miRNA-95在骨肉瘤组织中的表达及其对MG-63细胞增殖和侵袭的影响

目的：研究miRNA-95在骨肉瘤组织和细胞株中的表达情况及其对骨肉瘤MG-63细胞增殖、凋亡、细胞周期和侵袭 能力的影响。方法：以实时荧光定量PCR检测15例骨肉瘤组织及其癌旁组织（标本收集自2015年1月至2018年1月青岛市海 慈医疗集团外科手术的病例）和骨肉瘤细胞株（MG-63、 U2OS、143B和HOS）与正常人成骨细胞株hFOB1.19中的miRNA-95表 达。利用Lipofectamine 2000将miRNA-95 mimics和miRNA-95 inhibitors分别转染至人骨肉瘤MG-63细胞株中,并设置miRNANC对照组,CCK-8法检测各组细胞增殖活力变化,流式细胞术检测各组细胞周期和凋亡变化,Transwell方法检测各组细胞侵袭 能力变化,双荧光素酶活性实验检测并验证miRNA-95在MG-63细胞中的靶向基因。结果：miRNA-95在人骨肉瘤组织中的表 达水平显著高于癌旁组织（P<0.01）, 在MG-63、 U2OS、143B和HOS细胞中的表达水平显著高于hFOB1.19,且在MG-63细胞中表 达水平最高（P<0.01）。与miRNA-NC对照组相比,miRNA-95 mimics组中MG-63细胞的增殖活力显著上升、细胞凋亡率显著下 降而侵袭率显著上升（均P<0.01）、 而miRNA-95 inhibitors组中MG-63细胞增殖活力显著下降、细胞周期被阻滞、细胞凋亡率显著 上升而侵袭率显著下降（均P<0.01）;miRNA-95在骨肉瘤MG-63细胞中靶向上皮膜蛋白-1（epithelial membrane protein-1,EMP-1） 基因发挥作用。结论：miRNA-95在人骨肉瘤组织和细胞中均呈高表达,抑制骨肉瘤MG-63细胞中miRNA-95表达能够促进细 胞凋亡进而抑制细胞增殖、细胞周期及侵袭能力,该作用可能通过靶向EMP-1基因而发挥。     

小干扰RNA对骨肉瘤细胞株CXCR4基因表达和侵袭力的影响

目的：研究小干扰RNA（siRNA）对骨肉瘤细胞株中趋化因子受体CXCR4基因表达和侵袭力的影响。方法：采用单细胞克隆技术，从人骨肉瘤细胞系MG-63中分离培养出高表达CXCR4的骨肉瘤细胞株，设计合成针对CXCR4基因的siRNA，脂质体法转染骨肉瘤细胞株后用RT—PCR检测CXCR4基因表达水平的变化，荧光检测转染效率，Transwell趋化侵袭实验观察转染后细胞株侵袭能力的变化。结果：转染效率约为43．82％，CXCR4编码基因序列特异性siRNA能有效下调CXCR4基因表达水平，与空白组和阴性对照组比较，其差异有统计学意义（P〈0．05），细胞株穿过侵袭膜的细胞数也较转染前减少（P〈0．05）。结论：小分子干扰RNA技术能有效抑制骨肉瘤细胞株CXCR4基因的表达和体外侵袭能力。     

EphA7在骨肉瘤中的表达及对骨肉瘤MG-63细胞增殖、迁移和凋亡的影响

背景与目的：EphA7蛋白是对人体正常生理过程具有重要作用的一种膜蛋白，常在细胞膜中发挥多种调控作用，但该蛋白在骨肉瘤中的作用尚不清楚。该研究拟观察骨肉瘤组织中EphA7的表达，并了解EphA7对人骨肉瘤MG-63细胞增殖、迁移和凋亡的影响。方法：收集45例患者的骨肉瘤组织和瘤旁正常组织。培养人骨肉瘤MG-63细胞，用siRNA转染MG-63细胞，并分成siRNA-EphA7组（EphA7-siRNA转染）、siRNA-Control组（阴性对照siRNA转染）和空白组（未转染）。采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）评估组织和细胞中EphA7的mRNA表达和蛋白水平。通过细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）测定细胞增殖活力，通过细胞划痕实验检测细胞迁移能力，利用流式细胞术检测细胞凋亡。结果：RTFQ-PCR和Western blot检测结果显示，EphA7的mRNA表达和蛋白水平在骨肉瘤组织中明显高于瘤旁正常组织（P＜0.05）；与空白组和siRNA-Control组相比，siRNA-EphA7组中EphA7的mRNA表达和蛋白水平显著降低（P＜0.05）。CCK-8测定结果显示，siRNA-EphA7组的吸光度（D）值显著低于空白组和siRNA-Control组（P＜0.05）。细胞划痕实验显示，与空白组和siRNAControl组相比，siRNA-EphA7组在划痕后愈合率显著降低（P＜0.05）。流式细胞术显示，与空白组和siRNA-Control组相比，siRNA-EphA7组凋亡率显著增加（P＜0.05）。结论：EphA7在骨肉瘤组织中表达上调。下调MG-63细胞中EphA7的表达可抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移，促进其凋亡。     

Livin反义寡核苷酸对骨肉瘤MG-63细胞活性的影响

目的 探讨Livin在骨肉瘤细胞中的表达及Livin反义寡核苷酸（ASODN）对骨肉瘤细胞活性及功能的影响。方法 设计针对Livin的ASODN序列,根据转染效率评价结果,选择下调作用最强的ASODN序列制备脂质体-寡核苷酸复合物并转染 MG-63 细胞。采用免疫细胞染色法及Western blotting检测转染24 h后MG-63 细胞中Livin的表达情况,CellTiter-Glo法检测转染72 h后MG-63 细胞的增殖情况,划痕法检测ASODN对MG-63细胞迁移能力的影响,流式细胞仪检测转染24 h后 MG-63 细胞的凋亡情况和细胞周期。结果 Livin蛋白主要表达于MG-63细胞的胞质。选用下调作用最强的ASODN转染MG-63细胞后,Livin蛋白表达显著下降;不同浓度Livin ASODN 对 MG-63细胞的增殖及迁移有剂量依赖抑制作用;而ASODN 组的凋亡率明显高于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05）。结论 靶向Livin的ASODN可以显著抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭能力并促进其凋亡。     

骨肉瘤MG-63细胞中Survivin的表达及其反义寡核苷酸对细胞增殖与凋亡的作用

目的 探讨Survivin在骨肉瘤细胞中的表达及Survivin反义寡核苷酸（ASODN）对骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响。方法 设计针对Survivin的ASODN和正义核苷酸（SODN）序列,制备脂质体-寡核苷酸复合物并转染MG-63细胞,分为空脂质体（Lip）组、脂质体介导的SODN（Lip-SODN）组和脂质体介导的ASODN（Lip-ASODN）组。采用免疫细胞染色法检测MG-63细胞中Survivin的表达情况,Western blotting检测各组转染48h后的Survivin蛋白水平,MTT法检测转染24、48和72h后MG-63细胞的增殖情况,流式细胞仪检测转染48h后MG-63细胞的凋亡情况。结果 Survivin主要表达于MG-63细胞的胞核。Lip-ASODN组的Survivin蛋白水平均低于Lip-SODN组和Lip组。不同浓度Survivin ASODN对MG-63细胞的增殖抑制程度不同,Lip-ASODN组的细胞增殖抑制率高于Lip组,且呈浓度依赖性;而Lip-SODN组的增殖抑制率与Lip组的差异无统计学意义（P＞0.05）。Lip-ASODN组的凋亡率为（88.47±0.79）％,高于Lip组的（10.01±0.90）％和Lip-SODN组的（4.12±0.25）％,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 靶向Survivin的ASODN可以显著抑制骨肉瘤MG-63细胞的增殖能力,并促进其凋亡。     

miR-369靶向调节SOX4表达对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的调控作用

目的:观察微小RNA（miRNA,miR）-369通过调节SOX4对骨肉瘤MG-63细胞增殖、凋亡的影响。方法:miR-369体外模拟物（mimics）转染,构建miR-369上调表达模型,以转染阴性对照链为对照组,CCK-8法和流式细胞技术分别检测细胞增殖率和凋亡率变化;Real-time PCR法检测SOX4 mRNA表达水平;双荧光素酶活检检测证实miR-369与SOX4相互作用关系;Western-blot法检测不同组间SOX4及Bcl-2家族相关蛋白表达水平变化。结果:miR-369 mimics转染后,MG-63细胞中miR-369表达水平较对照组明显提高(P=0.009);miR-369 mimic转染后24 h及48 h后细胞相对存活率均明显低于对照组;流式细胞仪结果显示mimic组细胞凋亡率较对照组明显提高（P=0.031）;Real-time PCR和Western blot实验分别证实miR-369 mimic转染后,SOX4在mRNA和蛋白水平表达均明显抑制;而Bcl-2家族相关蛋白表达水平发生明显变化。结论:miR-369表达上调可以抑制骨肉瘤细胞增殖并诱导凋亡,这些作用与靶向下调SOX4表达有关。     

沉默HOXC10基因促进骨肉瘤MG-63细胞凋亡及其机制

目的:探讨沉默同源框C10（Homeobox C10,HOXC10）基因表达对骨肉瘤细胞MG-63细胞增殖和凋亡的影响,并初步探讨可能的作用机制。方法:采用脂质体转染法将特异性针对HOXC10基因的shRNA转入骨肉瘤MG-63细胞（HOXC10-shRNA组）,同时以转染Scramble-shRNA作为对照组（Scramble-shRNA组）,分别应用实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测HOXC10 mRNA及蛋白的表达水平。转染处理后,分别采用CCK-8法及FCM法检测骨肉瘤MG-63细胞的增殖抑制率及凋亡情况,采用蛋白质印迹法检测HOXC10、ATM和核因子-κB（nuclear factor kappa B,NF-κB)及凋亡相关蛋白Survivin和Caspase-3的表达水平。结果:HOXC10-shRNA转入MG-63细胞后,HOXC10 mRNA和蛋白的表达水平均明显下调（P均<0.05）。与Scramble-shRNA组细胞活力（0.95±0.12）%和凋亡率（4.35±0.52）%相比,HOXC10-shRNA组细胞活力（0.38±0.06）%明显下降,细胞凋亡率为（18.19±3.76）%明显升高（P均<0.05）;ATM/NF-κB信号通路中相关蛋白ATM、NF-κB及Survivin的表达水平均明显下调（P均<0.05）,而Caspase-3表达明显上调（P<0.05）。结论:沉默HOXC10基因表达后可抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖并促进其凋亡,其机制可能与调控ATM/NF-κB信号通路的活化相关。     

RNAi对骨肉瘤细胞株HMGA1基因表达及侵袭力抑制的实验研究

目的:探讨RNA干扰(RNAi)技术对骨肉瘤细胞株(MG-63)中HMGA1基因表达和侵袭力的影响.方法:采用单细胞克隆技术,从MG-63中分离培养出高表达HMGAl的骨肉瘤细胞株,将细胞分成3组,通过PU6mRFP载体进行转染:实验组,转染HMGA1的小干扰RNA(siRNA);阴性对照组,转染HMGA1的无关序列;细胞对照组为未转染的MG-63细胞.转染细胞株后,荧光检测转染效率;用实时荧光定量RT-PCR和蛋白质印迹法分别从mRNA和蛋白质水平检测siRNA对HM-GA1表达的影响;Transwell趋化侵袭实验观察转染后细胞株侵袭能力的变化.结果:荧光检测转染效率,实验组为(55.68±6.74)%,阴性对照组为(49.87±4.33)%;细胞对照组观察不到明显的荧光细胞.实验组HMGA1 siRNA转染骨肉瘤细胞后,明显下调细胞中HMGAl mRNA及蛋白的表达,与转染时间和转染浓度相关;阴性对照组和细胞对照组在转染前后HMGAl基因的mRNA及蛋白质表达均无明显变化.实验组细胞株穿过侵袭膜的细胞数明显低于阴性对照组和细胞对照组,P<0.01.结论:HMGAl siRNA可以下调骨肉瘤细胞中HMGAl mRNA及其蛋白的表达,抑制骨肉瘤细胞侵袭能力.     

大黄酸通过抑制STAT3基因的表达调控骨肉瘤细胞的增殖和凋亡

目的:探讨大黄酸对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响及潜在的作用机制。方法:以人骨肉瘤MG-63细胞为研究对象,利用CCK-8实验检测大黄酸对MG-63细胞增殖的影响,并计算大黄酸作用48 h的半数抑制浓度（IC50）,采用该浓度进行后续的实验。转染STAT3 siRNA至MG-63细胞,qRT-PCR和Western blot检测分别在mRNA和蛋白水平上检测转染效果,采用CCK-8实验、克隆形成实验、流式细胞术验证大黄酸和STAT3 siRNA及其联合作用对MG-63细胞存活率、克隆形成、凋亡能力的影响,Western blot检测各组MG-63细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3的表达情况。结果:大黄酸能够呈浓度依赖性的抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖,干预48 h的IC50为46.05 μmol/L。大黄酸或STAT3 siRNA均能降低MG-63细胞中STAT3的表达,抑制MG-63细胞存活率,阻碍细胞克隆形成能力,促进细胞凋亡,上调细胞中Bax和Cleaved Caspase-3的表达,下调Bcl-2的表达;且二者联合效果更显著。结论:大黄酸通过抑制STAT3基因表达抑制骨肉瘤细胞增殖并促进细胞凋亡。     

miRNA-21抑制剂对骨肉瘤MG63细胞增殖、凋亡和迁移的影响

目的：通过观察miR-21抑制剂对骨肉瘤MG63细胞增殖、凋亡及迁移能力带来的变化,探讨miR-21抑制剂在骨肉瘤细胞生物学行为中的作用。方法：将MG63细胞随机分为实验组、阴性对照组和正常细胞对照组。实验组转染miR-21抑制剂（hsa-miR-21 inhibitors）抑制其细胞内miR-21活性,阴性对照组转染抑制剂阴性对照核苷酸序列（microRNA inhibitor N．C）,正常细胞对照组不做转染。采用MTT比色实验测定三组细胞24h、48h、72h和96h的吸光度（OD）值,并绘制生长曲线。采用流式细胞仪检测细胞凋亡。Tran-swell法检测细胞迁移。结果：两对照组间细胞的增殖速度无明显差异（P＞0．05）,与对照组相比,实验组细胞增殖速度明显减慢（P＜0．05）。实验组细胞凋亡率明显增高（P＜0．05）;阴性对照组、空白对照组之间细胞凋亡无明显差异（P＞0．05）。实验组细胞迁移力受到明显抑制（P＜0．05）。与空白对照组相比,阴性对照组细胞迁移力无明显差异（P＞0．05）。结论：miR-21抑制剂可通过抑制骨肉瘤细胞系MG63细胞内miR-21的活性,显著抑制其增殖能力,促进细胞凋亡和降低迁移。miR-21可能成为骨肉瘤诊治的新靶点。     

MicroRNA-145对骨肉瘤细胞增殖及凋亡的影响

背景与目的 MicroRNA145(miRNA145)是microRNA家族中的重要一员,已被证实在多种肿瘤细胞中呈现低表达,并认为miRNA 145作为一种抑癌基因可以影响肿瘤细胞的生长和侵袭能力,但其在骨肉瘤中的作用未见相关报道.该研究旨在探讨miRNA145对骨肉瘤细胞增殖、细胞周期以及凋亡的影响.方法 用脂质体法将miRNA145真核表达质粒瞬时转染入人骨肉瘤细胞(MG63),实验设置空白对照组、空载体转染组和miRNA145质粒转染组3组,转染后荧光显微镜下观察转染效率,实时定量RT-PCR检测各组细胞miRNA145的表达,MTT增殖实验检测各组细胞的增殖情况,流式细胞仪检测各组细胞周期及细胞凋亡率.结果 转染后miRNA145质粒转染组细胞增殖速度明显下降,细胞周期停止在G1期之前,凋亡率增高,差异有统计学意义(P<0.05).结论 miRNA145可以有效地抑制骨肉瘤细胞的增殖,促进细胞凋亡.     

HERG 基因调控 NF-κB 通道抑制骨肉瘤恶性表型的研究

目的：检测HERG（human ether-à-go-go-related gene）钾离子通道在骨肉瘤中的表达,并探索小干扰 RNA（siRNA）沉默 HERG 表达后对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响及可能的调控机制。方法采用反转录定量聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blotting 和免疫组织化学法检测骨肉瘤 MG-63细胞和组织中 HERG 的表达。实验分组为：HERG-siRNA 处理为实验组,control-siRNA 处理为对照组,未行任何处理为空白组。分别采用 CCK-8法、克隆形成、流式细胞仪和 Tunel 法检测 MG-63细胞增殖、生长和凋亡的变化。最后采用 Western blo-tting检测骨肉瘤细胞中核转录因子-κB（NF-κB）信号通路相关蛋白的表达水平。结果HERG 在骨肉瘤细胞和组织中异常高表达。CCK-8法结果示,实验组[（75．34±4．45）％]与对照组[（100．60±5．31）％]和空白组[（100．00±5．66）％]的细胞增殖水平相比,差异有统计学意义（t ＝3．64,P ＝0．007;t ＝3．43,P ＝0．009）。克隆形成结果示,实验组（134．30±11．82）与对照组（225．30±11．56）和空白组（232．80±12．21）的克隆形成数相比,差异有统计学意义（t ＝5．51,P ＝0．002;t ＝5．80,P ＝0．001）。流式细胞凋亡结果示,实验组[（28．10±2．21）％]与对照组[（9．36±2．42）％]和空白组[（10．92±2．51）％]的早期凋亡所占比例相比,差异有统计学意义（t ＝5．72,P ＝0．005;t ＝5．14,P ＝0．007）。Tunel 法结果示,实验组[（31．57±2．08）％]与对照组[（10．35±1．82）％]和空白组[（7．96±0．88）％]的凋亡指数相比,差异有统计学意义（t ＝7．69,P ＝0．002;t ＝10．48,P ＝0．001）。抑制 HERG 表达可明显下调 NF-κB 信号通路中细胞凋亡抑制蛋白-1（cIAP-1）、X 染色体连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）、Bcl-2和 Survivin 的活性,同时还下调磷酸化 NF-κB 抑制蛋白（IκB）α和 NF-κB p65的表达水平。结论HERG 在骨肉瘤中高表达,其通过调控 NF-κB 信号通路参与骨肉瘤细胞增殖和凋亡过程,有望成为骨肉瘤治疗和诊断的新靶点。     

Survivin反义寡核苷酸对骨肉瘤细胞凋亡的影响

目的:采用survivin反义寡核苷酸(ASODN)封闭骨肉瘤细胞survivin的作用,观察其对骨肉瘤细胞系MG63增殖和凋亡的影响。方法:以脂质体为载体,介导survivin反义寡核苷酸转染人骨肉瘤细胞系MG63,用MTT法测定细胞增殖;流式细胞仪检测转染survivin反义寡核苷酸后细胞凋亡率;Westernblot及半定量RTPCR检测转染survivin反义寡核苷酸后的骨肉瘤细胞survivin蛋白及mRNA表达。结果:脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染骨肉瘤细胞系MG63后,细胞增殖明显受到抑制,细胞凋亡率明显增加,骨肉瘤细胞survivin蛋白及mRNA表达均明显降低。结论:脂质体介导转染survivin反义寡核苷酸可以抑制细胞增殖,有效降低细胞内survivin基因的表达,促进细胞凋亡。     

siRNA干扰FoxM1基因表达对人骨肉瘤MG63细胞增殖与凋亡影响研究

目的通过抑制骨肉瘤细胞株MG63中FoxM1基因表达,观察对骨肉瘤细胞系增殖与凋亡的影响。方法采用蛋白质印迹法检测不同人骨肉瘤细胞株MG63和SOSP-9607中FoxM1基因的表达。将骨肉瘤细胞株MG63分为实验组、阴性对照组和空白对照组,实验组转染FoxM1特异性siRNA（FoxM1-siRNA）,阴性对照组转染阴性对照siRNA,空白对照组不做处理。实时-聚合酶链反应（Real-time PCR）和蛋白质印迹法检测转染前后FoxM1基因在mRNA及蛋白表达水平的变化;四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞增殖率,流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果人骨肉瘤细胞株MG63和SOSP-9607中存在FoxM1基因的表达。实验组MG63细胞转染siRNA后,FoxM1的mRNA表达为0.39±0.09,低于阴性对照组的0.91±0.07,t=7.92,P〈0.001;也低于空白对照组的0.96±0.08,t=8.68,P〈0.001。实验组FoxM1蛋白表达为0.31±0.06,显著低于阴性对照组的0.81±0.10,t=7.20,P〈0.001;也低于空白对照组的0.89±0.09,t=8.35,P〈0.001。实验组MG63细胞增殖率为0.36±0.03,显著低于阴性对照组的0.61±0.02,t=12.86,P〈0.001;也低于空白对照组的0.65±0.02,t=14.92,P〈0.001。实验组MG63细胞凋亡率为（13.69±1.15）%,显著高于阴性对照组的（2.38±0.90）%,t=14.16,P〈0.001;也高于空白对照组的（2.87±0.86）%,t=13.54,P〈0.001。结论人骨肉瘤细胞株中存在FoxM1蛋白的表达;特异性siRNA可下调骨肉瘤细胞株MG63中FoxM1基因的表达,对细胞的增殖具有负性调控作用,并能诱导细胞凋亡。     

小干扰RNA抑制MG-63细胞cyclin A2基因的表达

目的利用小干扰RNA(siRNA)抑制骨肉瘤及正常成纤维细胞中cyclin A2基因的表达,并观察其对细胞生物活性的影响。方法设计并化学合成3对针对cyclin A2基因的siRNA,用Oligofectamine分别将其转染到骨肉瘤细胞系MG-63及正常人成纤维细胞HSF中,以无义siRNA转染作为阴性对照;以real-time PCR、Western blot检测cyclin A2基因沉默效果,采用MTT、RT-PCR、流式细胞、克隆培养等方法评价抑制cyclin A2基因表达后细胞的生长状态,同时检测PCNA及cyclin B1表达的改变。结果3对siRNA均能使cyclin A2 mRNA的表达降低,其中siRNA,抑制率最高。在骨肉瘤细胞MG-63中,转染50 nmol/L的siRNA,48 h后,cyclin A2的mRNA及蛋白表达被抑制近80%,这导致细胞增殖抑制,80.1%的细胞被阻滞在G0/G1期,克隆形成能力下降至45.5%,同时,PCNA及cyclin B1的mRNA表达明显降低。对正常成纤维细胞HSF,虽然siRNA1能抑制近60%的cyclin A2 mRNA及蛋白表达,但细胞的增殖及克隆形成能力未受影响。结论针对cyclin A2基因的siRNA能有效降低细胞中cyclin A2 mRNA及蛋白的表达,抑制骨肉瘤细胞的生长,而对正常细胞影响不大。表明cyclin A2是骨肉瘤细胞增殖所依赖的关键基因,抑制其表达有望成为治疗骨肉瘤的新途径。