磷脂转运蛋白在毕赤酵母中的高效表达

为深入了解磷脂转运蛋白的结构和功能，从中国人胎肝组织总RNA成功克隆了磷脂转运蛋白成熟肽基因，所得磷脂转运蛋白基因通过同源重组整合至毕酵母细胞染色体的氧化酶AOX1基因中，甲醇诱导后经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示诱导表达蛋白分子量约为75kDa，薄层扫描显示表达蛋白中酵母蛋白总量的28%，为大量制备重组磷脂转运蛋白奠定了基础。     

严重急性呼吸综合征冠状病毒核衣壳蛋白对环氧合酶-2表达的影响

目的 探讨严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)核衣壳蛋白对环氧合酶-2(COX-2)表达的影响.方法 将带有COX-2基因启动子的报告质粒分别与表达SARS-CoV基因组的单个基因的质粒共转染293T细胞,并测定荧光素酶的活性,采用RT-PCR和Western印迹法检测COX-2 mRNA和蛋白表达的变化.结果 SARS-CoV核衣壳蛋白能显著激活COX-2基因启动子的活性,并在mRNA和蛋白水平上调COX-2的表达,且这种激活作用随着核衣壳蛋白浓度的增加而增强.结论 SARS-CoV核衣壳蛋白能特异性地激活COX-2的表达.     

应用干扰RNA体外抑制严重急性呼吸综合征冠状病毒N基因的表达

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与严重急性呼吸综合征（SARS）冠状病毒N蛋白的融合表达载体pEGFP-C1-N以及针对SARS冠状病毒N基因的小发卡型shRNA表达载体pshRNAN，观察shRNA对SARS冠状病毒N基因复制和表达的影响。方法将构建成功的pEGFP-C1-N与psh RNA-N共转染293细胞，于转染后24、48、72h观察GFP表达的强弱，采用Western Blot分别检测GFP与N蛋白的表达，逆转录PCR检测N基因的mRNA。结果pshRNA—N作用组绿色荧光强度明显弱于未干扰组，Western Blot和逆转录PCR结果也证实pshRNA—N对N基因和N蛋白的表达有明显抑制作用，而无关序列的shRNA无此作用。结论针对SARS冠状病毒N基因的shRNA具有显著和特异的抑制N蛋白表达的作用。     

从棘突蛋白基因重组探讨严重急性呼吸综合征冠状病毒的来源

目的：探讨SARS冠状病毒（SARS-CoV）的起源。方法：运用生物信息学的方法，比较不同SARS样冠状病毒之间的异同，着重分析蝙蝠所携带的SARS样冠状病毒（SL-CoV）跨越种属屏障传播的可能性。结果：除编码棘突蛋白（S蛋白）基因外，SARS-coV与蝙蝠SL-CoV间编码结构蛋白的基因与编码复制酶的基因相似程度均很高；而S基因的差异主要集中在S1片段，且该片段的C,C含量与SARS-CoV基因组的C,C含量明显不同。进一步分析表明，由S1片段构建的冠状病毒进化树与由S2片段构建的进化树存在拓扑结构上的不平行性。结论：人类SARS病毒可能来源于蝙蝠SL—CoV，但在S基因内发生了基因重组事件，从而导致其获得跨越种属屏障传播的能力。     

流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2株E蛋白基因在原核细胞中的高效表达及其表达产物的抗原性分析

目的　获得JEVE蛋白基因并使其在E coli中高效表达 ,以研究其抗原活性 ,为进一步研制ELISA早期诊断试剂盒奠定基础。方法　根据已发表的JEVSA - 14 - 14 - 2减毒株序列 ,设计一对特异性引物 ,通过RT -PCR扩增出E蛋白基因的cDNA片段 ,并将其克隆入 pET - 32a(+)表达载体中 ,构建重组融合表达载体pET -E ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3)后 ,利用IPTG诱导获得高效表达。结果　扩增的E蛋白基因片段长 1113bp ,编码 371个氨基酸残基 ,该基因片段与国内发表的减毒株SA14 - 14 - 2碱基序列同源性为 10 0 %。表达产物分子量约为 6 2kD ,经Westernblotting分析表明表达产物具有较好的抗原性。结论　通过序列分析表明 ,我国的JEVSA - 14 - 14 - 2减毒株未发生基因突变。表达产物的稳定高效表达及其抗原特异性分析为今后ELISA早期诊断试剂盒的研制提供了依据。     

伯氏疏螺旋体外膜蛋白C基因在大肠杆菌中的表达

目的　体外表达伯氏疏螺旋体外膜蛋白Ｃ（ＯｓｐＣ） ,以制备基因工程重组抗原用于莱姆病血清学诊断研究。方法　应用聚合酶链反应技术和基因重组技术,从２ 个伯氏疏螺旋体中国分离株基因组ＤＮＡ 中扩增得到ＯｓｐＣ基因,分别克隆到表达载体ＬＫＢ２ 中,在大肠杆菌中进行表达。结果　以天然蛋白形式高效表达了ＯｓｐＣ。扫描分析显示,表达的ＯｓｐＣ 相对分子质量均在２３ ０００ 左右,表达量占菌体总蛋白的３４ ％ ～５０ ％ 。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 试验证明,重组ＯｓｐＣ 蛋白可与莱姆病患者血清发生特异性反应。结论　重组ＯｓｐＣ 的成功表达为制备新型莱姆病早期诊断试剂奠定了基础     

严重急性呼吸综合征患者血清中抗-SARS-CoV IgG、病毒RNA和N蛋白的动态变化

目前严重急性呼吸综合征（SARS）诊断主要是用免疫荧光法（IF）、酶联免疫吸附法（ELISA）和蛋白印迹法（WB）检测SARS-CoV特异性抗体和/或用逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）检测SARS-CoV RNA.虽然RT-PCR对早期诊断SARS是可靠的,但其检出率较低,仅为37.5%～50%[1,2].IF、ELISA和WB检测SARS特异性抗体的检出率虽可高达90%以上,但一般在发病后2～3周才能检测到[3-6].因此,其对SARS的早期诊断意义不大,只可用于SARS的回顾性诊断.     

新型冠状病毒刺突蛋白对单核巨噬细胞分泌炎症因子的影响

目的 探讨SARS-CoV-2对单核巨噬细胞分泌炎症因子的作用及机制。方法 纳入石家庄市第五医院2020年1月21日至2月10日以及2021年1月3日至1月7日住院的COVID-19确诊患者（病例组）与健康对照者（对照组）各53例,收集病例资料与血常规检测结果。采用SARS-CoV-2刺突蛋白刺激单核巨噬细胞,细胞增殖-毒性检测细胞活力,荧光定量PCR法检测炎症因子IL-6、IL-1β和CCL2与信号通路分子JAK1、STAT1和NF-κB的表达。结果 COVID-19患者的单核细胞比值与中性粒细胞比值高于对照组,而淋巴细胞比值、淋巴细胞计数、嗜酸性粒细胞比值、嗜酸性粒细胞计数与红细胞压积低于对照组。SARS-CoV-2刺突蛋白刺激单核巨噬细胞后,在100ng/ml与300ng/ml的浓度下细胞活力高于对照组（P=0.046）,在浓度为500ng/ml时IL-6、IL-1β与CCL2的mRNA表达含量最高（P<0.01,P=0.036,P <0.001）,在浓度100ng/ml时JAK1与STAT1的mRNA表达明显升高（P <0.001）,在300ng/ml与500...     

水分子通道蛋白-5在干燥综合征唇腺中的异常表达

目的研究干燥综合征（Sjoegren’s syndrome，SS）患者唇腺中水分子通道蛋白-5（aquaporin5，AQP5）mRNA和蛋白表达水平的改变。方法收集50例SS和20例对照组（非结缔组织病患者13例和无SS的结缔组织病患者7例）的唇腺活检标本。①提取唇腺组织中的总RNA，用反转录聚合酶链反应（RT—PCR）方法共扩增AQP5和3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的片段，计算AQP5／GAPDH吸光度（A）比值。②利用亲合纯化的山羊抗人AQP5抗体。将唇腺组织切片进行免疫组织化学染色，计算AQP5阳性腺泡率。③将各组结果进行Mann—Whitney检验，并与临床检验结果进行相关性分析。结果原发性干燥综合征患者唇腺中AQP5在mRNA水平的表达．与非结缔组织病组相比明显升高（P〈0．05），并与疾病病程呈正相关。SS患者，特别是原发性干燥综合征患者唇腺腺泡细胞腔面AQP5蛋白的表达，与非结缔组织病组相比明显降低（P〈0．05），并与唇腺淋巴细胞浸润灶评分呈负相关。结论SS患者唇腺AQP5的表达异常，提示在SS发病机制中，AQP5的转录、转运过程中某些环节可能发生了改变。     

锌指蛋白2在胰腺癌中的表达

目的 对锌指蛋白2(HZF2)在胰腺癌中的表达及意义进行初步的探讨.方法 收集20例手术病理证实的胰腺癌标本,应用RT-PCR检测锌指蛋白基因HZF2 mRNA的表达,并分析该表达与胰腺癌临床病理特征的关系.结果 胰腺癌组织中HZF2 mRNA表达值平均为143.1±12.2,较相应癌旁组织表达值82.2±7.6高1.40～2.34倍(P＜0.01).HZF2 mRNA的表达与TNM分期呈正相关,而与性别、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度无关.结论 锌指蛋白2在胰腺癌中高表达,在胰腺癌的发生发展中可能起一定作用.     

严重急性呼吸综合征患者外周血病毒载量和抗体水平动态监测

目的 动态监测严重急性呼吸综合征(SARS)患者外周血SARS病毒载量和抗体含量变化。方法 选择3例因同一传染源感染的SARS患者为研究对象，应用实时荧光定量逆转录，聚合酶链反应(RT—PCR)检测患者外周血PBMCs中病毒载量，用酶联免疫检测技术检测血清SARS病毒IgG、IgM含量。结果 3例患者分别在出现症状后第3～11日、第1～13日、第1～9日检测到SARS冠状病毒核酸，第5～7日病毒载量达到高峰。IgM抗体在患者起病后第7～9日即可被检测到，IgG抗体在患者起病后第7～14日即可被检测到，高峰在第10～20日。结论 SARS病毒载量存在自限性消长过程。SARS抗体IgG、IgM均较早出现，IgG维持时间比IgM长。     

凋亡抑制蛋白survivin在白血病细胞中的表达及其意义

目的探讨白血病原代细胞中凋亡抑制蛋白survivin基因的表达情况,及其与疗效的关系.方法应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测45例白血病患者和10例健康人骨髓中survivin的表达水平,并给与合适的方式化疗,评判疗效.结果白血病细胞中survivin mRNA 阳性率为68.9%（31/45）.急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞中survivin mRNA表达阳性率为73.3%,较急性髓系白血病（AML）的63.6%稍高;慢性粒细胞白血病（CML）患者中survivin mRNA 表达率很高,可达80.0%,慢性淋巴细胞白血病（CLL）中则为66.7%,但均高于正常对照组的20.0%（P＜0.05）.在22例AML患者中,survivin mRNA表达阴性者接受2个疗程化疗后缓解率（CR）87.5%,明显高于表达阳性患者的64.3%.在15例ALL患者中也有类似的结果,CR分别为100%和81.8%.CML患者中,survivin mRNA阳性的4例中有2例两年内发生急变;CLL患者病情均较稳定.结论survivin基因在白血病细胞中有较高的表达,并与疗效及预后有密切的关系.     

CD40抗原和生存素基因在急性髓性白血病细胞中表达及其临床意义

目的探讨急性髓性白血病(AML)细胞的CD40抗原和抗凋亡基因生存素(survivin)mRNA表达及其临床意义。方法应用流式细胞仪和逆转录-PCR方法检测48例初治AML患者细胞的CD40抗原和抗凋亡基因survivin mRNA表达,并结合AML患者临床特征进行分析。结果(1)48例AML患者中25例(52．1％)表达CD40抗原,35例(72．9％)表达survivin mRNA。(2)CD40^ AML组中脾肿大、血小板减少和高白细胞白血病的发生率明显高于CD40^-AML组(36．0％、8．7％),P=0．025;(72．0％、43．5％),P=0．045;(32．0％、4．4％),P=0．024。(3)survivin mRNA在CD40^ AML和CD40^-AML两组中表达差异无显著性(20／25、15／23),P=0．25,但两组中的survivin mRNA表达均明显高于健康对照组(20／25、6／20),P=0．001;(15／23、6／20),P=0．021;48例AML患者中CD40抗原阳性率低于survivin mRNA阳性率(52．1％、72．9％),P=0．041。(4)survivin^ AML化疗完全缓解(CR)率明显低于survivin^-AML(31．4％、69．2％),P=0．018。结论CD40抗原表达和AML的临床血液学特征存在一定关系;表达抗凋亡基因survivin mRNA是AML患者化疗CR率低的原因之一,可能是影响AML患者预后的因素。     

人肾透明细胞癌组织MUC3的表达及意义

目的：探讨人肾透明细胞癌组织中黏蛋白3(MUC3)的表达及其临床意义。方法：采用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)法检测人肾透明细胞癌和癌旁肾组织中MUC3的表达，分析癌组织中MUC3的表达与肿瘤病理分级、临床分期之间的关系。结果：肾透明细胞癌组织中MUC3的阳性表达率明显高于癌旁肾组织。MUC3的阳性表达率随肿瘤病理分级上升而上升，而与肿瘤的临床分期无相关性。结论：MUC3在人肾透明细胞癌中表达增强．并与肿瘤的恶性程度相关，MUC3可能在人肾透明细胞癌的发生发展中起重要作用。     

严重急性呼吸综合征冠状病毒S蛋白引起肺损伤的可能机制

目的研究严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)通过微血管内皮细胞释放细胞因子/趋化因子,介导急性肺损伤的可能机制。方法广州呼吸疾病研究所2003年2月至5月确诊为 SARS 的住院患者23例,男15例,女8例,年龄27～55岁,平均(36±6)岁。用液相蛋白芯片系统测定 SARS 患者不同阶段血中的细胞因子/趋化因子水平,免疫组化方法检测 SARS 患者肺组织中γ干扰素诱导蛋白10(interferon-γ inducible protein 10,IP-10)的表达;通过昆虫-杆状病毒表达系统表达 SARS-CoV 的 S 蛋白,并经镍亲和磁珠纯化,将重组的 S 蛋白作用于人脐静脉内皮细胞(HUVEC)观察其形态学变化并检测相应细胞因子/趋化因子的变化。结果 IP-10在健康对照组水平较低[(1200±500)ng/L],疾病早期就显著增高[(7600±2400)ng/L,P<0.01],并且在进展期[(8100±2300)ng/L,P<0.01]和疾病晚期[(8000±2800)ng/L,P<0.01]都保持显著增高的水平,直至恢复期[(1 250±450)ng/L,P>0.05]才正常,其在 SARS 患者肺组织显著表达。S 蛋白作用于人血管内皮细胞可引起细胞内出现空泡,细胞变圆有脱落,随时间延长细胞破碎溶解。基础状态下内皮细胞并不生成 IP-10,S 蛋白(5、20、40 mg/L)分别作用后可见 IP-10生成呈显著量效反应,如12 h分别为[(179±34)、(889±212)、(1676±199)ng/L,P 均<0.05]。结论 (1)SARS-CoV 感染的患者血中 IP-10活性显著增高,一直持续到恢复期,肺中 IP-10的表达增加。(2)SARS-CoV 可通过其 S蛋白诱导血管内皮细胞合成释放 IP-10,损害内皮细胞。(3)SARS-CoV 的 S 蛋白诱导 IP-10在宿主细胞的生成不依赖 IFN-γ。     

腺苷酸环化酶相关蛋白2在肝癌组织中的表达及其意义

有关腺苷酸环化酶相关蛋白(adenylate cyclase-associated protein,CAP)2在肝癌中的生物学作用机制尚不明确.本研究应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫组织化学技术检测CAP2在人正常肝脏、肝硬化和肝癌组织中的表达,探讨CAP2在肝癌发生发展过程中的作用.     

Cleavage and serum reactivity of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein

Severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus (SCoV) spike (S) protein is the major surface antigen of the virus and is responsible for receptor binding and the generation of neutralizing antibody. To investigate SCoV S protein, full-length and individual domains of S protein were expressed on the surface of insect cells and were characterized for cleavability and reactivity with serum samples obtained from patients during the convalescent phase of SARS. S protein could be cleaved by exogenous trypsin but not by coexpressed furin, suggesting that the protein is not normally processed during infection. Reactivity was evident by both flow cytometry and Western blot assays, but the pattern of reactivity varied according to assay and sequence of the antigen. The antibody response to SCoV S protein involves antibodies to both linear and conformational epitopes, with linear epitopes associated with the carboxyl domain and conformational epitopes associated with the amino terminal domain. Recombinant SCoV S protein appears to be a suitable antigen for the development of an efficient and sensitive diagnostic test for SARS, but our data suggest that assay format and choice of S antigen are important considerations.     

人类偏肺病毒与呼吸道合胞病毒呼吸道感染的临床研究

目的 了解福州地区人类偏肺病毒(HMPV)感染情况,比较HMPV与呼吸道合胞病毒(RSV)引起呼吸道感染的临床特征及流行特点.方法 采集2005年至2007年连续两个冬春季节153份福建省立医院就诊呼吸道感染患者痰标本或咽拭子标本,RT-PCR和套式RT-PCR分别检测RSV和HMPV,部分阳性PCR产物测序,DNAMAN软件分析;结合临床资料,比较两种病毒所引起的呼吸道感染临床症状、体征和流行特点.结果 153份鼻咽分泌物标本中,32份HMPV阳性,阳性率为20.9%;26份RSV阳性,阳性率为17.0%,8份HMPV和RSV均阳性.随机抽取3份标本,HMPV核苷酸序列一致,登载NCBI基因库(序列号DQ887758),基因进化树分析为单一基因型,属A基因型,但发生部分变异.2005年至2006年冬春HMPV阳性26份,阳性率为26.7%,2006年至2007年冬春HMPV阳性6份,阳性率为10.7%,而RSV检出情况与HMPV相反.儿童RSV感染平均年龄为(2.65±2.65)岁,HMPV为(4.58±3.35)岁.两种病毒引起呼吸道感染症状均以咳嗽、咽痛,发热为主.结论 HMPV与RSV均是福州地区冬春季节呼吸道病毒感染的主要病原体,两者可合并感染;HMPV主要感染年龄较大儿童,HMPV与RSV的临床特征相似.本研究期间福州地区发现的HMPV为单一基因型.