聚合酶链反应技术诊断急性坏死性胰腺炎细菌感染的研究

急性坏死性胰腺炎（ANP）为外科严重急腹症之一,其并发症多,病程长,且有一定的死亡率。而感染是并发症及死亡的主要原因[1]。目前ANP继发感染的早期诊断问题仍未能很好解决。细针穿刺抽吸（FNA）周胰腺坏死组织行细菌培养是术前确诊感染的唯一方法,但细菌培养费时长,不能满足早期诊断的需要。本研究采集13例ANP患者的CT引导下FNA及术中胰腺坏死组织样本共34份行聚合酶链反应（PCR）检测,并与徐片、细菌培养及临床最终诊断结果相比较,探索早期快速诊断ANP感染的新途径,现报道如下。材料与方法一、材料1997年3月至1998年1月…     

利用基因芯片快速检测多种临床常见致病菌及其耐药性基因

目的快速、准确、灵敏地检测临床常见的致病菌及其耐药基因。方法采用基因芯片技术，利用细菌23S rRNA基因序列信息和某些耐药基因作为检测靶基因，设计针对不同菌属的寡核苷酸探针和耐药基因探针的基因芯片，聚合酶链反应（PCR）扩增并荧光标记目的DNA片段，通过杂交反应检测致病菌及其耐药基因。结果在理想状态下（检测试剂盒抽提的细菌基因组DNA）检测的结果与国内外文献报道的灵敏度相当（10^3～10^6细菌／ml），并在部分临床分离株、耐药标准菌株中进行验证，显示该方法有良好的特异性及可重复性。细菌种类能鉴别到种水平的有16种，能鉴别到属水平的有7类。覆盖了临床常见的多种病原菌，并且还可同期检测超广谱β内酰胺酶（ESBLs）基因耐药。结论DNA芯片检测具有快速、高特异性和高灵敏度的特点，是常规鉴定方法的一种有益补充。     

肺炎链球菌临床分离株PBP2b基因序列分析及其应用探索

目的通过分析肺炎链球菌PBP2b基因转肽酶编码区的序列差异，建立可区分对青霉素敏感肺炎链球菌（PSSP）与青霉素不敏感肺炎链球菌（PNSSP）的分子生物学方法。方法检测青霉素对肺炎链球菌的最低抑菌浓度（MIC），对菌株PBP2b转肽酶编码区进行PCR扩增和序列分析，根据序列差异设计相应引物和探针，并采用PCR-反向杂交方法区分PSSP与PNSSP。结果43株肺炎链球菌（42株临床分离株及1株标准株）中8株为PSSP，30株为青霉素中介株（PISP），5株为青霉素耐药株（PRSP）。经PBP2b基因限制性片段长度多态性分析（RFLP）及测序分析，PSSP与PNSSP（PISP＋PRSP）存在谱型及序列差异。根据序列差异建立的检测方法可正确区分PSSP与PNSSP。结论肺炎链球菌PSSP和PNSSP菌株的PBP2b基因转肽酶编码区之间存在可供鉴别的序列差异，据此可建立快速、特异的分子生物学方法，有望为该菌耐药基因的快速诊断提供客观依据。     

广西狂犬病野毒株N基因的测序与分析

目的 对广西狂犬病野毒株N基因进行测序和分析，了解其遗传特点和进化规律。方法 2003至2004年从广西各地采集595份动物脑材料，经RT-PCR法确定16份为阳性。对此16株狂犬病野毒株N基因全序列进行RT-PCR扩增、克隆和测序分析。结果 广西狂犬病病毒株属于I型，可分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ群。GX01、GX08、GX09、GX014、GX091、GX195、GX260、GXLA、GXHX和GXSL株的同源性在97．6％～99．8％，为Ⅰ群，它们与其他毒株的同源性为89．0％～89．7％；GX219、GX074、GX304、GXBM和GXPX株的核苷酸同源性在98．4％～99．9％，为Ⅱ群，它们与其他各株的同源性为88．6％～89．7％；GXN119株为Ⅲ群，与泰国的8738THA株核苷酸同源性为95．3％。遗传进化分析表明，389位磷酸化位点、主要的4个抗原区及Th细胞表位区非常保守。N蛋白上的氨基酸变异主要集中在42、90、110、128、135、332、379和397位氨基酸上，这些氨基酸的变异与同源性分群结果一致。结论 根据基因同源性、遗传进化树及氨基酸变异分析，广西狂犬病野毒株分3群，呈地区性分布。     

广东口岸结核分枝杆菌复合群分子流行病学特征分析

目的 了解广东口岸结核分枝杆菌复合群(MTBC)主要流行菌株及输入性菌株的分子流行病学特征。方法 采用熔解曲线间隔区寡核苷酸分型(melting curve spoligotyping,McSpoligotyping)技术对广东口岸558株MTBC菌株进行基因分型,将分型结果与SITVITWEB数据库进行比对,获取间隔区寡核苷酸国际型别(spoligotype international type,SIT)编号,并用BioNumerics 7.6进行聚类分析。结果 558株MTBC菌株共分为107种基因型,其中66种归属于8种基因家族及4种家系。家系2和家系4共占菌株总数的86.38%(482/558)。6个主要流行簇分别为SIT1、SIT53、SIT52、SIT50、SIT190和SIT19,其中SIT1为最大流行簇。17株输入性MTBC包含北京、拉丁美洲和地中海(Latin American and Mediterranean,LAM)、East African Indian(EAI)、T、Africanum(AFRI)及未定义的基因家族,其中包含23.53%(4/17)的新基因型。北京家族菌株耐药率为27.25%(106/389),非北京家族菌株耐药率为23.81%(40/168),差异无统计学意义(χ ²=0.72,P=0.40)。典型北京家族菌株耐药率为26.03%(95/365),非典型北京家族菌株耐药率为45.83%(11/24),差异有统计学意义(χ ²=4.46,P=0.03)。 结论 广东口岸以家系2和家系4 MTBC为主要流行菌株,输入性菌株以来源地区流行的基因家族和新基因型为主,应加强对主要流行菌株及输入性菌株的分子流行病学监测。非典型北京家族菌株与耐药性具有相关性。     

应用PCR-SSOP技术进行大样本脐血HLA基因分型的探讨

目的：探讨一种高效、快速、准确、省力并能批量检测HLA基因分型的方法。方法：采用聚合酶链反应一序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP)反向杂交技术对天津地区汉族健康新生儿脐血HLA-A、B、DR位点进行中低分辨基因分型。结果：共检出72种HLA-Ⅰ、Ⅱ类特异性抗原，其中A位点抗原检出19种；B位点抗原检出40种；DR位点抗原检出13种。结论：PCR-SSOP是一种结果相对准确稳定、操作简便快速、适用于脐血库等进行大样本分型检测HLA多态性的分子生物学技术。     

枸橼酸杆菌中质粒介导喹诺酮耐药基因的检测

目的 了解枸橼酸杆菌中质粒介导喹诺酮耐药(PMQR)基因的分布,以期发现新型PMQR基因.测定临床分离的PMQR基因阳性枸橼酸杆菌对临床常用抗菌药物的敏感性.方法 收集安徽医科大学第一附属医院检验科2009年临床分离的枸橼酸杆菌,PCR扩增qnr、aac(6′)-Ib-cr和qepA基因,产物纯化测序,测序结果在GenBank上比对并行转移接合实验.对收集的PMQR基因阳性枸橼酸杆菌及其接合子,采用琼脂对倍稀释法进行临床常用抗菌药物的药物敏感试验.结果 收集的枸橼酸杆菌共31株,8株菌株扩增出qnr,qnr基因阳性率为25.8％;其中6株扩增出qnrB.4株qnr阳性菌株的qnr基因转移接合成功.在qnr阳性的枸橼酸杆菌中,测序发现1种PMQR基因新亚型,命名为qnrB24.所有qnr阳性临床菌株对喹诺酮类药物的耐药率为87.5％,对头孢噻肟、阿米卡星、头孢他啶、头孢吡肟和庆大霉素的耐药率分别为75.0％、7.5％、62.5％、37.5％和87.5％,所有qnr阳性菌株对亚胺培南耐药表型为敏感.喹诺酮类药物对qnr阳性的接合子最低抑菌浓度升高10～23倍,敏感性下降.结论 安徽地区枸橼酸杆菌中qnr基因型的检出率较高,以qnrB基因型为主,qnr阳性枸橼酸杆菌对常用抗菌药物耐药性较高.     

全长乙型肝炎病毒基因组的扩增及序列分析

目的 建立一种全长乙型肝炎病毒(HBV)基因组扩增及序列分析的新方法。方法 在HBV负链开环缺口处设计引物，使用TaKaRa LA Taq^TM DNA聚合酶进行扩增，聚合酶链反应产物克隆后进行全长序列测定。结果 用此方法成功获得HBV全基因组DNA序列。将已知序列的HBV全基因组重组质粒作为模板进行敏感性和保真性测定，其敏感性为10^2个初始模板，核苷酸的人为突变率为1．2bp／kb。结论 此方法可用于大规模HBV全基因组扩增和序列分析，为HBV的基础和临床研究提供了一种新方法。     

PCR测序和基因芯片快速鉴定分枝杆菌菌种的应用研究

目的 评价2种分枝杆菌菌种快速鉴定方法的临床应用价值。方法 分别用16S～23S rDNA转录间隔序列（ITS）PCR-直接测序和基于16S rRNA基因的基因芯片检测21株分枝杆菌标准菌株和50株临床分离株。结果 21株分枝杆菌标准株中,ITS PCR测序法将18株准确鉴定到种,结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌菌株只能鉴定到结核分枝杆菌复合群,海分枝杆菌无法鉴别是海分枝杆菌还是溃疡分枝杆菌;芯片法正确鉴定16株,1株胃分枝杆菌鉴定为堪萨斯分枝杆菌,3株不在芯片检测范围内。50株临床菌株中, 47株2种方法结果一致,1株不在芯片检测范围内。结论 基因芯片鉴定分枝杆菌快速、特异,准确性高,临床常规开展应用需要进一步研究。     

胸膜活检标本行基因扩增对结核性胸膜炎的诊断价值

目的 评价胸膜活检组织行聚合酶链反应（ＰＣＲ）对结核性胸膜炎的诊断价值。方法 ＰＣＲ检测６５例胸膜活检组织中结核分枝杆菌ＤＮＡ,并与胸水检测及胸膜活检组织病检对比。结果 胸膜活检组织ＰＣＲ阳性率８３．１％,胸水ＰＣＲ阳性率为６３．１％,胸膜活检组织病检阳性率为６０．６％。前者较后两者更敏感。结论 胸膜活性组织ＰＣＲ检测对结核性胸膜炎有较高的诊断价值。     

ahpC基因突变与结核分支杆菌耐异烟肼的研究

目的了解我国结核分支杆菌耐异烟肼（ＩＮＨ）分离株ａｈｐＣ编码基因及其启动子突变情况，研究其与ＩＮＨ耐药关系。方法通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）单链构象多态性（ＳＳＣＰ）方法分析６２株结核分支杆菌临床分离株ａｈｐＣ及其启动子基因。以Ｈ３７ＲＶ标准株为对照。结果３２株结核分支杆菌药物敏感株ａｈｐＣ及其启动子基因ＳＳＣＰ均泳动正常；３０株耐ＩＮＨ分离株ａｈｐＣ编码基因ＳＳＣＰ也未见异常；１２株高度耐ＩＮＨ分离株中，５株ａｈｐＣ启动子ＳＳＣＰ泳动异常；１８株低度耐ＩＮＨ分离株的ａｈｐＣ启动子泳动正常。结论结核分支杆菌ａｈｐＣ编码基因与耐ＩＮＨ无关；ａｈｐＣ启动子突变是结核分支杆菌ｋａｔＧ改变、过氧化氢酶缺乏的代偿性变化，也许能作为结核分支杆菌高度耐ＩＮＨ的间接指标。     

荧光PCR探针熔解曲线法与微孔板法检测MTB耐药性的临床应用比较

目的 分析荧光PCR探针熔解曲线法与微孔板法药物敏感性试验(简称“药敏试验”)检测结核分枝杆菌(MTB)对抗结核药品耐药性结果的一致性及MTB基因突变与耐药的相关性,为临床诊疗优化提供参考。方法 搜集2019年1—12月分离自西安市胸科医院就诊患者并经鉴定确认的343株MTB临床分离株,菌株均进行了微孔板法药敏试验和荧光PCR探针熔解曲线法检测。以微孔板法药敏试验结果为参照,评价荧光PCR探针熔解曲线法检测MTB对异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇、莫西沙星和左氧氟沙星耐药性的检测效能,并分析荧光PCR探针熔解曲线法检测的MTB基因突变与微孔板法药敏试验最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)的相关性。结果 以微孔板法药敏试验结果为参照,荧光PCR探针熔解曲线法检测MTB对异烟肼、利福平、链霉素、乙胺丁醇、莫西沙星和左氧氟沙星耐药性的敏感度、特异度、Kappa值分别为:96.20%(76/79)、95.28%(242/254)、0.88;93.62%(44/47)、94.58%(279/295)、0.79; 96.88%(62/64)、94.96%(264/278)、0.86;93.33%(14/15)、95.37%(309/324)、0.61;92.31%(24/26)、97.16%(308/317)、0.80;91.18%(31/34)、99.35%(307/309)、0.92。荧光PCR探针熔解曲线法检测结果与微孔板法表型药敏试验检测结果不一致的菌株中,发生异烟肼AhpC启动子区(-44~-30及-15~3位点),利福平rpoB基因507~512位点,链霉素rrs基因905~908位点多位点突变和乙胺丁醇embB基因406位点突变的菌株,表型药敏试验耐药率较低,分别为1/5、1/5、1/10和1/5;而发生异烟肼KatG基因315位点、利福平rpoB基因529~533位点、链霉素rpsL基因43位点突变的菌株,表型药敏试验耐药率较高,分别为92.42%(61/66)、92.31%(36/39)和95.74%(45/47)。结论 荧光PCR探针熔解曲线法与微孔板法药敏试验检测MTB对抗结核药品耐药性结果具有较好的一致性;MTB对异烟肼、利福平、链霉素的耐药与其部分基因突变具有一定相关性。     

结核分支杆菌利福平耐药基因突变的研究

目的了解我国结核分支杆菌耐利福平（ＲＦＰ）分离株ｒｐｏＢ基因突变情况，建立快速检测结核分支杆菌耐药基因型的分子药敏试验方法。方法通过聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）和ＰＣＲ－直接测序法（ＰＣＲ－ＤＳ）分析５０株结核分支杆菌临床分离株的ｒｐｏＢ基因。结果３株结核分支杆菌药物敏感株和２株非ＲＦＰ耐药株中，仅１株ｒｐｏＢＳＳＣＰ图谱异常的药物敏感株出现５３１位密码子ＴＣＧ→ＴＴＧ突变。４５株ＲＦＰ耐药株中，１０株ＳＳＣＰ和ＤＳ分析均未见ｒｐｏＢ突变，３５株ＳＳＣＰ和ＤＳ分析异常，其中１４株为５３１位密码子ＴＣＧ→ＴＴＧ或ＴＧＧ或ＴＡＣ突变，１４株为５２６位ＣＡＣ→ＴＡＣ或ＧＡＣ或ＣＣＣ或ＣＴＣ或ＧＴＣ突变，２株为５１６位ＧＡＣ→ＧＴＣ或ＴＡＣ突变，２株为５１６位和５２６位及５１５位和５１６位密码子双点突变，３株ｒｐｏＢ序列与结核分支杆菌不同。结论大多数结核分支杆菌耐ＲＦＰ是由于其ｒｐｏＢ基因突变所致，采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和ＰＣＲ－ＤＳ方法可快速测定结核分支杆菌ＲＦＰ耐药基因型     

不同时期住院肺结核患者初始耐药调查分析

目的分析不同时期住院肺结核患者初始耐药的发生情况,为临床初治肺结核患者制订合理化疗方案提供依据。方法回顾分析北京结核病胸部肿瘤研究所1986年—1988年（设为I组）及2004年—2005年（设为Ⅱ组）住院的初治肺结核患者初始耐药情况。结果（1) 初始耐药率：Ⅰ组患者为27.2% (25/92),Ⅱ组为39.6%(65/164),2组经统计学处理差异有统计学意义(χ²=4.00,P=0.045);（2) 初始耐多药率：Ⅰ组患者为1.1% (1/92),Ⅱ组为15.9%(26/164),2组经统计学处理差异有统计学意义(χ²=13.57,P=0.00023)。结论住院肺结核患者初始耐药、耐多药呈上升趋势,提示临床医生针对初治患者也应行结核菌培养及药敏检查,及时发现初始耐药尤其是耐多药患者,选用敏感药物制订个体化初治方案,以减少延误,及早治愈患者。     

上海地区儿童化脓性链球菌的红霉素耐药基因研究

目的 了解上海地区化脓性链球菌对红霉素的耐药情况及耐药基因谱的特点.方法 2004年11月至2006年6月经复旦大学附属儿科医院传染病门诊诊断为猩红热的患儿,其咽拭子培养分离获得100株化脓性链球菌.应用PCR及序列分析法检测红霉素耐药基因mefA、ermA、ermB在该批菌株中的分布规律及其与红霉素耐药性的关系.结果上海地区化脓性链球菌的红霉素耐药率为98%,克林霉素耐药率为95%,两者耐药性的一致率为97%.100株菌株中含ermB基因的化脓性链球菌94株,占所有菌株的94%,对红霉索耐药率为100%;含mefA基因的化脓性链球菌16株,占所有菌株的16%,对红霉素耐药率为100%;100株菌株中未发现ermA基因.5株菌株未发现ermB基因及mefA基因,其中2株对红霉素敏感,3株对红霉素耐药.mefA基因单独阳性的菌株仅占1%.结论上海地区化脓性链球菌对红霉奈普遍具有较高耐药率,且与克林霉素存在较严重的交叉耐药.ermB基因是决定上海地区化脓性链球菌对红霉素耐药的重要基因.     

深圳地区结核分枝杆菌耐药及广泛耐药分离株的分子特征

目的 研究2007-2008年深圳地区MTB耐药和广泛耐药分离株的分子特征.方法 参照世界卫生组织和同际防痨与肺部疾病联盟的标准,使用改良罗氏药敏培养基,用1%比例法药敏试验,筛选出针对异烟肼、利福平、链霉素、氧氟沙星和卡那霉素5种药物耐药或敏感的临床分离株,通过PCR扩增筛选菌株的rpoB、katG、rpsL、rrs~((1))、gyrA/B和rrs~((2))基因的相关序列,运用DNAStar和Blastn进行序列分析.结果 筛选出实验菌株123株,其中耐药株73株,全敏感株50株.异烟肼耐药株katG基因突变率为44/52,突变位点全部为S315T或S315N.利福平耐药株rpoB基因突变率为44/47,突变位点主要集中在S531L(30/44)、H526D(9/44)和H526R(1/44).链霉素耐药株以rpsl基因突变为主,突变位点为K43R(19/28)和KS8Q(6/28);rrs(1)基因突变较少见,仪有491C→T(2/28)和513A→C(1/28),2个基因突变率合计为28/41.氧氟沙星耐药株突变率为11/11,以gyrA基因突变为主,突变位点包括D94A(2/11)、S91P(4/11)和A90V(3/11),3个突变位点总突变率为9/11;     

老年患者下呼吸道医院感染的细菌耐药监测分析

目的探讨老年患者医院内下呼吸道感染病原菌及其细菌耐药情况。方法统计2008年1～12月下呼吸道感染的老年住院患者,痰液检232例,进行回顾性分析。结果老年患者医院内下呼吸道细菌感染较多,其中铜绿假单胞菌为痰液主要分离菌占26％,其次是鲍曼不动杆菌占20％。铜绿假单胞菌耐药性较高,对亚胺培南耐药率为38．1％,对美罗培南的耐药率为32,1％,而阿米卡星和环丙沙星对铜绿效果较好,耐药率分别为8．8％和17．8％。结论铜绿假单胞菌可能是老年人下呼吸道院内感染的主要病原体。     

聚合酶链反应诊断军团菌感染的实验研究

目的早期诊断军团菌感染。方法采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测嗜肺军团菌（Ｌｐ）ｍｉｐ基因的特异性片段，并应用于豚鼠米克戴德军团菌（Ｌｍ）感染后的组织标本检测。结果可以扩增出ＬｐＩ型和Ｌｍ６３０ｂｐ的特异性片段，其他临床分离株不被测得，检测灵敏度为１５０ｆｇ军团菌基因组ＤＮＡ（相当于１５～３０个军团菌）。对２２份Ｌｍ感染后不同时间获取的豚鼠组织标本，应用该法与培养法检测结果比较显示，在感染后３．５天培养法阳性率为８８．９％，ＰＣＲ法１００％，在感染后７．５天培养法阳性率为０，而ＰＣＲ法仍有２２．２％的阳性率。结论本方法敏感、特异，既能检出嗜肺军团菌，又能测得Ｌｍ，大大提高了军团病的诊断率