针对HBV X基因的siRNA抑制HepG2细胞HBV的复制和表达

目的构建能转录产生针对乙型肝炎病毒（HBV）X基因转录体的小干扰RNA（siRNA）转录载体pSIH—BV／X,研究其在体外对HBV复制和抗原表达的抑制作用。方法将构建成功的pSIHBV／X与HBV1．3倍体真核表达质粒pHBV1．3共转染HepG2细胞，转染后24、48、72h检测上清液中HBsAg、HBeAg的变化，并检测72h时HBV DNA的变化。结果成功构建了针对HBVX基因转录体的siRNA表达载体pSIHBV／X，并发现它能抑制HBsAg、HBeAg的分泌，抑制高峰在72h．抑制率分别是64％和61％，而无关对照序列的siRNA无此作用。荧光定量PCR证实HBV DNA的复制亦受到抑制，抑制率31％。结论针对HBVX基因转录体的siRNA在体外具有抑制HBV复制和抗原表达的作用。     

聚合酶链反应扩增小分子干扰RNA表达框筛选抑制HBV DNA复制的小分子干扰RNA

一些短片段的双链RNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异地阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNAi）。小分子干扰RNA（siRNA）就是这种短片段双链RNA分子，能够以序列同源互补的mRNA为靶目标，降解特定的mRNA。本研究针对HBV DNA多聚酶区的siRNA，运用PCR扩增siRNA表达框的方法筛选出对HBV DNA抑制作用最强的siRNA，观察其对HBV DNA复制及HBsAg和HBeAg分泌的抑制作用。     

RNA干扰抑制乙型肝炎病毒复制的实验研究

目的 以乙型肝炎病毒(HBV)核心区为靶位，构建表达小干扰RNA(siRNA)的质粒载体pSilencer3．1-Hlhygro，体外观察siRNA抗HBV的效果。方法 以HepG2 2．2．15细胞为靶细胞，利用脂质体Metafectene与表达siRNA的质粒载体pSilencer3．1-Hlhygro共转染，用定量聚合酶链反应检测细胞上清液中DNA，用逆转录聚合酶链反应检测HBV C-mRNA。结果 成功构建了表达siRNA的转录质粒载体，两条siRNA均可抑制HBV的复制，而且与siRNA浓度成正相关。结论 靶向HBV核心区的siRNA能抑制HBV的复制。     

乙型肝炎病毒前S2-ENV融合基因在NIH3T3细胞中的表达和初步鉴定

HBV是严重威胁人类健康的病毒之一，在我国约有1．2亿HBV携带者，但目前对乙型肝炎的治疗仍停留在对症治疗及调节机体免疫功能等阶段，尚无直接抑制HBV复制的有效方法。反义技术是依赖反义寡核苷酸（ODN）、反义RNA和核酶（ribozyme）等手段进行基因治疗、基因调控研究的方法。它在基因水平上考虑选择性关闭或修饰靶基因，使其失活而达到对疾病的特异性治疗，或研究特定基因功能及基因调控机制等。HBV在复制过程中经历了从前基因组mRNA逆转录到DNA的过程，利用反义技术能直接抑制病毒复制。     

针对HBV—P基因的RNA干扰抑制乙型肝炎病毒的研究

目的构建针对乙型肝炎病毒P基因编码区、能在体内转录产生发夹状小干扰RNA（siRNA）的表达载体psiHBV／p,观察RNA干扰对HBsAg、HBeAg及乙型肝炎病毒DNA复制的抑制作用。方法针对HBV—P基因区特异序列,构建siRNA的表达载体psiHBV／p。采用脂质体介导方法将其与1．3倍HBV真核表达质粒pHBV1．3共转染HepG2细胞。分别于转染后24小时、48小时、72小时用ELISA法对HepG2细胞培养上清液进行HBsAg、HBeAg的检测;于转染后72小时通过FQ-PCR法分析RNA干扰作用对HBVDNA的抑制效果。结果成功构建了针对HBV—P基因区的siRNA的真核表达重组体psiHBV／p,并发现它能明显抑制HBsAg及HBeAg的分泌,转染后第二天抑制率达高峰,分别为84％、65％。FQ—PCR结果也证实了转染72小时后,随psiHBV／p比例的升高,其对HBV DNA的抑制作用也随之增加。结论成功构建的psiHBV／p,它能在体内持续转录产生针对P基因转录体的发夹状siRNA;在细胞水平上,体内转录产生的、针对乙型肝炎病毒P基因区特异序列的siRNA对共转染的重组载体pHBV1．3有显著和特异的抑制作用。     

不同靶区RNA干扰抑制乙型肝炎病毒复制与表达

目的 观察针对乙型肝炎病毒（HBV）不同靶区发夹样RNA（shRNA）抑制HBV复制与表达的效率。方法 根据shRNA表达载体设计原则，设计并构建了针对HBVP、C、S和X区7种特异性和2种序列突变的shRNA表达载体，将其与1．3倍HBV全基因表达载体共转染于HepG2细胞，通过Southernblot和酶联免疫吸附法分别检测HBV DNA复制中间体和乙型肝炎表面抗原（HBsAg）水平，来观察shRNA抗HBV复制与表达的效率。结果 发现针对HBV不同靶区shRNA均有抗HBV复制和表达效果，以P1、S2、C2、S1和X抑制HBV DNA复制效率较高，P1的抑制率高达95％。HBsAg表达受抑制情况与HBV DNA复制受抑制的程度相似，其中C2、C1和S2对HBsAg的抑制作用较强。结论 针对HBV四个开放性读码框进行RNA干扰对HBV复制和抗原表达均有抑制作用，其中P1和C2分别对HBV复制和表达的抑制效率较高。     

针对P基因的siRNA对乙肝病毒S表达稳定性的影响

目的以乙型肝炎病毒（HBV）P基因为靶点，构建表达小干扰RNA（siRNA）的质粒载体psRNA1、psRNA2、psRNA3、psRNA4及对照psiRNA0，体外观察针对P基因的siRNA对HBs表达的影响。方法设计并合成针对HBV-P基因的siRNA寡核苷酸，经退火形成双链后克隆入psiRNA-H1neo质粒中，通过鉴定将构建成功的5个psiRNAs真核表达质粒瞬时转染HepG2．2．15细胞，用半定量RT-PCR对筛选到的位点进行了试验观测抑制效果。结果表明针对P基因的siRNA能下调HBs的表达，其中psiRNA1、psiRNA2的抑制HBs基因表达的效果最强。结论针对P基因的siRNA可以有效的抑制HBs的表达，抑制的效果和siRNA的靶位点有关。     

RNA干扰技术在抗乙型肝炎病毒感染应用中的研究进展

RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术能够特异性地降低目的基因的表达, 是目前最有效的基因沉默技术, 体内外研究均证实了RNAi在抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染中的作用. 近年来, 为使RNAi更适应抗HBV感染临床应用的需要, 许多学者针对小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)靶序列、转导方法、短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)载体、各种联合策略的选择及化学修饰的应用等方面进行了大量研究. 本文综述RNAi技术, 尤其是HBV特异shRNA在抗HBV感染中应用的研究进展.     

黄石地区慢性无症状乙型肝炎病毒携带者的基因型分布

目的：了解湖北黄石地区慢性无症状乙型肝炎病毒（HBV）携带者HBV基因型的分布，及其与病毒复制水平、HBeAg表达的相关性。方法：选择黄石地区168例慢性无症状HBV携带者作为研究对象，HBV基因型采用PCR微板核酸杂交．ELISA方法检测；血清HBVDNA复制水平采用荧光定量PCR检测；HBV—M采用ELISA法检测。结果：168例慢性无症状HBV携带者中HBVDNA阳性者为114例（阳性率为67．9％），其基因型分布为B、C、D型以及这3种基因型组成的混合型，而未发现A、E、F基因型。其中以B型、C型为主，所占比例为62．6％和36．8％，D型及混合型比例均为5．3％。C基因型患者中，HBV DNA呈现高水平复制（10^7～10^8 Copies／ml）的患者比例为26．2％（11／42），B基因型为13．3％（8／60）（P〈0．05）。C基因型患者血清抗-HBe阳性率（40．5％）显著高于B基因型（15．0％）（P〈0．01）。结论：黄石地区存在HBV的B、C、D基因型，以及由它们组成的混合基因型；B基因型为优势基因型；C基因型与HBV高复制水平，以及基因变异相关。     

乙型肝炎病毒复制调控元件对HBV DNA疫苗诱导的免疫应答

目的研究乙型肝炎病毒（HBV）复制调控元件增强子Ⅰ（ENHⅠ）及前S2（Pre-S2）抗原基因对HBV DNA疫苗诱导的免疫应答的影响。方法采用常规聚合酶链反应（PCR）从HBV adr亚型全基因DNA序列中分别扩增HBsAg、PreS2-HBsAg、HBsAg-ENHI和PreS2-HBsAg-ENHⅠ基因片段，重组到VR1012载体中，构建4种HBV DNA疫苗，转染HepG2细胞并免疫Balb／C小鼠。通过细胞免疫化学、酶联免疫分析（ELISA）、酶联免疫斑点试验（ELISPOT）等方法检测其在HepG2细胞内的表达及小鼠的体液及细胞免疫应答。结果转染的HepG2细胞表达相应的目的蛋白．ENHⅠ及Pre-S2抗原基因均可增强HBV DNA疫苗转染HepG2细胞表达HBsAg；免疫接种小鼠后第2周产生抗-HBs及HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL），Pre—S2抗原基因可增强HBV DNA疫苗免疫Balb／C小鼠诱导的抗-HBs及HBsAg特异性CTL的产生，ENHⅠ基因对免疫应答无影响。结论ENHI及Pre—s2抗原基因均可增强HBVDNA疫苗转染HepG2细胞表达HBsAg．Pre-S2抗原基因可增强HBVDNA疫苗免疫Balb／C小鼠引起的免疫应答。     

MxA基因真核表达载体构建及体外抗HBV作用研究

目的克隆人类MxA基因,探索其细胞内直接抗HBV作用,以便寻求HBV及其他病毒感染的新的基因治疗靶点。方法以pHMG—MxA质粒载体为基础,构建人类MxA基因表达质粒,采用人HBV—DNA转染的2．2．15细胞株作为研究对象,以不同浓度的MxA基因转染进行干预培养,lamivudine（3TC）阳性对照,同时设立空白对照,观察对HBV表达和复制的影响。结果经过酶切鉴定证明重组MxA基因表达质粒pcDNA—MxA构建正确,转染2．2．15细胞后呈现出明显抑制HBV复制和表达作用,且与转染剂量有关;3TC组也见MxA的表达增高,HBV—DNA复制受到明显抑制。结论抗病毒基因MxA具有细胞内抗HBV的复制及抑制病毒抗原基因的表达作用。     

血红素加氧酶-1表达对HBV复制的反向调控作用

目的评价血红素加氧酶-1（HO-1）对HBV复制的调控作用。方法采用分子克隆的方法分别构建人H（）_1真核表达载体——pH0和HO-1RNA干扰质粒——pHi，同HBV可复制性克隆pHBV1．3体外共转染人肝癌细胞系Huh-7，检测HBV抗原分泌情况和HBV相关mRNA含量。利用HBV急性感染小鼠模型，腹腔注射钴原卟啉（CoPP）IX和锌原卟啉（ZnPP）IX分别诱导和抑制HO-1表达，检测血清HO～1水平、HBV效价，免疫组织化学染色观察HBcAg在肝细胞内表达情况。分别在细胞水平和动物体内水平，评价HO-1表达对HBV复制的调控作用。结果同空载体共转染细胞相比，pHO共转染后HO-1的分泌水平明显上调（P〈0．01），HBsAg／HBeAg的分泌受到抑制（均P〈0．01）；pHi共转染后HO-1的分泌水平下降（P〈0．01），而HBsAg／HBeAg分泌增加（P均〈0．01）；但各组HBV相关RNA水平无明显差异。CoPPIX注射后诱导小鼠血清H0—1高表达（P％0．01），ZnPPIX则有效抑制了HO-1表达（P％0．01）。同对照组相比，CoPPIX组小鼠血清HBVDNA含量降低，肝脏内HBcAg阳性染色信号也随之明显减弱（P均〈0．01）；而ZnPPIX组小鼠血清HBVDNA含量增加，肝脏内HBcAg表达明显增强（均P〈0．01）。结论上调HO-1表达可有效抑制HBV复制，而下调其表达有利于HBV复制，且其可能是在转录后环节上发挥抗HBV作用。     

La蛋白与乙型肝炎病毒mRNA稳定性和蛋白质表达的相关性

目的研究La蛋白与乙型肝炎病毒（HBV）mRNA稳定性和蛋白质表达之间的相关性。方法设计并合成La蛋白mRNA特异性小干扰RNA（siRNA），转染HepG2．2．15细胞，继续培养3d后分别裂解转染和未转染siRNA的细胞l抽提蛋白质，Westernblot检测La蛋白含量变化；于转染后的第1、2、3、5、7、9天分别收集细胞培养上清液，实时荧光定量聚合酶链反应技术检测上清液中HBVDNA的变化情况，电化学发光分析技术检测乙型肝炎表面抗原，乙型肝炎e抗原含量变化情况。结果La蛋白在转染siRNA的HepG2．2．15细胞中表达明显低于未转染siRNA的细胞；转染siRNA的细胞分泌到上清液中乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎e抗原和HBVDNA的含量也明显低于未转染siRNA的细胞。结论在HepG2．2．15细胞内，La蛋白与HBVmRNA稳定性和蛋白质表达具有功能相关性。     

小鼠半胱天冬酶-12特异性小干扰RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠半胱天冬氨酸蛋白酶-12（Caspase-12）基因特异性小干扰RNA（siRNA）表达载体并检测其表达。方法 参照siRNA模板设计原则，设计并合成3对针对caspase-12不同位点的siRNA，分别在脂质体介导下转染小鼠肝癌细胞株Hepal-6，24h收集细胞；RT-PCR分析不同位点siRNA对靶基因mRNA表达的抑制，筛选出抑制效率最高的位点；将此位点siRNA模板序列插入质粒pRNAT-H1．1Neo中，PCR分析及基因测序进行鉴定；构建成功的重组质粒转染Hepal-6细胞48h和72h后，实时荧光定量PCR分析caspase-12 mRNA表达；Western印迹检测Caspase-12的表达。数据行t检验。结果 RT-PCR分析表明，第-对siRNA（siRNA＊1）对caspase-12基因表达的抑制效率最高；重组质粒pRNAT-H1．1Neo-caspasel2（pRNAT-caspl2）经PCR分析及测序表明，siRNA＊1模板序列成功插入预计位点，且序列正确；pRNAT-caspl2转染Hepal-6细胞48h和72h后，与空质粒对照组相比，caspase-12 mRNA水平分别下降72．5％和59．5％（P〈0．05）；pRNAT-caspl2转染后，caspase-12酶原表达量在24、48和72h分别下调17．1％、37．3％和60．1％，48h和72h的抑制率比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 成功构建小鼠caspase-12特异性siRNA真核表达载体，它对小鼠肝癌细胞caspase-12基因的表达具有显著和特异的抑制作用。     

小干扰RNA有效抑制乙型肝炎病毒的动物实验

目的 以乙型肝炎病毒（HBV）S区为靶位，观察小干扰RNA（siRNA）在动物体内抗HBV的效果。方法 以流体动力学法建立HBV感染的动物模型，将pcDNA3．1-HBV和细胞体外实验证明有效的siRNA尾静脉共注射Balb／c小鼠，用时间分辨免疫荧光分析法（IFMA）检测小鼠血清中HBsAg，用定量聚合酶链反应法（FQ-PCR）检测血清HBV DNA，用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测HBV S-mRNA，用免疫组织化学法检测肝组织HBsAg和HBcAg。结果 在小鼠体内，siRNA能有效抑制HBsAg的分泌，降低HBVDNA的滴度，免疫组织化学结果也证实HBsAg、HBcAg刚性细胞数明显减少，干扰效果至少持续3d，而无关siRNA则无抑制作用。结论 在动物体内靶向HBV S区的siRNA能有效特异抑制HBV。     

1．2倍基因组长度C基因型乙型肝炎病毒重组体构建及其在HepG2细胞中表达和复制

目的构建基于pBlueBac4．5质粒的1．2倍基因组长度C基因型乙型肝炎病毒（HBV）重组体，并研究其在HepG2细胞中的表达和复制。方法以重组质粒pWT上的1．2倍基因组长度C基因型HBVDNA序列和pBB4．5HBV1．3（D基因型）上的pBlueBac4．5载体序列为模板，构建重组质粒pBB4．5HBV1．2（C基因型）。用FuGENEHD瞬时转染法，将pBB4．5HBV1．2导人HepG2细胞。用化学发光免疫分析法、Southern印迹杂交法、荧光定量PCR法，分别检测转染后不同时间点HBsAg和HBeAg、HBV复制中间体及HBVDNA水平。此外，对转染时重组质粒用量进行优化。结果酶切和序列分析证实，pBB4．5HBV1．2重组质粒构建成功。初步转染实验证实，在转染细胞培养上清中可检测到HBsAg和HBeAg。优化后转染条件为：使用60mm细胞培养皿，8～11tLgpBB4．5HBV1．2，质粒与转染试剂5：9（μg：μl）。在此条件下，5d实验周期内可检测到HBsAg和HBeAg持续表达（峰值一般出现在转染后第3天）、HBVDNA持续复制（10^6～10^8拷贝／ml）及HBVDNA复制中间体形成。结论在HepG2细胞中，建立了以杆状病毒转移载体pBlueBac4．5为基础的1．2倍基因组长度C基因型HBV体外培养体系，有望为研究HBV耐药、筛选新抗病毒药物等提供新技术平台。     

肝富集转录因子对HBV基因转录和复制的调控作用

目的建立乙型肝炎病毒（HBV）在非肝源细胞的复制体系,探讨肝富集转录因子对HBV基因转录和复制的调控作用。方法用复制型HBV重组质粒pHBV4.1与肝富集转录因子HNF3、HNF4和RXRα/PPARα的表达质粒分别共转染非肝源细胞株NIH3T3。用Northern吸印杂交检测HBV 3.5 kb、2.4/2.1 kb、0.7 kb mRNA的转录情况,Southern吸印杂交检测HBV DNA复制中间体水平。结果复制型HBV重组质粒pHBV4.1在肝癌细胞中能检测到3.5 kb HBV RNA转录产物和HBV DNA复制中间体;用pHBV4.1转染NIH3T3细胞后,在没有肝富集转录因子表达质粒共转染时未能检出3.5 kb HBV RNA转录产物,也无HBV DNA复制中间体;当用肝富集转录因子共转染时,HNF4和RXRα/PPARα的表达能够激活3.5 kb HBV RNA转录和HBV DNA复制,而HNF3未能激活HBV复制,但在HNF4或RXRα/PPARα介导的病毒复制体系中,均见3.5 kb HBV mRNA的转录和HBV DNA复制水平下降。结论利用肝富集转录因子成功地建立HBV在非肝源细胞中的转录与复制。其中,HNF4和RXRα/PPARα可支持HBV在非肝源细胞中转录与复制;HNF3抑制HBV肝特异性基因转录与复制。     

甲胎蛋白启动子介导反义乙型肝炎病毒X基因在肝癌细胞中的表达及其作用

目的 构建含甲胎蛋白(AFP)启动子和增强子的反义乙型肝炎病毒X基因(HBX)真核表达载体，研究其特异性和有效性，为开发肝癌细胞特异性HBX反义RNA基因治疗乙型肝炎病毒(HBV)奠定基础。方法 聚合酶链反应(PCR)扩增HBX(1370—1872nt)基因，克隆至EB病毒表达载体，双轮PCR筛选、鉴定基因插入方向。脂质体转染肝癌细胞和ECV304细胞，Northernblot检测HBX mRNA的表达，酶联免疫试验(ELISA)检测HBV抗原，荧光定量PCR检测HBV DNA。结果 成功构建正、反义RNA表达载体pEBAF—s—HBX、pEBAF—as—HBX。Northernblot证实反义RNA仅在AFP阳性的肝癌细胞中表达。pEBAF—as—HBX转染3d后，可显著抑制2．2．15细胞HBV复制和抗原表达，其HBsAg、HBeAg抗原表达较正义对照分别下降37．9％和36．8％，HBV DNA降低25％。结论 反义RNA表达载体pEBAF—as—HBX仅在肝癌细胞中特异表达、并可有效抑制HBV，有良好的开发应用前景。     

RNA干扰在慢性乙型肝炎方面的研究进展

慢性乙型肝炎是当前严重危害世界人类健康的传染病。乙型肝炎病毒（HBV）感染后大多数发展为慢性肝炎．最终可能发展为肝硬化、肝细胞癌。目前常用的抗HBV药物主要有干扰素和核苷（酸）类似物，但疗效都不很理想，特异性差，易出现耐药性。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是一种普遍存在的自然现象，是近年来发现的一种高效、特异地阻断靶mRNA表达进而导致转录后基因沉默的现象。