表达的前Ｓ ,前Ｓ1,前Ｓ2蛋白检测其结合的抗原位点。结果获得了抗体Ｆａｂ段的基因及表达该片段的工程菌。经ＦＰＬＣ纯化的抗体Ｆａｂ片段呈单一峰 ,与抗 ＨＢｓ阳性血清相似。纯化后的抗体Ｆａ…     

结核分枝杆菌14000抗原基因的克隆、表达纯化及抗原性分析

目的对结核分枝杆菌14 000抗原基因进行克隆表达及纯化,并评价其抗原性。方法以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,用PCR方法获得目的基因构建大肠杆菌高效表达株;亲和层析柱纯化重组蛋白;进SDS-PAGE电泳鉴定;通用ELISA法进行重组蛋白的抗原性检测分析。结果获得了结核分枝杆菌抗原14 kD基因,在大肠杆菌BL21中高效表达,Western印迹结果证实该重组蛋白能与抗结核分枝杆菌多克隆抗体发生特异免疫结合反应。ELISA分析中,该纯化的重组抗原敏感性、特异性和准确性分别为:52.5%、96.7%和67.2%,具有良好的抗原性和较高的特异性。结论14 kD重组蛋白抗原具备良好的抗原性与特异性,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及抗原、抗体的大规模制备打下基础。     

HBsAg及B_(7-2)抗原重组腺病毒载体感染免疫研究

目的　为激发机体对ＨＢｓＡｇ的ＣＴＬ反应，寻求对慢性乙型肝炎更有效的治疗方法。方法　构建了共表达ＨＢＳＡｇ及Ｂ７－２抗原的Ｅ１区插入重组腺病毒载体，用脂质体法转染２９３细胞，经空斑筛选表达目的抗原的重组腺病毒，用ＥＬＩＳＡ法及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法分别检测ＨＢｓＡｇ及Ｂ７－２抗原表达。在２９３细胞中扩增，再纯化、浓缩后，体内感染Ｃ５７小鼠，检测体液免疫反应和细胞免疫反应。结果　重组腺病毒在体外培养的２９３细胞及ＨｅｐＧ２细胞中高效表达ＨＢＳＡｇ及Ｂ７－２抗原。感染小鼠体液免疫较弱，但可通过注射乙型肝炎疫苗而加强；重组腺病毒载体能诱导强而有效的细胞免疫反应；未观察到明显毒副作用。结论　ＨＢｓＡｇ及Ｂ７－２抗原重组腺病毒载体体外感染２９３、ＨｅｐＧ２细胞后高效表达目的抗原，感染免疫局诱导有效的细胞免疫反应。初步结果显示腺病毒载体是一种高效、安全的载体系统。     

丙型肝炎病毒C区部分基因的克隆表达及抗原性

目的 研究丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ）不同长度Ｃ蛋白片段在大肠杆菌中的表达和纯化及其抗原性。方法 应用核酸及蛋白分析软件对Ｃ蛋白的抗原决定簇预测分析,以ＰＣＲ方法扩增３段长度分别为２０１ｂｐ,４０２ｂｐ及５９１ｂ;ｐ的Ｃ基因片段,通过基因体外重组技术克隆到ｐＧＥＸ－３Ｘ表达质粒中,用所获重组蛋白免疫ＢＡＬＢ／Ｃ鼠并应用ＥＬＩＳＡ法对银川市动物系列稀释血清进行抗体测定和     

乙型肝炎病毒X基因的表达产物对HLA-DR表达的效应

为了解ＨＢＶＸ基因表达产物对ＨＬＡ ＤＲ表达的效应 ,构建带Ｘ基因的重组表达载体 ,研究其在体外肝癌细胞中的表达及其对ＨＬＡ ＤＲ表达的影响。用野生型ＨＢＶＸ基因与真核载体质粒构建重组表达载体质粒 ｐＷＨＸⅡ转染ＨｅｐＧ2细胞。用ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈ ｅｒｎ印迹、ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹等分析鉴定目的基因ＤＮＡ片段与其在转染细胞中的表达产物ＨＢＶＸ蛋白。将带重组质粒 ｐＷＨＸⅡ的ＨｅｐＧ2细胞和带有ＨＢＶ全基因组的 2 .2 .15细胞 ,在相同条件下用间接免疫荧光分析和免疫酶细胞化学技术检测 ,均清晰地显示在肝细…     

汉滩病毒S基因全长和截短片段在大肠杆菌中表达及其初步应用

目的体外克隆表达汉滩病毒全长及部分核蛋白编码基因,筛选病毒核蛋白在人体体液应答中的主要抗原决定簇区,以期获得高质量核蛋白抗原,为研制新型肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）基因工程诊断试剂奠定基础。方法利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和限制性内切酶酶切的方法分离汉滩病毒７６－１１８Ｓ基因全长及部分氨基端编码基因（Ｓ、ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ和ＳＤ）,分别将各编码基因克隆入Ｔ７原核表达载体,在大肠杆菌中表达;免疫印迹试验（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓ）分析重组抗原活性。结果完整和截短核蛋白皆得到有效表达,相对分子质量分别为５００００（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＳｐｒｏｔｅｉｎ,ｒＳ）、４５００（ｒＳＡ）、２２０００（ｒＳＢ）、２５０００（ｒＳＣ）和２７０００（ｒＳＤ）,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析表明截短核蛋白（ｒＳＢ、ｒＳＣ和ｒＳＤ）具有较好的抗原活性;粗提抗原Ｄｏｔｂｌｏｔ方法检测ＨＦＲＳ患者血清结果与ＩＦＡ法一致;重组小片段抗原与抗汉滩病毒单克隆抗体５Ｈ５及Ｈ７可发生特异性反应。结论汉滩病毒核蛋白的氨基端含有一主要抗原决定簇区;原核表达的截短核蛋白在ＨＦＲＳ的血清学诊断中具有一定的价值。     

丙型肝炎病毒E1，E2/NS1，NS5蛋白基因在大肠杆菌内的表达及其产物的初步应用

目的在体外表达及纯化ＨＣＶ不同功能区的病毒蛋白，用于研究ＨＣＶ各功能区抗体的临床意义。方法将ＨＣＶＥ１，Ｅ２／ＮＳ１，ＮＳ５区的部分基因片段克隆到表达质粒ＰＭＡＬ－ＣＲＩ中ＭＢＰ编码基因的下游，在大肠杆菌中进行表达。结果表达的融合蛋白ＭＢＰ－Ｅ１，ＭＢＰ－Ｅ２／ＮＳ１，ＭＢＰ－ＮＳ５的分子量分别为５７０００、６５０００、６２０００，ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析表明这些融合蛋白具有ＨＣＶ的抗原活性。将这三种融合蛋白纯化后作为抗原检测了丙型肝炎患者血清９５份，其中抗－ＨＣＶＥ１阳性率为１０．５％，抗－ＨＣＶＥ２／ＮＳ１为６３．２％，抗－ＨＣＶＮＳ５为５３．７％。结论本实验表达的ＨＣＶ融合蛋白在ＨＣＶ感染的血清学诊断中具有一定的价值。     

日本血吸虫（中国大陆株）FABPc重组抗原高效融合表达,纯化及 …

目的 构建Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ表达克隆,获得大量纯化ｒＳｊ－ＦＡＢＰｃ重组（日本血吸虫脂肪酸结合蛋白）抗原,了解其作为侯选疫苗抗原的潜能。方法 以ＰＣＲ法从Ｓｊ－ｃＤＮＡ库中扩增出目的基因片段后亚克隆入表达载体ｐＧＥＸ－６Ｐ－１进行融合表达,经Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＾ＴＭ ４Ｂ亲和层析柱和ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ＾ＴＭ Ｐｒｏｔｅａｓｅ酶切后纯化出ｒＳｊ－ＦＡＢＰｃ,Ｗｅｓｔｅｒｎ     

抗HBV Pre S2单链噬菌体抗体基因在噬菌体载体中的克隆及初步表达

目的 利用基因重组技术构建ＨＢＶ前Ｓ２单链抗体基因并使其在大肠杆菌中永生化和表达活性的抗ＨＢＶ前Ｓ２单链抗体（ＳｃＦｖ），方法和结果 利用基因重组技术，在构建抗ＨＢＶ前Ｓ２３Ｂ９ＳｃＦｖ基因的基础上，在此基因中引入限制性同切酶位点，克隆到噬菌体表达载体－ｐＣＡＮＴＡＢ５噬菌粒中，经亲和筛选得到２株阳性重组克隆，诱导表达产物在特异性阻断ＥＬＩＳＡ实验中具有一定阻断亲本３Ｂ９单抗与ＨＢＶ前Ｓ２抗原的结     

乙型肝炎病毒x蛋白对肝细胞FasL表达的激活作用

目的探讨ＨＢｘ蛋白对肝细胞Ｆａｓ配基（ＦａｓＬ）表达的调控作用。方法构建ＨＢｘ基因的真核表达载体ｐＣＥＰ４ｘ,电击法转染ＨｅｐＧ２细胞,潮霉素筛选阳性克隆细胞ＨｅＰＧ２Ｘ。用免疫细胞化学染色和免疫蛋白印迹法检测转染ＨＢｘ基因的ＨｅｎＧ２ｘ细胞ＦａｓＬ蛋白的表达。结果逆转录ＰＣＲ祛分析表明,ＨＢｘ基因在转染细胞内可有效转录;ＨｅｐＧ２ｘ细胞出现新的ＦａｓＬ蛋白表达。结论乙肝病毒ｘ蛋白可激活肝细胞表达ＦａｓＬ。     

乙肝病毒PreS2基因在大肠埃希菌中的表达

目的在大肠埃希菌(Escherichiacoli)中表达乙肝病毒前S2(HBVPreS2)蛋白,并对其进行鉴定和纯化。方法利用DNA重组技术,将全长的HBVPreS2基因克隆至pMAL-C2x[融合表达载体含麦芽糖结合蛋白(maltosebindingprotein,MBP)标签蛋白]质粒中,构建pMAL-C2/S2表达载体,转化至E.coli,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形式,依据其不同的表达形式采取适当的纯化方案,纯化产物经Westernblot和ELISA法检测反应原性,经Xa因子切割去除MBP标签蛋白。结果成功构建了表达载体pMAL-C2/S2,目的蛋白为PreS2-MBP,以包涵体和可溶性2种形式表达。纯化产物能与anti-HepatitisBvirusPreS2Antigen发生特异性反应。融合蛋白经Xa因子切割去除了MBP标签蛋白。结论在E.coli中成功表达了HBVPreS2蛋白,为进一步研制新型HBV预防及免疫治疗制剂打下了基础。     

Identification of hepatitis B virus aetiologic antigens,HBx and Pre‐S2, in diffuse large B‐cell lymphoma

Diffuse large B‐cell lymphoma (DLBCL) has been reported to have a significant association with the hepatitis B virus (HBV) infection. However, there has been no experimental evidence to determine whether the components of the hepatitis B virus are expressed in lymphoid cells. In this study, we used immunohistochemical methods to explore whether the antigens of hepatitis B virus are expressed in DLBCL lymphoma cells in HBsAg‐positive DLBCL patients (HBsAg + DLBCL). HBx antigen was detected in 48.9% of HBsAg + DLBCL patients, and the expression rate of the Pre‐S2 antigen was 57.2%. HBx expression was significantly associated with high‐level expression of c‐Myc, while the Pre‐S2 antigen was not. In this study, we demonstrated that HBx antigen and Pre‐S2 antigen could be detected in lymphoma cells, and HBx expression was related to c‐Myc expression. Our findings provide a strong basis for further study of the HBV‐infected DLBCL and molecular mechanism underlying the lymphomagenesis.     

DNA immunization with fusion genes encoding different regions of hepatitis C virus E2 fused to the gene for hepatitis B surface antigen elicits immune responses to both HCV and HBV

AIM：Both Hepatitis B virus(HBV)and Hepatitis C virus (HCV) are major causative agents of transfusion-associated and community-acquired hepatitis wordwide.Development of a HCV vaccine as well as more effective HBV vaccines is and urgent task.DNA immunization provides a promising approach to elicit protective humoral and cellular immune responses against viral infection.The aim of this study is to achieve immune responses against both HCV and HBV by DNA immunization with fusion constructs comprising various HCV E2 gene fragments fused to HBsAg gene of HBV.METHODS:C57BL/6 mice were immunized with plasmid DNA expressing five fragmets of HCV E2 fused to the gene for HBaAg respectively.After one primary and one boosting immunizatios,antibodies against HCV E2 and HBsAg weretested and subtyped in ELISA.Splenic cytokine expression of IFN-γ and IL-10 was analyzed using an RT-PCR assay Post-immune mouse antisera also were tested for their ability to capture HCV viruses in the serum of a hepatitis C patient in vitro.RESULTS:After immunization,antibodies against both HBsAg and HCV E2 were detected in mouse sera,with Ig2a being the dominant immunoglobulin sub-class.Highlevel expression of INF-γwas detected in cultured splenic cells Mouse antisera against three of the five nfusion constructs were able to capture HCV viruses in an in vitro assay.CONCLUSION:The results indicate that these fusion constructs could efficiently elicit humoral and Th1 dominant cellular immune responses against both HBV S and HCV E2 antigens in DNA-immunized mice.They thus could serve as candidates for a bivalent vaccine against HBV and HCV infection.In addition,the capacity of mouse antisera against three of the five fusion constructs to capture HCV viruses in vitro suggested that neutralizing epitopes may be present in other regions of E2 besides the hypervariable region1.     

甲胎蛋白启动子介导反义乙型肝炎病毒X基因在肝癌细胞中的表达及其作用

目的 构建含甲胎蛋白(AFP)启动子和增强子的反义乙型肝炎病毒X基因(HBX)真核表达载体，研究其特异性和有效性，为开发肝癌细胞特异性HBX反义RNA基因治疗乙型肝炎病毒(HBV)奠定基础。方法 聚合酶链反应(PCR)扩增HBX(1370—1872nt)基因，克隆至EB病毒表达载体，双轮PCR筛选、鉴定基因插入方向。脂质体转染肝癌细胞和ECV304细胞，Northernblot检测HBX mRNA的表达，酶联免疫试验(ELISA)检测HBV抗原，荧光定量PCR检测HBV DNA。结果 成功构建正、反义RNA表达载体pEBAF—s—HBX、pEBAF—as—HBX。Northernblot证实反义RNA仅在AFP阳性的肝癌细胞中表达。pEBAF—as—HBX转染3d后，可显著抑制2．2．15细胞HBV复制和抗原表达，其HBsAg、HBeAg抗原表达较正义对照分别下降37．9％和36．8％，HBV DNA降低25％。结论 反义RNA表达载体pEBAF—as—HBX仅在肝癌细胞中特异表达、并可有效抑制HBV，有良好的开发应用前景。     

Fusion expression of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein in E.coli

AIM: To produce a recombinant protein rMBP-NAP, which was fusionally expressed by Helicobacter pylori (H pylori) neutrophil-activating protein (NAP) and E. coli maltose binding protein (MBP) and to evaluate its immunoreactivity and immunogenicity. METHODS: Neutrophil-activating protein gene of H pylori (HP-napA) was subcloned from the recombinant plasmid pNEB-napA, and fused to MalE gene of expressing vector pMAL-c2x. The recombinant plasmid pMAL-c2x-napA was confirmed by restriction enzyme digestion, and then transformed into E. coli TB1. Fusion protein rMBP-NAP was induced by IPTG and identified by SDS-PAGE analysis. Soluble rMBP-NAP was purified by amylose affinity chromatography. Immunoreactivity and immunogenicity of the fusion protein were evaluated by animal experiment, Western blotting with human H pylori anti-sera. RESULTS: E.coli TB1 carrying recombinant plasmid pMAL-c2x-napA was constructed and led to a high efficiency cytosol expression of fusion protein rBMP -NAP when induced by IPTG. The molecular weight of rBMP-NAP was about 57 kD, accounting for 37.55% of the total protein in the sonicated supematant of E. coli TB1 (pMAL-c2x-napA). The purity of the fusion protein after one-step affinity chromatography was 94% and the yield was 100 mg per liter of bacterial culture. The purified fusion protein could be specifically recognized by both human anti-sera from clinical patients with H pylori infection and rabbit sera immunized by rMBP-NAP itself. CONCLUSION: Recombinant protein rMBP-NAP might be a novel antigen for vaccine development against H pylori.