弓形虫表面抗原P30基因分枝杆菌-大肠杆菌穿梭表达重组质粒的构建及序列测定

目的　构建编码弓形虫RH株表面抗原P30基因的分枝杆菌 -大肠杆菌穿梭表达重组质粒并进行其序列测定。方法　弓形虫RH株腹腔接种小鼠 ,收集腹水 ,酚 /氯仿法抽提基因组DNA ;根据基因库P30基因序列设计合成一对引物 ,采用PCR法扩增编码P30的基因片段 ,经低熔点琼脂糖法回收并纯化 ;将P30基因定向克隆到分枝杆菌 -大肠杆菌穿梭表达质粒 ,转化大肠杆菌DH5dα,在卡那霉素阳性LB培养基平板筛选阳性重组子 ,并经双酶切及PCR鉴定 ;最后对重组子进行序列测定。结果　PCR所扩增的P30基因片段为 10 37bp ,阳性重组质粒pBCG -P30经XbaI+KpnI双酶切 ,获得包含P30和热休克蛋白 (hsp70 )启动子的复合基因片段 ,此片段的大小为 1170bp ,与预期的理论值相符合。序列测定分析进一步表明所克隆的基因为编码P30抗原的基因片段。结论　成功构建编码弓形虫表面抗原P30基因大肠杆菌 -分枝杆菌穿梭质粒pBCG -P30。     

弓形虫P30基因MBP融合蛋白的表达

目的　构建弓形虫主要表面抗原Ｐ３０ 基因的原核表达载体并在Ｅ－ｃｏｌｉ 中表达。方法　根据已发表的弓形虫Ｐ３０基因序列,自行设计合成一对引物并在引物５’端分别引入限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ酶切位点,用ＰＣＲ技术从弓形虫ＲＨ 株基因组ＤＮＡ中扩增Ｐ３０ 基因片段,插入ｐＭＡＬＰ２ 质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａα感受态细胞,于氨苄ＬＢ培养平板上筛选阳性克隆,经过酶切及ＰＣＲ扩增鉴定重组子。将阳性重组子经ＩＰＴＧ诱导表达,ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ及免疫印迹分析。结果　从弓形虫ＲＨ 株ＤＮＡ中扩增出９７６ｂｐ 的Ｐ３０ 基因,构建成功ｐＭＡＬＰ２ － Ｐ３０ 重组质粒;ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎ － ｂｌｏｔ 显示ＭＢＰ／Ｐ３０ 融合蛋白条带的分子量约为７７－５ｋＤ,减去ＭＢＰ的分子量４３ｋＤ,得出Ｐ３０ 蛋白分子量为３４－５ｋＤ,且能被弓形虫高免鼠血清识别。结论　从弓形虫基因组ＤＮＡ中获取Ｐ３０ 基因,并成功构建ｐＭＡＬＰ２ － Ｐ３０ 重组质粒,诱导表达了Ｐ３０ 的融合蛋白。为进一步Ｐ３０ 蛋白的分离纯化及其对动物的免疫原性研究作好准备。     

弓形虫P30抗原基因的体外扩增、克隆及原核表达

根据已知弓形虫主要表面抗原Ｐ３０的基因序列，用已合成的一对引物，通过聚合酶链反应，从弓形虫ＲＨ、ＺＳ１和ＺＳ２株中扩增了Ｐ３０的编码基因，经纯化及相应酶切后插入质粒ｐｃＤＮＡ３中并转化大肠杆菌ＴＧ１。经含氨苄青霉素ＬＢ培养基初筛后，挑菌扩增双酶切鉴定，阳性克隆子在ＴＧ１中表达，产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示，Ｐ３０基因在大肠杆菌中高效表达。     

引形虫P30抗原基因的体外扩增,克隆及原核表达

根据已知弓形虫主要表面抗原Ｐ３０的基因序列，用已合成的一对引物，通过聚合酶链反应从弓形虫ＲＨ、ＺＳ１和ＺＳ２株中扩增了Ｐ３０的编码基因，经纯化及相应酶切后插入质粒ｐｃＤＮＡ３中并转化大肠杆菌ＴＧ１。经含氨苄青霉素ＬＢ培养在初筛后，挑菌扩增双酶切鉴定，阳性克隆子在ＴＧ１中表达，产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示，Ｐ３０基因在大肠杆菌中高效表达。     

编码弓形虫表面抗原P30基因的克隆及在E.coli中的表达

目的　构建编码弓形虫RH株表面抗原P30基因重组表达质粒 ,初步观察P30基因在E coli表达。方法　将P30基因定向克隆到分支杆菌 -大肠杆菌穿梭表达质粒热休克蛋白 70 (hsp70 )起动基因的下游的多克隆位点 ,构建重组表达质粒pBCG -P30 ;采用亚克隆技术 ,将含P30和hsp70起动基因的复合片段 ,插入表达载体 pBK -CMV质粒 ,转化大肠杆菌DH5α ,在卡那霉素阳性LB培养基平板筛选阳性重组子 ,并经双酶切及PCR扩增鉴定。重组质粒 pBK -P30转化大肠杆菌 ,IPTG诱导表达后进行SDS -PAGE和Westernboltting分析。 结果　 1)阳性重组质粒 pBCG -P30、pBK -P30经酶切和PCR鉴定 ,与预期的结果相符合。 2 )序列测定证实克隆的基因为编码P30抗原的基因。 3)P30基因在大肠杆菌诱导表达后获得4 5kDa融合蛋白 ,此抗原未被弓形虫高免兔血清识别。结论　成功构建编码弓形虫表面抗原P30重组表达质粒 ,并在大肠杆菌中获得表达 ,为弓形虫DNA疫苗的研制奠定基础     

编码弓形虫ROP1蛋白基因的体外扩增、克隆及在E.coli中的表达

目的构建弓形虫棒状体蛋白（ＲＯＰ１）基因重组质粒并在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达。方法用ＲＨ株接种小鼠,收集腹水,纯化速殖子,抽提基因组ＤＮＡ;据ＲＯＰ１基因序列设计合成一对引物,将上、下游引物分别引入ＥｃｏＲＩ,ＢａｍＨＩ酶切位点,用ＰＣＲ技术从ＲＨ株基因组ＤＮＡ中扩增编码ＲＯＰ１的基因片段,插入ｐＢＶ２２０质粒,转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞,于氨苄阳性ＬＢ培养平板上筛选阳性克隆,酶切鉴定;经温度诱导在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及免疫印迹分析。结果ＲＯＰ１基因体外扩增产物大小与预期值相符,约７５６ｂｐ;构建成功ｐＢＶ２２０－ＲＯＰ１重组质粒;ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫印迹显示特异蛋白条带的分子量约４３ｋＤ,表达产量约占菌体蛋白１３．２３％。结论从弓形虫基因组ＤＮＡ中获取ＲＯＰ１基因,并成功构建ｐＢＶ２２０－ＲＯＰ１重组质粒,诱导表达ＲＯＰ１非融合蛋白,为进一步分离纯化、用于对弓形虫侵入机制及免疫特性的研究做好准备。     

弓形虫GRA4基因体外扩增、克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达

目的体外扩增弓形虫RH株致密颗粒蛋白4（GRA4）基因，构建大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒ps3000-GRA4，重组耻垢分枝杆菌，鉴定重组蛋白的抗原性。方法用聚合酶链式反应（PCR）方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因，克隆入pGEM-T载体，然后亚克隆法构建ps3000-GRA4大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒，经电转化方法，将GRA4基因片断的穿梭质粒转化到耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis mc^2155）中，用重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠，Western blot方法检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体。结果成功扩增了弓形虫的GRA4基因并构建克隆质粒pGEMT-GRA4、穿梭质粒ps3000-GRA4，Western blot分析显示，GRA4重组蛋白能被重组质粒免疫小鼠血清识别，分子质量单位约为40．0ku。结论重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内表达出了重组蛋白GRA4，具有抗原性，刺激小鼠机体产生了抗弓形虫的抗体，为弓形虫重组BCG（Bacillus Calmette-Guerin）疫苗的研究奠定了基础。     

弓形虫表面抗原P22编码基因片段的亚克隆与表达

目的 亚克隆弓形虫RH株表面抗原P22编码基因，构建表达质粒pBK/P22，并对其在大肠杆菌（E.coli)中的表达作初步研究。方法 以限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ双酶切质粒pBCG5.6/P22，获得弓形虫表面抗原P22编码基因目的片段，在以低熔点琼脂糖回收纯化后，插入表达质粒载体pBK-CMV的多克隆位点，构建重组体pBK/P22,并转化大肠杆菌DH5α，快速酚法初筛阳性重组子，阳性克隆以PCR法与限制性酶切分析鉴定后，以IPTG进行诱导在E.coliDH5α中表达，表达产物以SDS－PAGE与免疫印迹分析。要双酶切质粒pBCG5.6/P22，获得约593bp的P22码基因片段，与预期片段大小相符；所构建pBK/P22重组性体阳性克隆以双酶切和PCR鉴定与预期结果一致；SDS－PAGE与免疫印迹显示，表达产物的大小约28ku。结论 成功亚克隆并构建了弓形虫表面抗原P22编码基因pBK/P22表达质粒，诱导表达了弓形虫P22表面抗原蛋白，为抗原免疫特性的研究奠定了基础。     

恶性疟原虫MSA2编码基因分枝杆菌穿梭质粒的构建及序列测定

目的 构建恶性疟原虫FCC－1／HN株MSA2编码基因分枝杆菌穿梭质粒重粒子pBCG5.6/MSA2,并进行序列测定。方法 根据恶性疟原虫MSA2编码基因的两侧序列设计引物，采用PCR技术扩增出MSA2编码全长片段，经低熔点脂脂糖挖块法回收纯化后，插入分枝杆菌穿梭质粒pBCG5.6/MSA2，并转化大肠杆菌DH5α，快速酚法初筛阳性重组子，阳性克隆以PCR法与限制性酶切分析鉴定后，双脱氧链终止法双向进行序列测定。结果 从恶性疟原虫基因组中扩增出约820bp的基因片段，所构建pBCG5.6/MSA2重组体阳性克隆经双酶切和PCR鉴定与预期结果一致，测序结果确证了插入片段的正确性。结论 成功构建了恶性疟原虫MSA2编码基因分枝杆菌穿梭表达质粒，为恶性疟BCG疫苗的研制奠定了基础。     

恶性疟原虫MSA2编码基因分枝杆菌穿梭质粒的构建及序列测定

目的　构建恶性疟原虫 FCC- 1/ HN株 MSA2编码基因分枝杆菌穿梭质粒重组子 p BCG5 .6 / MSA2 ,并进行序列测定。　方法　根据恶性疟原虫 MSA2编码基因的两侧序列设计引物 ,采用 PCR技术扩增出 MSA2编码基因全长片段 ,经低熔点琼脂糖挖块法回收纯化后 ,插入分枝杆菌穿梭质粒 p BCG5 .6 / MSA2 ,并转化大肠杆菌 DH5 α,快速酚法初筛阳性重组子 ,阳性克隆以 PCR法与限制性酶切分析鉴定后 ,双脱氧链终止法双向进行序列测定。　结果　从恶性疟原虫基因组中扩增出约 82 0 bp的基因片段 ,所构建 p BCG5 .6 / MSA2重组体阳性克隆经双酶切和 PCR鉴定与预期结果一致 ,测序结果确证了插入片段的正确性。　结论　成功构建了恶性疟原虫 MSA2编码基因分枝杆菌穿梭表达质粒 ,为恶性疟 BCG疫苗的研制奠定了基础。     

弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核表达质粒的构建

目的 构建弓形虫RH株致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒。方法 参照GRA8序列分别设计引物。采用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中分别扩增出编码GRA8的基因片段，克隆至pMD18-T载体；菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析；各组阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl，分别转化大肠杆菌BL21和JM109,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列；将构建的原核表达菌株经IPTG诱导，SDS—PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达；将构建的真核重组表达质粒免疫小鼠，观察其诱导的抗体应答。结果 PCR扩增出GRA8基因的特异片段。各组阳性克隆的序列正确，并分别被亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl上，构建了弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒；原核表达质粒在大肠杆菌中表达了GRA8的融合蛋白；真核重组表达质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。结论以pGEX-4T-2和pVAX1为载体，分别成功构建了GRA8的原核和真核重组表达质粒     

日本血吸虫基因工程BCG多价疫苗的研究

用日本血吸虫（Ｓｊ）成虫提取的总ＲＮＡ逆转录合成ｃＤＮＡ第一链，并设计合成引物，经ＰＣＲ扩增，扩增出２６ｋＤａ的编码区基因，并进行了测序，结果表明Ｓｊ中国大陆株（ＳｊＣ）、Ｓｊ菲律滨株（ＳｊＰ）２６ｋＤａ ＧＳＴ基因核苷酸同源性９９．８％。然后，构建了大肠杆菌－分枝杆菌穿梭表达质粒ＰＢＣＧ－Ｓｊ２６Ⅰ￣Ⅳ。再将其依次分别转化大肠杆菌、耻垢分枝杆菌和ＢＣＧ中，筛选出重组耻垢分枝杆菌疫苗和重组ＢＣＧ多     

含弓形虫P30基因插入昆虫杆状病毒的研究

目的：将弓形虫ＺＳ１株主要表膜抗原（Ｐ３０）基因插入到昆虫杆状病毒基因组中，为在昆虫细胞或昆虫体内表达及生产Ｐ３０作准备。方法：先将Ｐ３０基因亚克隆到转移载体质粒ｐＳＸ－ＩＶＶＩ＋Ｘ３中，然后用此重组载体质粒ＤＮＡ与亲本株病毒ＤＮＡ共转染培养的草地夜蛾细胞，经空斑纯化筛选出重组病毒株。结果：已得到含Ｐ３０基因的重组杆状病毒ＴｎＮＰＶ－Ｐ３０。结论：本文已将弓形虫ＺＳ１株Ｐ３０基因亚克隆到昆虫杆状病毒ＴｎＮＰＶ中。     

弓形虫表面抗原P22编码基因片段的亚克隆与表达

目的亚克隆弓形虫RH株表面抗原P22编码基因,构建表达质粒pBK/P22,并对其在大肠杆菌(E.coli)中的表达作初步研究. 方法以限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ双酶切质粒pBCG5.6/P22,获得弓形虫表面抗原P22编码基因目的片段,在以低熔点琼脂糖回收纯化后,插入表达质粒载体pBK-CMV的多克隆位点,构建重组体pBK/P22,并转化大肠杆菌DH 5α,快速酚法初筛阳性重组子,阳性克隆以PCR法与限制性酶切分析鉴定后,以IPTG进行诱导在E.coli DH 5α中表达,表达产物以SDS-PAGE与免疫印迹分析. 结果双酶切质粒pBCG5.6/P22,获得约593 bp的P22编码基因片段,与预期片段大小相符;所构建pBK/P22重组体阳性克隆经双酶切和PCR鉴定与预期结果一致;SDS-PAGE与免疫印迹显示,表达产物的大小约28 ku. 结论成功亚克隆并构建了弓形虫表面抗原P22编码基因pBK/P22表达质粒,诱导表达了弓形虫P22表面抗原蛋白,为抗原免疫特性的研究奠定了基础.     

应用聚合酶链反应技术建立弓形虫表面抗原基因的克隆与测定

弓形虫主要表面抗原Ｐ３０存在于弓形虫表膜及纳虫泡内的一种蛋白，是刺激机体产生免疫反应的主要抗原。以自行设计合成的一对引物，用聚合酶链反应的方法，从弓形虫基因组ＤＮＡ中将Ｐ３０编码基因调出，经纯化及相应酶切后，插入质粒ｐＢＶ２２０中构成重组质粒ｐＢＶ２２０－Ｐ３０。经Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测序确证该重组质粒中的插入片段即为Ｐ３０基因。     

应用聚合酶链反应技术建立弓形虫表面抗原基因的…

弓形虫主要表面抗原Ｐ３０存在于弓形虫表膜及纳虫泡内的一种蛋白，是刺激机体产生免疫反应的主要抗原。以自行设计合成的一对引物，用聚合酶链反应的方法，从弓形虫基因组ＤＮＡ中将Ｐ３０编码基因调出，经纯化及相应酶切后，插入质粒ｐＢＶ２２０中构成重组质粒ｐＢＶ２２０－Ｐ３０。经Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测序确证该重组质粒中的插入片段即为Ｐ３０基因。     

弓形虫SAG2基因体外扩增、克隆及在耻垢分支杆菌中的表达

目的体外扩增弓形虫RH株表面抗原2(SAG2)基因,并构建大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒ps3000-SAG2,构建重组耻垢分支杆菌,免疫接种小鼠,通过检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体,证明SAG2重组蛋白在耻垢分支杆菌中有表达。方法采用聚合酶链式反应(PCR)方法,体外扩增弓形虫RH株的SAG2基因,克隆入pGEMT载体,然后构建亚克隆ps3000-SAG2大肠杆菌-分支杆菌穿梭质粒,经电转化方法,将SAG2基因的穿梭质粒转化到耻垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatismc2155)中,用重组耻垢分支杆菌免疫小鼠,Western-blotting方法检测免疫小鼠血清中的弓形虫抗体。结果成功扩增了弓形虫的SAG2基因;正确构建穿梭质粒ps3000-SAG2,免疫印迹分析,免疫小鼠血清能所识别SAG2重组蛋白。结论耻垢分支杆菌在小鼠体内表达出了重组蛋白SAG2,具有抗原性,刺激小鼠机体产生出了抗弓形虫的抗体,为下一步弓形虫重组BCG(Bacilli Calmette-Guérin)疫苗的研究奠定了基础。     

大肠杆菌-分支杆菌穿梭表达质粒的构建及外源基因人白细胞介素-2在大肠杆菌和卡介苗中的表达

目的构建和鉴定大肠杆菌－分支杆菌穿梭表达质粒，检测外源基因在大肠杆菌和卡介苗（ＢＣＧ）中的稳定表达。方法采用基因工程技术构建大肠杆菌－分支杆菌穿梭表达质粒，用电穿孔法将重组质粒ＰＺＳＩＩ－Ｉ转化ＢＣＧ，用酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）和ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定外源基因白细胞介素－２（ＩＬ－２）在ＢＣＧ和大肠杆菌中的表达。结果外源基因人ＩＬ－２基因能在大肠杆菌和ＢＣＧ中稳定表达，并能从ＢＣＧ中分泌到胞外。结论构建的ＢＣＧ重组体，能表达和分泌人ＩＬ－２。ＢＣＧＨＳＰ６５启动子表达质粒能启动外源基因在ＢＣＧ和大肠杆菌中的表达，同时使外源基因分泌至ＢＣＧ之外，但不能分泌至大肠杆菌之外。     

恶性疟原虫FCC-1/HN株环子孢子蛋白基因片段的亚克隆及表达

目的 构建恶性疟原虫FCC－1／HN株CSP基因的重组真核表达质粒pBK－CSP,在大肠杆菌中进行表达,并进行鉴定。方法 采用限制性内切酶法从重组的大肠杆菌－分枝杆菌穿梭质粒pBCG5.6/CSP中分离出经过测序鉴定的CSP基因片段,将其亚克隆于pBK－CMV真核表达载体,构建重组真核表达质粒pBK-CSP.经IPTG诱导,重组质粒在大肠杆菌DH5α中进行表达,并进行SDS－PAGE及免疫印迹分析。结果 从pBCG5.6/CSP中分离出SP基因片段,成功构建pBK-CSP重组质粒;SDS－PAGE及免疫印迹分析结果显示特异性蛋白条带的相对分子质量约为42000。结论 从pBCG5．6／CSP中成功分离出CSP基因片段,并成功构建pBK-CSP重组质粒,诱导表达CSP非融合蛋白,为恶性疟原虫DNA疫苗的研制奠定了基础。     

弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅰ.pcDNA3-ROP1真核表达重组质粒的构建

目的构建弓形虫ＺＳ２株ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１真核表达重组质粒,为进一步表达及ＤＮＡ免疫做准备。方法用ＰＣＲ技术从弓形虫ＺＳ２分离株的基因组ＤＮＡ中扩增编码棒状体蛋白１（ＲＯＰ１）的基因片段,重组入ｐＵＣ１８克隆载体。将ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１中的ＲＯＰ１外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入ｐｃＤＮＡ３真核表达载体,再经含氨苄ＬＢ培养基筛选,酶切、ＰＣＲ鉴定。结果从ＺＳ２株基因组ＤＮＡ中扩增出特异的ＲＯＰ１基因片段,克隆成功ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１;经亚克隆,筛选鉴定获得了ｐｃＤＮＡ－ＲＯＰ１重组质粒。结论构建成功弓形虫ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１重组质粒,亚克隆成功ｐｃＤＮＡ－ＲＯＰ１重组质粒,为下一步研究奠定了基础