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相似文献
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1.
目的 克隆并表达结核分枝杆菌 HtpG 分子,并鉴定其免疫反应性。 方法 采用聚合酶链式反 应扩增结核分枝杆菌 H37Ra HtpG 基因,并克隆至 pET22b 质粒,测序筛选到重组成功的质粒。 重组质粒 pET22b - HtpG 转化大肠埃希菌 BL21(DE3),表达的 HtpG 重组蛋白通过镍柱纯化。 Western blot 鉴定表达 蛋白,并使用 HtpG 重组蛋白经 ELISA 法检测肺结核患者血清特异性抗体水平。 结果 成功构建了 pET22b - HtpG 重组质粒; 在大肠埃希菌中表达出分子质量约 73kDa 的重组蛋白。 Western blot 鉴定该重组蛋白具 有良好免疫反应性,ELISA 法检测肺结核患者血清中存在特异性抗 HtpG 抗体。 结论 在大肠埃希菌内成功 表达 HtpG 重组蛋白,为将该蛋白用于结核免疫诊断试剂的研制奠定了基础。  相似文献   

2.
通过噬菌体显示技术 ,获得人源性抗 HBsFab片段基因 ,重组至大肠杆菌中分泌表达该抗体的可溶Fab片段 ,并对此Fab片段进行纯化和研究。构建成噬菌体显示文库 ,经HBsAg特异性淘筛获得Fab片段基因。在大肠杆菌中进行分泌表达 ,经FPLC纯化 ,用SDS PAGE及蛋白印迹法分析、鉴定 ,并用固相放射免疫法检测其活性单位。再用表达的前S ,前S1,前S2蛋白检测其结合的抗原位点。结果获得了抗体Fab段的基因及表达该片段的工程菌。经FPLC纯化的抗体Fab片段呈单一峰 ,与抗 HBs阳性血清相似。纯化后的抗体Fa…  相似文献   

3.
目的对结核分枝杆菌14 000抗原基因进行克隆表达及纯化,并评价其抗原性。方法以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,用PCR方法获得目的基因构建大肠杆菌高效表达株;亲和层析柱纯化重组蛋白;进SDS-PAGE电泳鉴定;通用ELISA法进行重组蛋白的抗原性检测分析。结果获得了结核分枝杆菌抗原14 kD基因,在大肠杆菌BL21中高效表达,Western印迹结果证实该重组蛋白能与抗结核分枝杆菌多克隆抗体发生特异免疫结合反应。ELISA分析中,该纯化的重组抗原敏感性、特异性和准确性分别为:52.5%、96.7%和67.2%,具有良好的抗原性和较高的特异性。结论14 kD重组蛋白抗原具备良好的抗原性与特异性,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及抗原、抗体的大规模制备打下基础。  相似文献   

4.
HBsAg及B_(7-2)抗原重组腺病毒载体感染免疫研究   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的 为激发机体对HBsAg的CTL反应,寻求对慢性乙型肝炎更有效的治疗方法。方法 构建了共表达HBSAg及B7-2抗原的E1区插入重组腺病毒载体,用脂质体法转染293细胞,经空斑筛选表达目的抗原的重组腺病毒,用ELISA法及Western blotting法分别检测HBsAg及B7-2抗原表达。在293细胞中扩增,再纯化、浓缩后,体内感染C57小鼠,检测体液免疫反应和细胞免疫反应。结果 重组腺病毒在体外培养的293细胞及HepG2细胞中高效表达HBSAg及B7-2抗原。感染小鼠体液免疫较弱,但可通过注射乙型肝炎疫苗而加强;重组腺病毒载体能诱导强而有效的细胞免疫反应;未观察到明显毒副作用。结论 HBsAg及B7-2抗原重组腺病毒载体体外感染293、HepG2细胞后高效表达目的抗原,感染免疫局诱导有效的细胞免疫反应。初步结果显示腺病毒载体是一种高效、安全的载体系统。  相似文献   

5.
丙型肝炎病毒C区部分基因的克隆表达及抗原性   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的 研究丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)不同长度C蛋白片段在大肠杆菌中的表达和纯化及其抗原性。方法 应用核酸及蛋白分析软件对C蛋白的抗原决定簇预测分析,以PCR方法扩增3段长度分别为201bp,402bp及591b;p的C基因片段,通过基因体外重组技术克隆到pGEX-3X表达质粒中,用所获重组蛋白免疫BALB/C鼠并应用ELISA法对银川市动物系列稀释血清进行抗体测定和  相似文献   

6.
为了解HBVX基因表达产物对HLA DR表达的效应 ,构建带X基因的重组表达载体 ,研究其在体外肝癌细胞中的表达及其对HLA DR表达的影响。用野生型HBVX基因与真核载体质粒构建重组表达载体质粒 pWHXⅡ转染HepG2细胞。用PCR、South ern印迹、ELISA及Western印迹等分析鉴定目的基因DNA片段与其在转染细胞中的表达产物HBVX蛋白。将带重组质粒 pWHXⅡ的HepG2细胞和带有HBV全基因组的 2 .2 .15细胞 ,在相同条件下用间接免疫荧光分析和免疫酶细胞化学技术检测 ,均清晰地显示在肝细…  相似文献   

7.
目的体外克隆表达汉滩病毒全长及部分核蛋白编码基因,筛选病毒核蛋白在人体体液应答中的主要抗原决定簇区,以期获得高质量核蛋白抗原,为研制新型肾综合征出血热(HFRS)基因工程诊断试剂奠定基础。方法利用聚合酶链反应(PCR)和限制性内切酶酶切的方法分离汉滩病毒76-118S基因全长及部分氨基端编码基因(S、SA、SB、SC和SD),分别将各编码基因克隆入T7原核表达载体,在大肠杆菌中表达;免疫印迹试验(Westernblotanalysis)分析重组抗原活性。结果完整和截短核蛋白皆得到有效表达,相对分子质量分别为50000(recombinantSprotein,rS)、4500(rSA)、22000(rSB)、25000(rSC)和27000(rSD),Westernblot分析表明截短核蛋白(rSB、rSC和rSD)具有较好的抗原活性;粗提抗原Dotblot方法检测HFRS患者血清结果与IFA法一致;重组小片段抗原与抗汉滩病毒单克隆抗体5H5及H7可发生特异性反应。结论汉滩病毒核蛋白的氨基端含有一主要抗原决定簇区;原核表达的截短核蛋白在HFRS的血清学诊断中具有一定的价值。  相似文献   

8.
目的在体外表达及纯化HCV不同功能区的病毒蛋白,用于研究HCV各功能区抗体的临床意义。方法将HCVE1,E2/NS1,NS5区的部分基因片段克隆到表达质粒PMAL-CRI中MBP编码基因的下游,在大肠杆菌中进行表达。结果表达的融合蛋白MBP-E1,MBP-E2/NS1,MBP-NS5的分子量分别为57000、65000、62000,WesternBlot分析表明这些融合蛋白具有HCV的抗原活性。将这三种融合蛋白纯化后作为抗原检测了丙型肝炎患者血清95份,其中抗-HCVE1阳性率为10.5%,抗-HCVE2/NS1为63.2%,抗-HCVNS5为53.7%。结论本实验表达的HCV融合蛋白在HCV感染的血清学诊断中具有一定的价值。  相似文献   

9.
目的 构建Sj-FABPc表达克隆,获得大量纯化rSj-FABPc重组(日本血吸虫脂肪酸结合蛋白)抗原,了解其作为侯选疫苗抗原的潜能。方法 以PCR法从Sj-cDNA库中扩增出目的基因片段后亚克隆入表达载体pGEX-6P-1进行融合表达,经Glutathione Sepharose ^TM 4B亲和层析柱和PreScission^TM Protease酶切后纯化出rSj-FABPc,Western  相似文献   

10.
目的 利用基因重组技术构建HBV前S2单链抗体基因并使其在大肠杆菌中永生化和表达活性的抗HBV前S2单链抗体(ScFv),方法和结果 利用基因重组技术,在构建抗HBV前S23B9ScFv基因的基础上,在此基因中引入限制性同切酶位点,克隆到噬菌体表达载体-pCANTAB5噬菌粒中,经亲和筛选得到2株阳性重组克隆,诱导表达产物在特异性阻断ELISA实验中具有一定阻断亲本3B9单抗与HBV前S2抗原的结  相似文献   

11.
乙型肝炎病毒x蛋白对肝细胞FasL表达的激活作用   总被引:5,自引:1,他引:4  
目的探讨HBx蛋白对肝细胞Fas配基(FasL)表达的调控作用。方法构建HBx基因的真核表达载体pCEP4x,电击法转染HepG2细胞,潮霉素筛选阳性克隆细胞HePG2X。用免疫细胞化学染色和免疫蛋白印迹法检测转染HBx基因的HenG2x细胞FasL蛋白的表达。结果逆转录PCR祛分析表明,HBx基因在转染细胞内可有效转录;HepG2x细胞出现新的FasL蛋白表达。结论乙肝病毒x蛋白可激活肝细胞表达FasL。  相似文献   

12.
目的在大肠埃希菌(Escherichiacoli)中表达乙肝病毒前S2(HBVPreS2)蛋白,并对其进行鉴定和纯化。方法利用DNA重组技术,将全长的HBVPreS2基因克隆至pMAL-C2x[融合表达载体含麦芽糖结合蛋白(maltosebindingprotein,MBP)标签蛋白]质粒中,构建pMAL-C2/S2表达载体,转化至E.coli,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析目的蛋白的表达形式,依据其不同的表达形式采取适当的纯化方案,纯化产物经Westernblot和ELISA法检测反应原性,经Xa因子切割去除MBP标签蛋白。结果成功构建了表达载体pMAL-C2/S2,目的蛋白为PreS2-MBP,以包涵体和可溶性2种形式表达。纯化产物能与anti-HepatitisBvirusPreS2Antigen发生特异性反应。融合蛋白经Xa因子切割去除了MBP标签蛋白。结论在E.coli中成功表达了HBVPreS2蛋白,为进一步研制新型HBV预防及免疫治疗制剂打下了基础。  相似文献   

13.
Diffuse large B‐cell lymphoma (DLBCL) has been reported to have a significant association with the hepatitis B virus (HBV) infection. However, there has been no experimental evidence to determine whether the components of the hepatitis B virus are expressed in lymphoid cells. In this study, we used immunohistochemical methods to explore whether the antigens of hepatitis B virus are expressed in DLBCL lymphoma cells in HBsAg‐positive DLBCL patients (HBsAg + DLBCL). HBx antigen was detected in 48.9% of HBsAg + DLBCL patients, and the expression rate of the Pre‐S2 antigen was 57.2%. HBx expression was significantly associated with high‐level expression of c‐Myc, while the Pre‐S2 antigen was not. In this study, we demonstrated that HBx antigen and Pre‐S2 antigen could be detected in lymphoma cells, and HBx expression was related to c‐Myc expression. Our findings provide a strong basis for further study of the HBV‐infected DLBCL and molecular mechanism underlying the lymphomagenesis.  相似文献   

14.
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AIM:Both Hepatitis B virus(HBV)and Hepatitis C virus (HCV) are major causative agents of transfusion-associated and community-acquired hepatitis wordwide.Development of a HCV vaccine as well as more effective HBV vaccines is and urgent task.DNA immunization provides a promising approach to elicit protective humoral and cellular immune responses against viral infection.The aim of this study is to achieve immune responses against both HCV and HBV by DNA immunization with fusion constructs comprising various HCV E2 gene fragments fused to HBsAg gene of HBV.METHODS:C57BL/6 mice were immunized with plasmid DNA expressing five fragmets of HCV E2 fused to the gene for HBaAg respectively.After one primary and one boosting immunizatios,antibodies against HCV E2 and HBsAg weretested and subtyped in ELISA.Splenic cytokine expression of IFN-γ and IL-10 was analyzed using an RT-PCR assay Post-immune mouse antisera also were tested for their ability to capture HCV viruses in the serum of a hepatitis C patient in vitro.RESULTS:After immunization,antibodies against both HBsAg and HCV E2 were detected in mouse sera,with Ig2a being the dominant immunoglobulin sub-class.Highlevel expression of INF-γwas detected in cultured splenic cells Mouse antisera against three of the five nfusion constructs were able to capture HCV viruses in an in vitro assay.CONCLUSION:The results indicate that these fusion constructs could efficiently elicit humoral and Th1 dominant cellular immune responses against both HBV S and HCV E2 antigens in DNA-immunized mice.They thus could serve as candidates for a bivalent vaccine against HBV and HCV infection.In addition,the capacity of mouse antisera against three of the five fusion constructs to capture HCV viruses in vitro suggested that neutralizing epitopes may be present in other regions of E2 besides the hypervariable region1.  相似文献   

16.
目的 构建含甲胎蛋白(AFP)启动子和增强子的反义乙型肝炎病毒X基因(HBX)真核表达载体,研究其特异性和有效性,为开发肝癌细胞特异性HBX反义RNA基因治疗乙型肝炎病毒(HBV)奠定基础。方法 聚合酶链反应(PCR)扩增HBX(1370—1872nt)基因,克隆至EB病毒表达载体,双轮PCR筛选、鉴定基因插入方向。脂质体转染肝癌细胞和ECV304细胞,Northernblot检测HBX mRNA的表达,酶联免疫试验(ELISA)检测HBV抗原,荧光定量PCR检测HBV DNA。结果 成功构建正、反义RNA表达载体pEBAF—s—HBX、pEBAF—as—HBX。Northernblot证实反义RNA仅在AFP阳性的肝癌细胞中表达。pEBAF—as—HBX转染3d后,可显著抑制2.2.15细胞HBV复制和抗原表达,其HBsAg、HBeAg抗原表达较正义对照分别下降37.9%和36.8%,HBV DNA降低25%。结论 反义RNA表达载体pEBAF—as—HBX仅在肝癌细胞中特异表达、并可有效抑制HBV,有良好的开发应用前景。  相似文献   

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AIM: To produce a recombinant protein rMBP-NAP, which was fusionally expressed by Helicobacter pylori (H pylori) neutrophil-activating protein (NAP) and E. coli maltose binding protein (MBP) and to evaluate its immunoreactivity and immunogenicity. METHODS: Neutrophil-activating protein gene of H pylori (HP-napA) was subcloned from the recombinant plasmid pNEB-napA, and fused to MalE gene of expressing vector pMAL-c2x. The recombinant plasmid pMAL-c2x-napA was confirmed by restriction enzyme digestion, and then transformed into E. coli TB1. Fusion protein rMBP-NAP was induced by IPTG and identified by SDS-PAGE analysis. Soluble rMBP-NAP was purified by amylose affinity chromatography. Immunoreactivity and immunogenicity of the fusion protein were evaluated by animal experiment, Western blotting with human H pylori anti-sera. RESULTS: E.coli TB1 carrying recombinant plasmid pMAL-c2x-napA was constructed and led to a high efficiency cytosol expression of fusion protein rBMP -NAP when induced by IPTG. The molecular weight of rBMP-NAP was about 57 kD, accounting for 37.55% of the total protein in the sonicated supematant of E. coli TB1 (pMAL-c2x-napA). The purity of the fusion protein after one-step affinity chromatography was 94% and the yield was 100 mg per liter of bacterial culture. The purified fusion protein could be specifically recognized by both human anti-sera from clinical patients with H pylori infection and rabbit sera immunized by rMBP-NAP itself. CONCLUSION: Recombinant protein rMBP-NAP might be a novel antigen for vaccine development against H pylori.  相似文献   

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