下调Ets2表达对肾癌786-0细胞迁移及侵袭的影响

目的:探讨E26转录因子2（E-twenty six 2,Ets2）对肾癌细胞786-0迁移、侵袭的影响及其机制。方法:设计并合成特异性siRNA下调肾癌细胞系786-0中Ets2的表达;并利用划痕实验及Transwell实验检测其迁移及侵袭能力的变化;通过Western blot检测下调Ets2表达后基质金属蛋白酶2（MMP-2）及MMP-9表达水平变化。结果:siRNA能有效下调肾癌786-0细胞系中Ets2的表达。细胞划痕实验结果显示下调Ets2表达后,细胞迁移能力减弱（P＜0.01）;Transwell实验中NC组穿膜细胞数为（43.80±3.99）个,而siRNA1组为（23.30±4.24）个(P＜0.01), siRNA2组为（24.20±3.29）个（P＜0.01）,细胞侵袭能力减弱。Ets2-siRNA介导的Ets2基因沉默下调了786-0细胞中MMP-2及MMP-9的表达的同时上调了基质金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP1）和TIMP2的表达。结论:Ets2可通过调节MMPs及TIMPs的表达影响肾癌细胞的迁移及侵袭能力。     

IGF-1R表达下调抑制肾癌786-0细胞的增殖、迁移、侵袭和细胞周期G1/S期转变

目的:观察小干扰RNA (siRNA)介导的胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)基因沉默对肾癌细胞786-0增殖、迁移、侵袭和细胞周期的影响.方法:采用实时定量PCR(real-time PCR)和蛋白印迹法(West-ern blot)测定转染后肾癌细胞IGF-lR及下游相关产物的表达;采用Cell counting kit-8(CCK-8)检测细胞增殖能力;Transwell实验及划痕实验检测细胞迁移及侵袭能力;流式细胞仪检测细胞凋亡及周期改变.结果:IGF-1R基因的siRNA可有效抑制IGF-1R mRNA及蛋白的表达(P＜0.01);细胞增殖实验结果显示IGF-1R-siRNA转染组增殖能力显著减弱(P＜0.01);Transwell实验及划痕实验结果显示IGF-1R-siRNA转染组侵袭及迁移能力明显降低(P＜0.01);流式细胞术检测到转染后细胞G1期细胞数明显升高,发生G1/S期阻滞(P＜0.05);IGF-1R下游蛋白p-IRS1、p-IRS2、p-SHC水平显著降低.结论:IGF-1R表达下调可以抑制肾癌786-0细胞的生长、增殖、迁移和侵袭的能力,并可以使肾癌786-0细胞G1/S期细胞周期停滞.     

SPOP促进SETD2蛋白的降解并增强肾癌细胞的体外成瘤与增殖能力

目的:新近发现E3泛素化连接酶的成员之一SPOP在肾癌中作用关键,我们前期的研究表明SPOP在肾癌中表达上调且通过活化B-Catenin的活性来促进肾癌细胞的侵袭与转移.本研究继续研究SPOP在肾癌成瘤与增殖中的作用,并探索其潜在的分子机制.方法:siRNA靶向沉默肾癌细胞内SPOP的表达后,采用克隆形成实验及MTT实验检测细胞的体外成瘤与增殖能力的变化;运用realtime-PCR及western blot技术探索SPOP在肾癌细胞内发挥生物学功能的潜在靶分子;采用免疫组织化学方法检测SPOP与其靶分子SETD2在人肾癌组织中的表达情况,并行相关性分析.结果:SPOP siRNA显著减低肾癌细胞的体外成瘤及增殖能力;SPOP的变化不影响肾癌细胞内SETD2 mRNA的表达,但当采用蛋白合成抑制剂cycloheximide预先阻断细胞内SETD2蛋白的合成后,SPOP siRNA能明显延缓SETD2蛋白的降解.进一步检测人肾癌组织标本中SPOP与SETD2的表达结果证实,SPOP与SETD2蛋白的表达呈显著的负相关(r=-0.41,P＜0.05).结论:SPOP能增强肾癌细胞的体外成瘤与增殖能力,其潜在的机制可能为促进抑癌蛋白SETD2的降解.     

下调TPX2抑制喉癌细胞生长的体外实验研究

目的:研究TPX2对喉癌细胞增殖、克隆形成能力及细胞周期的影响。方法:Hep-2细胞中转染TPX2 siRNA、siRNA control记为TPX2 siRNA、siRNA -NC组，以不做转染的细胞为Con组。荧光定量PCR和Western blot分别测定细胞中TPX2 mRNA和蛋白水平，MTT测定各组细胞增殖，平板克隆实验测定各组细胞克隆形成能力，流式细胞术测定各组细胞周期情况，Western blot测定各组细胞中增殖细胞核抗原（PCNA）、细胞核增殖抗原(Ki-67)、细胞周期依赖性蛋白激酶4(CDK4)、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）蛋白水平。结果:siRNA control中TPX2 mRNA和蛋白水平、细胞存活率、克隆形成数目、细胞周期以及细胞中PCNA、Ki-67、CDK4、Cyclin D1蛋白水平与Con相比均没有明显变化（P＞0.05）。TPX2 siRNA细胞中TPX2 mRNA和蛋白水平均明显低于Con（P＜0.05）。TPX2 siRNA细胞存活率、克隆形成数目均明显低于Con，细胞G0/G1期比例明显高于Con，细胞中PCNA、Ki-67、CDK4、Cyclin D1蛋白水平明显低于Con（P＜0.05）。结论:TPX2敲低可以降低喉癌细胞增殖、克隆形成能力，将细胞周期阻滞在G0/G1期，降低细胞中PCNA、Ki-67、CDK4、Cyclin D1蛋白表达。     

沉默EMMPRIN对肾透明细胞癌增殖的影响

目的:探讨细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（EMMPRIN）在肾透明细胞癌增殖中的作用。方法:利用免疫组化、实时定量PCR(RT-PCR)和蛋白印迹(Western blot)等方法检测肾癌组织与肾透明细胞癌细胞株中EMMPRIN的表达情况。通过小分子干扰核糖核酸（siRNA）EMMPRIN在786-O细胞中的表达,研究EMMPRIN下调后对786-O肾癌细胞株生物学功能的影响。结果:EMMPRIN在肾癌组织中高表达,肾癌细胞系中EMMPRIN的表达高于正常的肾小管上皮细胞。通过小干扰RNA来敲除EMMPRIN的表达,并影响肾透明细胞癌的增殖。结论:EMMPRIN在肾肿瘤组织和肾癌细胞株中皆呈现出过表达的状态。下调其表达可以降低肾细胞癌的增殖水平,表明EMMPRIN的高表达可能是肾细胞癌患者预后较差的指标,可被视为肾癌治疗的潜在靶点。     

MicroRNA-490-5p靶向CDK1通过ERK信号通路参与胃癌细胞周期调控

目的:探讨miR-490-5p对胃癌细胞增殖与周期的调控作用和分子机制,以期为临床治疗胃癌提供新的有效靶点.方法:收集30例胃癌患者的胃癌组织及相应的癌旁组织标本;采用Real-time PCR法检测miR-490-5p和CDK1的表达水平;分析细胞周期相关蛋白 CDK1 与 miR-490-5p 的靶向关系.MTT法和流式细胞仪检测转染后胃癌细胞生长以及细胞周期情况.结果:与癌旁组织相比,胃癌组织中miR-490-5p的表达显著下调(P<0.001);转染 miR-490-5p mimics 的细胞中miR-490-5p的表达显著上调,而miR-490-5p inhibitors中miR-490-5p显著下降(均P<0.001);CDK1 是 miR-490-5p 的靶基因;下调miR-490-5p、上调CDK1能促进胃癌细胞的增殖能力及G1/S期的转化(均P<0.001).结论:通过上调miR-490-5p 可以抑制胃癌细胞的恶性增殖,减少CDK1表达,抑制 ERK信号途径,降低了G1/S期的转化速率,从而为胃癌诊断及治疗提供新靶标.     

TET1对肾癌786-O细胞增殖的影响及其相关机制

目的:应用小干扰RNA(small interferingRNA,siRNA)沉默TET1(ten-eleven translocation1)基因表达,探索其对人肾癌786-O细胞增殖的影响及其可能的机制。方法:采用脂质体转染法将靶向TET1基因的TET1-siRNA转染人肾癌786-O细胞,实验设空白对照组、阴性对照组和干扰组(TET1-siRNA组)。分别采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测转染TET1-siRNA后,786-O细胞中TET1、SUZ12(suppressor of zeste12)、EZH2(enhancer of zestehomolog 2)和EED(embryonic ectoderm development)mRNA及其蛋白的表达;MTT法和克隆形成实验检测786-O细胞的增殖活性和克隆形成率;FCM检测786-O细胞周期。结果:与空白对照组比较,转染TET1-siRNA后,786-O细胞中TET1 mRNA及其蛋白的表达水平分别下降了(85.13±0.03)%和(56.41±0.09)%,差异有统计学意义(P<0.05);786-O细胞的增殖受到抑制,克隆形成能力明显下降,G0/G1期细胞百分比明显增加(P<0.05);SUZ12 mRNA及其蛋白表达水平下调(P<0.05),EED和EZH2蛋白表达水平变化不明显(P>0.05)。结论:TET1-siRNA可显著下调肾癌786-O细胞中TET1蛋白的表达水平,明显抑制786-O细胞的增殖,并使细胞阻滞于G1期,其机制可能与TET1调控SUZ12的表达,影响其靶基因对PRC2(polycomb repressive complex 2)的招募有关。     

siRNA干扰FLOT2基因表达对肾细胞癌细胞增殖的影响

目的:探讨FLOT2在肾细胞癌细胞株中的表达,并观察小干扰RNA沉默FLOT2基因对肾细胞癌786-O细胞增殖能力的影响。方法:将化学合成的FLOT2的小干扰siRNA用脂质体 Lipofectamine2000转染至肾细胞癌786-O细胞;分别用RT-PCR、Western blot方法检测细胞转染前后FLOT2以及细胞增殖相关因子CCND1的表达。CCK-8与克隆形成实验检测其增殖情况。结果:转染FLOT2-siRNA的肾细胞癌786-O细胞,RT-PCR、Western blot检测显示FLOT2在基因及蛋白水平明显下调（P<0.05）;与对照组比较786-O细胞增殖能力明显下降（P<0.05）,细胞增殖相关因子CCND1明显下调（P<0.05）。结论:FLOT2在肾细胞癌细胞系中高表达,采用特异性FLOT2-siRNA 能够显著降低FLOT2和CCND1表达。干扰FLOT2表达能显著抑制786-O细胞的增殖,FLOT2基因可能参与了肾细胞癌的生物学行为。     

KAI1/CD82通过Wnt/β-catenin通路对肾癌调控机制的研究

目的:检测KAI1/CD82和p-catenin在肾癌组织及细胞中的表达情况,探讨KAI1/CD82通过Wnt/β-catenin通路对肾癌的调控机制.方法:通过Western blotting检测我院近2年收集的30例肾癌及癌旁组织中CD82及β-catenin的表达;构建KAI1/CD82低表达质粒,转染肾透明细胞癌细胞系786-0和OSRC,划痕实验检测细胞迁移能力;CCK-8法检测细胞增殖能力;Transwell检测细胞侵袭能力;Western blotting检测β-catenin、Axin2、GSK-3β的表达.结果:肾癌组织中CD82表达低于癌旁组织,β-catenin的表达高于癌旁组织.PLTHR-SHKAI1质粒转染786-0和OSRC后,肾癌细胞的迁移、增殖、侵袭能力增强,β-catenin表达增高,Axin2、GSK-3β表达降低.结论:KAI1/CD82和β-catenin在肾癌组织中表达负相关,KAI1抑制肾癌细胞的迁移、增殖、侵袭能力;KAI1/CD82通过Wnt/β-catenin通路相关上游蛋白调控肾癌的发生、发展和转移.     

siRNA对胃癌细胞增殖抑制及其机制的探讨

目的:探讨siRNA对胃癌BGC823和MGC803细胞中Cullin1 (Cul1)基因表达、细胞增殖的影响及其分子作用机制.方法:体外化学合成Cul1 siRNA序列,在siLentFect Lipid Reagent介导下转染2种胃癌细胞.蛋白质印迹法检测Cul1、Cyclins和CDK抑制剂蛋白表达,CCK8法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞周期.结果:转染Cul1 siR-NA后胃癌BGC823和MGC803细胞中Cul1蛋白表达分别下调39％和84％,Cyclin D1下调59％和62％,Cyclin E下调47％和54％,而p27蛋白表达上调52％和23％,但p21蛋白表达无明显变化.Cul1干涉后24h2种胃癌细胞的增殖能力下降(P＜0.01),48和72 h下降更明显,P＜0.01.Cul1干涉后3和6 hG1期细胞比例较对照组下降缓慢(P＜0.01),而Sub-G1期Cul1干涉组与对照组差异无统计学意义.结论:Cul1 siRNA可有效的干涉胃癌BGC823和MGC803细胞中Cul1基因的表达,Cul1干涉后可能通过影响Cyclins和CDK抑制剂蛋白表达从而使细胞周期停滞在G1期,最终能明显抑制胃癌细胞的增殖.     

沉默EZH2基因表达对肾癌细胞生物学行为的影响

目的 研究RNA干扰靶向沉默EZH2基因表达对ACHN肾癌细胞株增殖、细胞周期和凋亡的影响。方法 应用Western blot法检测EZH2蛋白在人正常近端肾小管上皮细胞株HK-2和肾癌细胞株786-0和ACHN中的表达。脂质体法介导化学合成EZH2 siRNA转染ACHN细胞株,Western blot法检测转染后ACHN细胞EZH2蛋白的表达情况,CCK-8法检测转染后ACHN细胞增殖率,流式细胞术检测转染后ACHN细胞周期分布和凋亡情况。结果 肾癌细胞株786-0和ACHN中EZH2蛋白的表达水平明显高于人正常近端肾小管上皮细胞HK-2。RNA干扰EZH2基因可成功地敲减ACHN细胞EZH2蛋白的表达。EZH2-siRNA干扰后,实验组ACHN细胞生长明显受抑制,在转染后48和72 h细胞增殖受抑制效应著（P＜0.05）。细胞周期分析显示：siEZH2转染组G1期ACHN细胞比例呈增加趋势,而S期和G2期细胞比例呈减少趋势,其中在转染后48h G1期ACHN细胞比例显著增加,而S期和G2期细胞比例明显下降（P＜0.05）;凋亡分析显示：siEZH2转染组ACHN细胞凋亡率随转染后时间的延长而呈增加趋势,在转染后48和72 h细胞凋亡率增加最显著（P＜0.05）。结论 沉默EZH2基因表达可靶向肾癌ACHN细胞周期中G1/S限制点而阻滞细胞周期进展,同时可有效抑制肾癌细胞增殖和促进细胞凋亡。     

MLK4低表达调控ROS/MAPKs信号通路诱导肾细胞癌细胞凋亡的机制研究

目的:观察MLK4低表达是否通过调控ROS/MAPKs信号通路诱导肾细胞癌细胞凋亡。方法:利用qRT-PCR和Western blot方法检测MLK4在人正常近端肾小管上皮细胞HK-2和肾细胞癌细胞系786-0中的表达情况；脂质体Lipofectamine 3000转染MLK4 siRNA（si-MLK4）至786-0细胞系后用qRT-PCR和Western blot两种方法检测肾细胞癌细胞系中MLK4的沉默效率；CCK-8和Ki-67方法检测si-MLK4对786-0细胞系增殖的影响，Transwell 方法检测si-MLK4对786-0细胞系迁移的影响，流式细胞术检测si-MLK4对786-0细胞系凋亡的影响，DCF-DA分析法检测si-MLK4对786-0细胞系ROS水平的影响，同时利用Western blot方法检测MAPKs信号通路的改变情况。结果:qRT-PCR和Western blot结果显示MLK4在人肾细胞癌细胞系786-0中表达量明显高于人肾皮质近曲小管上皮细胞HK-2；qRT-PCR和Western blot结果显示:相对于si-NC组，si-MLK4转染人肾细胞癌细胞系后MLK4在mRNA和蛋白水平表达量均降低；CCK-8和Ki-67结果显示si-MLK4抑制人肾细胞癌细胞系786-0增殖，Tranwell结果显示si-MLK4抑制人肾细胞癌细胞系786-0迁移，而流式细胞术结果显示si-MLK4促进人肾细胞癌细胞系786-0凋亡；DCF-DA分析结果发现si-MLK4促进人肾细胞癌细胞系786-0 ROS的产生，Western blot结果显示:p38、p-ERK1/2、p-JNK磷酸化水平明显增加，提示si-MLK4通过ROS/MAPKs信号通路诱导人肾细胞癌细胞系786-0的凋亡。结论:si-MLK4通过ROS/MAPKs信号通路诱导人肾细胞癌细胞系786-0的凋亡，提示MLK4可作为预防肾细胞癌发生发展的靶点，为治疗肾细胞癌提供了新的理论基础和思路。     

针对 DNMT3多靶点 siRNA 的构建及对肾细胞癌786-0细胞的影响

目的：设计、验证针对 DNA 甲基化转移酶3家族同源保守区域的多靶点 siRNA,体内、外评价同时沉默 DNMT3对肾细胞癌增殖、侵袭能力的影响。方法：基于 DNMT3A/3B 的同源保守区域,设计制作针对二者同源区域的2对 siRNA 序列（siDNMT3A/ B -1及 siDNMT3A/ B -2）,以 Western 印迹法验证沉默效率。转染肾细胞癌786-0细胞系后,分别以体外、体内实验验证其对于肾细胞癌增殖、侵袭能力的影响。结果：针对DNMT3A/ B 同源保守区 siRNA 序列,能够显著降低 DNMT3A 及3B 的蛋白表达,并可以显著降低786-0细胞划痕迁移、增殖、侵袭能力,其侵袭、增殖关键基因（Ki -67、Vimentin、VEGF、CD31、MMP2）表达显著下调。体内研究证实,敲除组小鼠皮下瘤生长速度显著降低伴总体生存率显著延长（P <0.05）,且皮下瘤内侵袭、增殖关键基因表达显著下调（P <0.05）。结论：基于 DNMT3同源保守区域可获得多靶点有效 siRNA;靶向下调肾细胞癌786-0细胞系 DNMT3A 及3B 表达能够显著降低细胞增殖、侵袭能力;靶向 DNMT3是肾细胞癌治疗的潜在靶点。     

Sunitinib activates Axl signaling in renal cell cancer

Mass spectrometry‐based phosphoproteomics provides a unique unbiased approach to evaluate signaling network in cancer cells. The tyrosine kinase inhibitor sunitinib is registered as treatment for patients with renal cell cancer (RCC). We investigated the effect of sunitinib on tyrosine phosphorylation in RCC tumor cells to get more insight in its mechanism of action and thereby to find potential leads for combination treatment strategies. Sunitinib inhibitory concentrations of proliferation (IC50) of 786‐O, 769‐p and A498 RCC cells were determined by MTT‐assays. Global tyrosine phosphorylation was measured by LC‐MS/MS after immunoprecipitation with the antiphosphotyrosine antibody p‐TYR‐100. Phosphoproteomic profiling of 786‐O cells yielded 1519 phosphopeptides, corresponding to 675 unique proteins including 57 different phosphorylated protein kinases. Compared to control, incubation with sunitinib at its IC50 of 2 µM resulted in downregulation of 86 phosphopeptides including CDK5, DYRK3, DYRK4, G6PD, PKM and LDH‐A, while 94 phosphopeptides including Axl, FAK, EPHA2 and p38α were upregulated. Axl‐ (y702), FAK‐ (y576) and p38α (y182) upregulation was confirmed by Western Blot in 786‐O and A498 cells. Subsequent proliferation assays revealed that inhibition of Axl with a small molecule inhibitor (R428) sensitized 786‐O RCC cells and immortalized endothelial cells to sunitinib up to 3 fold. In conclusion, incubation with sunitinib of RCC cells causes significant upregulation of multiple phosphopeptides including Axl. Simultaneous inhibition of Axl improves the antitumor activity of sunitinib. We envision that evaluation of phosphoproteomic changes by TKI treatment enables identification of new targets for combination treatment strategies.     

APE1表达变化对人非小细胞肺癌细胞A549增殖的影响

目的:探讨脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1,APE1)对人非小细胞肺癌细胞A549增殖能力的影响,为肺癌的个性化靶向治疗提供理论依据。方法:使用脂质体转染法将重组表达质粒pSIREN-RetroQ-APE1-shRNA和pOZN-HA-APE1导入A549细胞,免疫印迹检测APE1表达情况。MTT、平板克隆实验、免疫印迹检测APE1对非小细胞肺癌细胞增殖的影响,流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果:重组载体pSIREN-RetroQ-APE1-shRNA转染细胞后,显著抑制A549细胞中APE1蛋白的表达,与对照组相比,增殖速率明显下降(P＜0.05),平板克隆形成显著减少(P＜0.05),并阻止细胞周期G0/G1期向S期转化,降低CDK2表达。而过表达APE1可增加A549细胞活力,促进细胞增殖,促进细胞周期G0/G1期向S期转化。结论:APE1表达下调对非小细胞肺癌细胞A549生长具有抑制作用,为临床抑制肿瘤生长提供了新的作用靶点。     

姜黄素诱导激活FOXO3a促进肾透明细胞癌细胞的增殖抑制和细胞凋亡

目的:研究姜黄素(curcumin)对人肾透明细胞癌（clear-cell renal cell carcinoma,ccRCC）细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用,及叉头框蛋白O3a（Forkhead box protein O3a,FOXO3a）在姜黄素抗肿瘤效应中发挥的关键作用。方法:MTT法用于检测姜黄素对ccRCC细胞活力的抑制作用;Annexin V/PI双染实验检测姜黄素对ccRCC细胞的诱导凋亡作用;免疫印迹法（Western blot,WB）检测姜黄素对FOXO3a、p-FOXO3a及下游BIM表达的影响,和凋亡蛋白caspase 3的激活情况。实时荧光定量PCR技术（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测FOXO3a转录水平。小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）技术用于沉默ccRCC细胞系中FOXO3a的表达。结果:通过对6种ccRCC细胞系（ACHN、786-O、769-P、A-498、Caki-1及Caki-2）FOXO3a蛋白基础表达水平进行检测,选取FOXO3a表达较高的786-O细胞系为研究对象。0~160 μmol/L姜黄素处理786-O细胞24 h和48 h后,呈时间和浓度依赖性对细胞活力具有显著抑制作用;786-O细胞在0~80 μmol/L姜黄素处理24 h后,明显促进细胞凋亡水平,且伴随着凋亡相关蛋白caspase 3的激活。786-O细胞中,姜黄素抑制p-FOXO3a,促进FOXO3a活化,并上调下游BCL-2家族促凋亡蛋白BIM表达水平。在siRNA沉默FOXO3a蛋白表达后,姜黄素对786-O细胞的生长抑制和诱导凋亡作用被抑制。结论:姜黄素通过诱导激活FOXO3a,在ccRCC细胞上发挥生长抑制和诱导凋亡的抗肿瘤作用。