B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白在果蝇细胞中的表达与纯化

目的获得高纯度B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白（HBx蛋白）。方法PCR扩增获得B、C基因型乙型肝炎病毒X基因,以AgeⅠ及BglⅡ位点将其克隆入果蝇表达载体pMT/BiP/V5/HisC。重组载体与筛选质粒pCoBlast以脂质体Cellfectine共转染果蝇S2细胞,25μg/ml Blasticidin筛选多克隆抗性细胞株。扩增细胞以CuSO4诱导HBx蛋白表达,Western blot鉴定表达产物并确定最佳蛋白表达时间和诱导浓度。200 ml大规模培养细胞并诱导表达,一步法及两步法分别纯化B、C基因型HBx蛋白。结果成功构建重组表达载体pMT/BiP-HBxb（含B基因型HBx基因）和pMT/BiP-HBxc（含C基因型HBx基因）。在果蝇S2细胞中,B、C基因型HBx蛋白与6×His融合表达（分别为HBxb-His及HBxc-His）,在CuSO4诱导后72 h以及诱导浓度为500μmol/L~1 mmol/L时蛋白表达量最高。在200 ml培养液中,一步法纯化所得HBxb-His及HBxc-His蛋白总量分别为1.52和1.37 mg,纯度为85.23%和84.59%;二步法所得的HBxb-His及HBxc-His蛋白总量分别为5.38和6.42 mg,纯度分别为95.36%和94.62%。结论在果蝇表达系统中表达并获得高纯度B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白,为进一步探讨结构和功能的关系奠定了基础。     

CCL3L1基因对HIV易感性和感染进程的影响

不同个体暴露于人类免疫缺陷病毒（HIV）后是否被感染及感染后的疾病自然进程差异较大。10年来研究发现，有些趋化因子及其受体基因的多态性可显著影响HIV易感性和感染进程,主要包括CCR5A32、CCR5、CCR264I、CX3CR1、CXCLl2（SDF-1）、CCL2（MCP-1）、CCL3L1。其中类1型CC-趋化因子配体3（CCL3L1）基因是新近发现的对HIV易感性有影响的基因，受到人们的广泛关注。     

抗人CCR5多克隆抗体体外阻断HIV-1假病毒感染的研究

目的制备鼠抗人CC型趋化因子受体5(CCR5)特异性Ⅰ型艾滋病病毒(HIV-1)中和抗体。方法用稳定表达人CCR5的CHO-R5细胞腹腔免疫BALB/c小鼠;流式细胞术的方法分析免疫血清对GHOST-R5细胞的结合;纯化免疫血清总IgG抗体,HIV-1假病毒中和试验分析血清总IgG的中和活性。结果流式细胞术的结果显示,CHO-R5细胞免疫组小鼠血清,对GHOST-R5结合的平均荧光强度显著高于对照组(P0.001);HIV-1假病毒中和试验的结果发现,纯化的CHO-R5细胞组小鼠免疫血清总IgG,可抑制HIV-1假病毒在体外感染GHOST-R5细胞,抑制作用具有剂量依赖性,最高抑制率达到92%。结论成功诱导出具有中和HIV-1活性的鼠抗人CCR5的多克隆抗体。     

新生儿单个核细胞表达CCR5受体及C-C趋化因子能力的观察

研究影响新生儿对HIV-1感染的免疫特点对减少儿童人类免疫缺陷病毒／艾滋病(HIV／AIDS)，阻断HIV-1母婴传播有着重要意义。对于大多数亚型的HIV-1，在病程早期主要利用CCR5趋化因子受体入侵靶细胞，而单个核细胞(包括淋巴细胞和单核细胞)分泌的3种C-C趋化因子：受激活调节的正常T细胞表达和分泌因子(RAN-TES)、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α)和MIP-1β，     

趋化因子受体CCR2、CCR5及其配体巨噬细胞炎性蛋白-1α在小鼠克罗恩病模型中表达的研究

背景：趋化因子受体及其配体是白细胞聚集的关键因素，可介导淋巴细胞聚集到正常的小肠。目的：研究趋化因子受体CCR2、CCR5及其配体巨噬细胞炎性蛋白（MIP）-1α小鼠克罗恩病（CD）肠黏膜固有层单个核细胞（LPMC）中的表达，探讨炎症性肠病（IBD）发生、发展的分子机制。方法：健康雄性BALB／c小鼠20只，随机分为对照组和模型组。模型组小鼠以三硝基苯磺酸（TNBS）灌肠造模。5d后处死，提取和培养LPMC．采用流式细胞仪测定小鼠LPMC中趋化因子受体CCR2、CCR5的表达；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测培养上清液中MIP-1α分泌：采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测MIP-1αRNA的表达。结果：小鼠CD模型组LPMC中CCR2、CCR5阳性CD4＋细胞比例显著高于对照组（P〈0．05）；LPMC原代培养后，模型组上清液MIP-1α分泌显著高于对照组（P〈0．05）；模型组MIP-1αRNA的表达显著高于对照组（P〈0．05）。结论：趋化因子受体CCR2、CCR5及其配体MIP-1α在小鼠CD的LPMC中表达增高，可能参与了CD的免疫应答和炎症反应。     

病毒性心肌炎中树突状细胞的体内迁移及机制

目的观察树突状细胞（DCs）在小鼠急性病毒性心肌炎（VMC）中的迁移途径及趋化因子的作用。方法雄性Balb／c小鼠随机分为正常对照组60只和VMC组80只。VMC组腹腔注射柯萨奇B组病毒（CVB3）,正常组腹腔注射等容积不含病毒的EMEM液。趋化实验分析DCs对CCL4、CCL19的趋化反应;检测心肌组织中DCs相应的趋化因子CCL4、CCL19及其受体CCR5、CCR7的表达变化以及脾脏中CCL19和CCR7的表达情况。DCs体外感染CVB3后检测CCR5和CCR7表达。结果VMC组DCs对趋化因子CCL4、CCL19的趋化反应能力增强（P〈0．05）;VMC组心肌组织中CCR5和CCR7及CCL4和CCL19表达增加（P〈0．05）,脾脏中CCR7和CCL19表达均增加（P〈0．05）。DCs体外感染CVB324小时后CCR5和CCR7表达明显上升。结论DCs在急性病毒性心肌炎小鼠体内发生定向迁移,和趋化因子与趋化因子受体相互作用有关。     

人TIM-3的克隆表达及其单克隆抗体的制备

目的 构建人TIM-3融合蛋白原核表达载体，获取蛋白质抗原．制备抗人TIM-3单克隆抗体。方法 通过特异性引物从人外周血单个核细胞中扩增出hTIM-3cDNA，细胞膜外基因克隆到原核表达载体pQEIOOS中，转化到E．coliBL21（DE3），表达并纯化带6个组氨酸的融合蛋白．免疫BALB／c小鼠，应用杂交瘤技术经克隆筛选获得抗人TIM-3单抗的杂交瘤细胞株，以间接酶链反应吸附测定（ELISA）和WesternBlot等方法进行单克隆抗体的鉴定。结果 人TIM-3cDNA经DNA测序得到证实．成功构建了pQE100S—hTIM-3原核表达载体，表达并纯化了大量蛋白质抗原，获得了1株稳定分泌抗人TIM-3单抗的杂交瘤细胞株（28H12），Western Blot分析证明hTIM-3蛋白在转染的CHO细胞中高表达。结论 成功构建了人TIM-5融合蛋白原核表达载体，表达并纯化了6xHis—hTIM-5融合蛋白．所获单抗能特异识别人TIM-3蛋白，为进一步研究人TIM-3及其配体的功能提供了条件。     

趋化因子CCL20及其受体CCR6在急性坏死性胰腺炎中的表达及意义

目的 探讨CC趋化因子配体20(CCL20)和CC趋化因子受体6(CCR6)在实验性急性坏死性胰腺炎(ANP)发病机制中的作用.方法 48只SD大鼠按完全随机法分为ANP组和对照组.采用胆胰管逆行注射4%牛磺胆酸钠建立大鼠ANP模型,以注射等容积生理盐水作为对照组.术后1、3、6、12 h分批处死大鼠,取血检测血清淀粉酶,胰腺组织常规病理检查并评分,免疫组化和RT-PCR检测胰腺组织中CCL20、CCR6 mRNA及蛋白表达.结果 ANP大鼠血清淀粉酶和胰腺组织病理评分明显高于对照组.ANP组术后胰腺组织CCL20 mRNA及蛋白表达呈时间依赖性增强(P＜0.05);术后6 h胰腺组织中CCR6 mRNA明显高于对照组(0.88±0.05对0.23±0.09,P＜0.01),术后12 h CCR6mRNA表达较6 h时降低,但仍高于对照组(0.37±0.10对0.15±0.07,P＜0.05),CCR6蛋白变化与其mRNA变化一致.结论CCL20和CCR6参与ANP的发生和发展.     

老年乳腺癌患者外周血趋化因子及其受体的表达

目的分析老年乳腺癌病人外周血趋化因子以及趋化因子受体表达的变化。方法随机抽选45例老年乳腺癌患者为研究对象(研究组),同期抽选45例健康老年人为对照组,用酶联免疫吸咐法(ELISA)检测两组患者血清中白介素(IL)-8、趋化因子CCL20、正常T细胞表达以及分泌物因子(RANTES)、细胞趋化蛋白(MCP)-1等趋化因子的水平变化。采用流式细胞仪分析同时对外周血CD3+T淋巴细胞表面CXCR1、CCR6、CCR5、CCR2等趋化因子受体表达的变化。结果研究组血清IL-8〔(4.6±1.7)vs(4.3±1.6)pg/ml〕、CCL20〔(10.9±5.5)vs(5.3±5.3)μg/L〕、RANTES〔(28.6±8.2)vs(13.7±7.5)μg/L〕、MCP-1〔(139.6±16.6)vs(125.7±15.4)pg/ml〕等趋化因子的含量明显高于对照组(P<0.05);两组外周血CD3+T细胞表面CXCR1、CCR6、CCR5、CCR2等趋化因子受体表达无显著性差异(P>0.05)。结论乳腺癌患者外周血中IL-8、CCL20、RANTES、MCP-1等趋化因子浓度可作为理想的乳腺癌转移预测指标,CCL20、RANTES异常升高在乳腺癌的发病及进展中可能发挥着作用,IL-8、MCP-1高表达则可能预示着预后较差。     

弥漫增生型狼疮肾炎患者趋化因子及其受体的表达

目的 了解弥漫增生型狼疮肾炎(LN)患者趋化因子MCP-1、CCL19、CXCL9、CXCL10和趋化因子受体CCR2、CCR7、CXCR3的表达,探讨趋化因子及其受体在LN发病中的作用.方法 ①同步收集12例弥漫增生型LN患者肾组织和外周血,抽提总RNA并反转录为cDNA,以实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)方法 检测趋化因子基因MCP-1、CCL19、CXCL9、CXCL10和趋化因子受体基因CCR2、CCR7、CXCR3的表达水平.②应用免疫荧光抗体标记、激光扫描共聚焦显微镜技术观察患者肾组织趋化因子MCP-1、CCL19、CXCL9和CXCL10的表达.结果 弥漫增生型LN患者趋化因子基因MCP-1、CCL19、CXCL9和CXCL10 mRNA在肾脏组织和外周血的表达呈同步增高趋势,4种趋化因子蛋白在肾小球的表达显著增高.趋化因子受体CCR2和CXCR3在LN患者外周血高表达.结论 趋化因子MCP-1、CCL19、CXCL9和CXCL10外周血表达水平可能做为评估狼疮患者肾脏病变的生物学标记.阻断趋化因子与其相应受体的结合将可能减轻患者的临床症状、改善预后.     

甲型H1N1流感合并肺炎的临床特点分析

目的通过对甲型H1N1流感合并肺炎的临床特点的分析。方法分析2009年月10月-2010年3月在我院入住的29例甲型H1N1流感合并肺炎患者的临床表现、实验室检查及胸部CT等资料。结果本组病例男性16例,女性13例。3例妊娠,13例合并有基础疾病。所有病例均有流感样前驱症状,呼吸道主要症状为发热、干咳少痰,严重者气短、呼吸困难、咯血。合并细菌感染时咯脓痰。肺部听诊无啰音或少啰音,合并哮喘时有哮鸣音,合并细菌感染时可有湿啰音。实验室检查65%白细胞不高或降低,41%心肌酶升高,58.6%存在低氧血症,35%呼吸衰竭。影像学表现多种多样：65.5%主要为单侧或双侧棉团样、团片样边界模糊高密度渗出影伴肺实变,其内见充气支气管征,病变沿支气管血管束分布。轻症及早期较局限,重症者及晚期病变融合呈双肺多发弥漫性改变。少数呈大叶及小叶性肺炎表现。预后大多良好,病死率6.9%。主要死亡原因为呼吸衰竭及大咯血。结论甲型H1N1流感合并肺炎是以甲型H1N1流感病毒肺炎为主要疾病的多种肺炎构成。甲型H1N1流感病毒肺炎临床表现具有流感病毒肺炎共性特点,其影像学表现有一定特征性。     

代谢酶基因CYP 1A1与广西胃癌遗传易感性的关系

目的探讨代谢酶基因CYP 1A1MSP1多态性与广西地区汉族、壮族人群胃癌遗传易感性之间相关性。方法采用PCR-RFLP技术检测广西地区汉族、壮族人群中121例胃癌患者和138例健康人CYP1A1MSP1多态性的分布频率,分析其与广西地区汉族、壮族人群胃癌遗传易感性的相关性及与吸烟、饮酒在胃癌易感性中的相互作用。结果 (1)CYP 1A1MSP1三种基因型(m1/m1、m1/m2、m2/m2)分布频率在两组间比较差异无统计学意义(χ2=0.901,P=0.342);(2)携带CYP1A1MSP1突变m2基因型的个体较携带m1/m1基因型的个体患胃癌的风险增加(OR=1.509),但差异无统计学意义(P=0.342)。结论单独的CYP 1A1基因MSP1多态性与广西地区汉族、壮族人群胃癌易感性无明显相关性。     

Trp-21 is important in the processing and secretion of big endothelin-1

To investigate the intracellular processing of endothelin-1 (ET-1), the synthesis and secretion of preproET-1 (PPET-1) was studied in transiently transfected COS-7 cells. Replacements at the highly conserved C-terminal region of ET-1 were made by site-directed mutagenesis, with codons for residues Ile-20 and Trp-21 being replaced by one for Ala in the PPET-1 cDNA. The mutant and wildtype PPET-1 cDNAs were expressed in COS-7 cells following transient transfection, and cell media and extracts, collected after 48 h, were assayed for ET-1 and big ET-1 by radioimmunoassay. The concentration of immunoreactive ET-1 in the medium obtained from the Ala-21-ET-1 mutant was 10-fold lower than that from PPET-1 wildtype and (Ala-20-ET-1) PPET-1 transfected cells. Moreover, Ala-21 -big ET-1 accumulated in the cells transfected with the cDNA for (Ala-21-ET-1) PPET-1, whereas there was no significant accumulation of ET-1-like or big ET-1-like immunoreactivity in the cells transfected with cDNAs for PPET-1 wildtype and (Ala-20-ET-1) PPET-1. These results suggest that Trp-21 is involved in intracellular processing and secretion of big ET-1.     

One SUMO is sufficient to silence the dimeric potassium channel K2P1

Small ubiquitin modifier 1 (SUMO1) is shown to regulate K2P1 background channels in the plasma membrane (PM) of live mammalian cells. Confocal microscopy reveals native SUMO1, SAE1, and Ubc9 (the enzymes that activate and conjugate SUMO1) at PM where SUMO1 and expressed human K2P1 are demonstrated to colocalize. Silent K2P1 channels in excised PM patches are activated by SUMO isopeptidase (SENP1) and resilenced by SUMO1. K2P1-Lys274 is crucial: when mutated to Gln, Arg, Glu, Asp, Cys, or Ala, the channels are constitutively active and insensitive to SUMO1 and SENP1. Tandem mass spectrometry confirms conjugation of SUMO1 to the ε-amino group of Lys274 in vitro. FRET microscopy shows that assembly of K2P1 and SUMO1 requires Lys274. Single-particle TIRF microscopy shows that wild-type channels in PM have two K2P1 subunits and assemble with two SUMO1 monomers. Although channels engineered with one Lys274 site carry just one SUMO1 they are activated and silenced by SENP1 and SUMO1 like wild-type channels.     

Notch/Jagged信号在肝部分切除后肝再生中的表达

目的研究Notch/Jagged信号传导通路在大鼠肝部分切除术后肝再生中所起的作用。方法取雌性wister大鼠行肝部分切除术,术后0 min、5 min、15 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、4 d、7 d留取再生肝组织,观察大体组织变化,检测Notch-1和Jagged-1蛋白的表达,并通过RT-PCR检测Notch-1和Jagged-1的mRNA的表达。结果再生肝Notch-1蛋白第2 d在门脉周围细胞表达增强,第4 d在肝血窦内皮细胞表达增强,Jagged-1在正常肝脏标本中在胆管分布,在肝细胞也有少量表达。在再生的肝上,第2 d在门脉周围的肝细胞上较强地表达,第4 d在胆管内皮细胞表达增强。Notch-1的mRNA表达量在6 h-2 d下调,Jagged-1的mRNA表达量在3-6 h上调,12 h-2 d下调,4 d恢复。统计学处理采用方差分析方法、t检验及直线相关方法（P〈0.05）。结论Notch/Jagged信号通路的激活在肝再生中扮演着重要的角色。它可以促进胆管的形成和结构维持,有助于新生血管的形成及肝细胞的增殖。     

肿瘤-睾丸抗原MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA在胃肠间质瘤中的表达

目的:探讨肿瘤-睾丸抗原(CTA)MAGE-1和NY-ESO-1作为胃肠间质瘤(GISTs)免疫治疗特异性靶点及MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA作为辅助GISTs危险度分级指标的可能性.及其与GISTs生物学行为的关系.方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,检测30例GISTs中MAGE-1和NY-ESO-1mRNA的表达,并取正常胃肠道组织作为阴性对照组,同时分析MAGE-1和NY-ESO-1mRNA表达与病理特征的关系.结果:正常对照组中无阳性表达,30例GISTs中,18例至少表达一种CTA,MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA在GISTs中的表达率分别为30%和47%.MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA表达与患者年龄、性别和病理类型无关,而与肿瘤生长部位、肿瘤大小及危险度分级有关(P<0.05).MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA在低危、中危、高危三个组中表达量随着危险度分级的升高而增高,三组间差异有统计学意义(P<0.05).MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA在GISTs中的表达不存在相关性(r=0.018,P>0.05).结论:MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA在GISTs中的高特异性表达,其抗原有望成为GISTs免疫治疗特异性的靶点:MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA表达与GISTs危险度分级有关,MAGE-1和NY-ESO-1 mRNA有望成为辅助GISTs危险度分级的诊断指标.     

SF-1和DAX-1在发育内分泌学的研究进展

核受体的作用极其广泛 ,类固醇生成因子 1(SF 1)和剂量敏感的性别转换综合征和先天性肾上腺发育不良症的关键基因 1(DAX 1)两种核受体家族是近年来发育内分泌学研究的热点之一 ,通过SF 1和DAX 1的动物模型及人类基因突变表现型阐述了在胚胎早期性发育和性分化中SF 1和DAX 1的作用可能通过相同途径相互拮抗 ,在垂体促性腺细胞和肾上腺能细胞中 ,两者在细胞及组织中的分布一致 ,通过下丘脑对垂体 性腺轴及垂体 肾上腺轴发育过程中不同时期的各个环节进行调控 ,本文对SF 1和DAX 1在内分泌器官发育过程中的分布、结构及其作用进行综述。