HepG2.2.15细胞内乙型肝炎病毒cccDNA的定量检测

目的　建立一种细胞内乙型肝炎病毒cccDNA的定量检测方法。方法　消化收集处于对数生长期的HepG2.2.15细胞,取1×106 个细胞用小量质粒抽提试剂盒抽提细胞内的cccDNA,抽提产物用绿豆核酸酶酶切纯化,所得酶切产物用特异的引物和探针进行选择性荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测。用对数生长期前的细胞培养上清液、4 份HBV DNA阳性和2 份HBV DNA阴性的慢性乙型肝炎(轻度)患者血清验证荧光定量PCR法的特异性,并用不同浓度的质粒标准品检测该方法的敏感性。结果　证实HepG2.2.15细胞内存在cccDNA,其含量约为每个细胞18 拷贝。对数生长期前培养上清液和慢性乙型肝炎(轻度)患者血清均未检测到荧光信号,本实验条件下用该方法可检测低至103 拷贝/ml的cccDNA分子。结论　该方法操作方便,特异性高,敏感性较好,可用于定量检测细胞内的cccDNA及抗病毒药物的筛选和评价等。     

pRevX-GFP DN突变体抑制HepG2 2.2.15细胞乙型肝炎病毒复制的实验研究

目的 建立pRev X-GFP及其作对照的表达野生X蛋白、绿色荧光蛋白的长期稳定表达细胞克隆，进一步研究以乙型肝炎病毒(HBV)X基因作为治疗靶，运用DN突变体技术，进行抗HBV的稳定表达对抗HBV复制的作用。方法 运用基因工程技术，分别以逆转录病毒载体pRev TRE为载体，构建表达野生型HBV X蛋白，GFP蛋白和X与GFP融合的X-GFP融合蛋白的质粒，并分别导入乙型肝炎的转基因细胞株HepG2 2．2．15细胞(简称2．2．15细胞)中，并通过长期的潮霉素抗性选择，获得能稳定表达DN蛋白的2．2．15细胞克隆。应用dot blot检测细胞上清液及细胞中HBV DNA，Southern blot检测细胞内HBV复制中间体，以观察其表达对HBV病毒复制的影响。结果 所构建的pRev X-GFP突变体、pRev Xwt、pRev GFP质粒均能在2．2．15细胞株中稳定高效表达。PRev X-GFP高效表达后，能有效地抑制或阻断细胞内HBV核酸合成及其分泌入细胞上清液。定量聚合酶链反应结果显示，pRev X-GFP组的平均每毫升HBV DNA浓度较2．2．15细胞组分别下降1．0～1．81g值，对细胞内外dot blot结果进行图像分析，其灰度值仪为对照2．2．15细胞组的7．9％，Southern blot分析则发现，X基因DN突变体对HBV复制中间体rcDNA、ssDNA及dsDNA的形成有全面抑制作用。结论 pRev X-GFP DN突变体具有显著抑制HBV复制作用。初步证实X基因是HBV治疗的一个新靶点。针对X基因的治疗，有望为HBV治疗提供一些新的思路。     

乙型肝炎病毒转染及脂多糖刺激对HepG2细胞Toll样受体2和4表达的影响

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)转染对HepG2细胞表面Toll样受体(TLR)表达的影响及脂多糖(LPS)加重HBV转染致肝细胞损伤是否存在直接作用,进一步探讨乙型肝炎发病及重型化的发生机制。方法以不同浓度的LPS刺激HepG2细胞、HepG2．2．15细胞(转染HBV全基因组的HepG2细胞),并以免疫细胞化学方法检测HepG2细胞及HepG2．2．15细胞表面TLR 2、4蛋白质表达情况,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TLR2、4 mRNA表达情况,用Abbot试剂检测HepG2．2．15细胞HgsAg和HgeAg表达情况,用流式细胞仪观察细胞生长周期及细胞凋亡情况。结果HepG2、HepG2．2．15细胞膜上均有TLR2、4蛋白质表达,免疫细胞化学染色在未加LPS及各浓度LPS刺激细胞均可见细胞膜有棕褐色着色,且随着LPS浓度增加,其着色强度增加;对0mg/L及10mg/L LPS诱导HepG2、HepG2．2．15细胞RNA进行RT-PCR扩增,其产物行10g/L琼脂糖凝胶电泳均可见特异性条带,且10mg/L LPS诱导细胞TLR2和TLR4与分子量标准品的吸光度值比值明显高于0mg/L LPS诱导细胞扩增产物,分别为306．63±6．18对519．84±9．15和700．54±13．56对1116．62±37．67,F值分别为740．58和426．07,P值分别为0．01和0．02;流式细胞仪检测细胞周期发现HepG2绌胞及未经LPS诱导的HepG2．2．15未发生凋亡,各浓度LPS诱导的HepG2．2．15细胞均有细胞凋亡发生,且细胞凋亡率随着LPS浓度增加上升。结论LPS可能通过其与肝细胞膜上的TLR结合,而参与HBV转染后肝细胞损害及肝脏炎症重型化的发病机制。     

HepG2与HepG2．2．15细胞中P53表达及活性的比较

目的探讨HBV对抑癌基因P53表达及活性的影响。方法选用HepG2及转染了HBV表达质粒的HepG2．2．15细胞，采用Western blotting法检测两种细胞P53的表达状况；磷酸钙法将报告基因质粒PG13-CAT和P21-LUC分别转染细胞，通过检测报告基因的表达观察各细胞中P53的活性。结果HepG2．2．15细胞中P53蛋白表达水平高于HepG2细胞，而且两种报告基因的表达在HepG2．2．15细胞中也较高。结论HBV在肝癌细胞内的复制对P53的表达及功能具有一定的增强作用。     

胎盘免疫调节因子对HepG2．2．15细胞毒性及HBV DNA分泌作用的影响

目的观察胎盘免疫调节因子（PF）在体外的抗乙肝病毒（HBV）作用及安全性。方法将质量浓度分别为0．032—20．000mg／ml的PF作用于体外培养的人肝癌细胞系HepG 2．2．15细胞,通过MTT比色法观察细胞增殖抑制率及半数毒性质量浓度（TC50）,以荧光定量PCR法检测HBV DNA水平（以拉米夫定为阳性对照组）。结果PF处理后细胞增殖抑制率为0．75％～58．21％且呈浓度依赖性,作用72h后TC50为13．61mg／ml;PF作用72h和144h后,细胞上清液中HBV DNA拷贝量显著降低,与阳性对照组水平相似。结论PF在体外有显著抗HBV作用,且细胞毒性较小。     

氧化苦参碱抗乙型肝炎病毒的体外实验研究

目的：观察氧化苦参碱体外抗乙型肝炎病毒（HBV）的活性。方法：以HepG2－2．2．15细胞株为模型, 用微粒酶免疫测定技术(MEIA）检测细胞培养上清液中HBsAg、HBeAg含量,用bDNA信号可扩增法定量检测细胞内核心颗粒HBV DNA的变化,以MTT比色法观察药物的细胞毒性。结果：氧化苦参碱2000μg/ml时对HBsAg、HBeAg的抑制率分别达40．57％、48．27％;浓度为100－200μg/ml时,能明显降低2．2．15细胞浆核心颗粒HBV DNA水平;无明显细胞毒性作用。结论：体外细胞培养表明,氧化苦参碱具有直接抗HBV活性。     

通过RNA干扰抑制HepG2．2．15细胞中HBV的表达及复制

研究人员为观察将HBV X的siRNA表达载体pGenesil-HBV X转染至HepG2．2．15细胞后，对乙型肝炎病毒表达及复制的影响。[第一段]     

胸腺因子D体内抗鸭乙型肝炎病毒的作用

慢性乙型病毒性肝炎（CHB）的发生、发展和转归与机体的免疫功能紧密相关。目前认为，病毒清除是由细胞毒性T淋巴细胞（CTL）介导的HBV感染的肝细胞溶解和／或CTL产生的细胞因子，如干扰素γ（IFN-γ）、白介素（IL）-2等的效应实现的。胸腺因子D（TFD）能与T细胞上的受体结合，启动Th细胞以自分泌或旁分泌方式产生IFN-γ、IL-2和IL-2受体，作用于细胞免疫调节的中心环节，扩大抗病毒免疫作用。我们在前期的体外实验已证实，TFD具有抑制HepG2．2．15细胞系HBsAg、HBeAg表达的作用。我们进一步观察了TFD对后天感染DHBV的鸭乙型肝炎模型的体内治疗作用，现报道如下。     

10-23脱氧核酶抑制乙型肝炎病毒基因表达的实验研究

目的在细胞水平上探讨10-23脱氧核酶（10—23DRz）成为新型乙型肝炎基因治疗药物的可能性。方法设计合成针对乙型肝炎病毒（HBV）ayw1亚型前C／C区的2031位点的1023DRz，并对其进行硫代磷酸化修饰，同时针对该位点设计一条未硫代化修饰的10—23DRz，经脂质体转染HePG22．2．15细胞（简称2．2．15细胞）中观察其对HBV基因表达的抑制效应。结果修饰与未修饰的1023DRz作用于2．2．15细胞后均可显著抑制乙型肝炎表面抗原（HBsAg）和乙型肝炎e抗原（HBeAg）的表达，最高抑制率分别可达93．75％和90．26％，有效抑制持续时间可达96h，修饰后的脱氧核酶在细胞内对HBsAg和HBeAg表达的抑制作用时间长于未修饰的DRz，其抑制率的最高值低于未修饰的DRz，但两者明显高于作为对照的反义脱氧寡核苷酸。对2．2．15细胞内HBVDNA复制无明显影响，未见明显的细胞毒性作用。结论经过硫代化修饰的1023DRz和未修饰的l023DRz在2．2．15细胞模型中能高效阻断HBVDNA的表达，是一种高度特异性的、高效的基因治疗剂。     

DMSO促进HepG2细胞感染乙型肝炎病毒后核心蛋白入核

目的:探讨DMSO诱导处理的HepG2细胞被HBV感染的作用机制.方法:将HepG2分为DMSO处理组和对照组,分别用添加或不添加2%DMSO的DMEM培养基培养4 d.将HBV病毒颗粒(1000拷贝/细胞)加入培养基中于37℃感染12h.以蛋白免疫印迹,免疫荧光染色及共聚焦显微镜观察HBcAg在细胞内的定位.选择性PCR检测HBV cccDNA,流式细胞分析仪检测细胞周期.结果:对照组HepG2细胞在感染HBV阳性血清后,HBcAg在细胞质内分布,核内呈阴性,至感染后2 d细胞内核心蛋白消失,未检出明显的cccDNA信号.2%DMSO处理后的HepG2细胞感染后12 h细胞质内HBcAg水平明显高于对照组,感染后24 h HBcAg在核周浓集.在感染后24 h和48 h核内HBcAg明显增高,且cccDNA结果阳性.流式分析结果显示DMSO处理后处于G_1/G_0和G_2/M期的HepG2比例升高,处于有丝分裂期的HepG2细胞内HBcAg弥散分布于全细胞.结论:HepG2细胞感染HBV后核心颗粒不能穿过核孔携带HBV DNA进入细胞核可能是其抵制HBV感染的重要原因.DMSO可促进HBV核心颗粒进入细胞核而有助于感染.     

商陆抗病毒蛋白体外抑制乙型肝炎病毒复制的研究

商陆抗病毒蛋白（pokeweed antiviral protein，PAP）是从美洲商陆种子或叶子中提取的一种碱性蛋白，具有抑制流感病毒、脊髓灰质炎病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、HIV等多种病毒复制的作用。我们先前的研究发现：天然PAP种子体外直接作用于HepG2．2．15细胞，显示有较强的抗HBV作用，但在高剂量时对细胞有一定毒性。本研究旨在探讨PAP真核表达质粒体外对HBV的抑制作用。[第一段]     

HBx上调HepG2细胞DNA修复酶hMTH1表达的意义

目的: 探讨DNA氧化损伤修复酶hMTH1在HBx致肝细胞癌发生机制中的作用.方法: 应用HPLC/ECD法检测稳定表达HBx的转基因细胞HepG2/HBx及其对照组HepG2与HepG2/pcDNA3.1细胞中的8-OHdG的含量;并以β-actin为内对照, 应用RT-实时PCR定量检测各组细胞中可水解8-OHdG的DNA修复酶hMTH1的表达.结果: 8-OHdG在He pG2/HBx细胞中的含量(fmol 8-OHdG/mg DNA)显著高于对照组HepG2和HepG2/pDNA3.1细胞(36.5±6.25 vs8.52±1.65, 9.12±2.69, 均P<0.05). DNA修复酶hMTH1在HepG2/HBx细胞中的表达较两对照组细胞明显增高(1.213±0.100 vs 0.087±0.026, 0.112±0.052 hMTH1/β-actin mRNA×100, 均P<0.05).结论: H B x 可能通过诱导氧化应激增加HepG2细胞内DNA氧化损伤产物8-OHdG的含量, 从而反应性上调DNA修复酶hMTH1的表达.     

RNA干扰技术用于抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的 构建针对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和核心抗原的小干扰RNA(siRNA)表达载体pSuper-C，观察其对HepG2 2．2．15细胞(简称2、2．15细胞)中HBV DNA转录和翻译相应蛋白的影响。方法 根据RNA干扰(RNAi)作用原理设计针对HBV核心区的相应序列，再将其克隆入含聚合酶ⅢH1-RNA启动子的真核表达载体pSuper，将此重组质粒以电转染法转入2．2．15细胞中，用酶联免疫吸附法(Abbott试剂)检测培养上清液中HBsAg和e抗原(HBeAg)的表达。结果 经酶切鉴定、电泳和测序分析证明，成功构建了含作用序列的重组质粒pSuper-C；但以电穿孔法转染 2．2．15细胞后末能发现其对2．2．15细胞培养上清液中的HBsAg和HBeAg的表达有影响。结论 RNAi在2．2．15细胞中的作用还需进一步的实验来证实。     

乙型肝炎病毒在HepG2细胞中的稳定复制及表达

目的 建立HBVHepG2肝细胞株，使HBV能长期稳定地表达抗原并复制。方法将含完整转录单位的1．2倍体HBVDNA经Sal1位点克隆入真核表达载体pREP10，构建的重组载体pREP—HBV以Lipofemamine2000转染HepG2细胞，250μg／ml。潮霉素筛选抗性细胞克隆。ELISA检测细胞上清液中的HBsAg和HBeAg。电子显微镜下观察细胞上清液HBV颗粒。制备HBV特异性探针，以Southern印迹法检测细胞株内HBV核心颗粒DNA。结果获得含1．2倍体HBVDNA的重组载体，即pREP—HBV，该重组载体转染HepG2细胞后，获得5株潮霉素抗性细胞RHBV1～RHBV5。均能表达HBsAg和HBeAg。Southern印迹结果显示各株细胞均可见明显的杂交拖带，即存在HBVDNA复制中间体。细胞培养上清液浓缩后在电子显微镜下可见成簇的、直径约42nm的HBV颗粒及直径为22～26nm的球形颗粒。结论 成功建立了HBV稳定复制及表达的HepG2细胞株，目前细胞已传代50次，每3天1次。     

核心启动子部分缺失的乙型肝炎病毒基因的真核克隆及其意义

目的：构建乙型肝炎病毒（HBV）核心启动子（CP）20／21bp部分缺失（nt 1 748/1 747至nt 1 767)及同时存在的A1896点变异真核载体，以进一步研究其对病毒复制与转录的影响。方法：利用线性化的、从CP上游顺序开始的、含完整转录单元的HBV基因克隆（P3．8I质粒）为工具，采用分子克隆、人工定点突变等技术构建估变重组载体。用脂质体法将重组载体转染HepG2细胞，提取细胞内DNA和RNA分别进行Southern blot,Northern blot分析。结果：经聚合酶链反应－限制性片段长度多态性（PCR－RFLP）初步鉴定和测序最终鉴定，突变重组载体构建成功；重组载体转染HepG2细胞后，提取细胞内DNA的Southern blot分析及细胞内RNA的Northern blot分析结果，均提示各变异株较野生株的HBV DNA复制水平及前C／前基因组mRNA、前S／S mRNA转录水平均显著下降。结论：HBV CP 20／21 bp部分缺失株及同时存在的A1896点变异株的病毒复制及转录水平均较野株显著下降。     

乙型肝炎病毒核心蛋白在HepG2.2.15细胞中的亚细胞定位及转移

目的观察HepG2．2．15细胞内HBV核心蛋白的亚细胞定位及转移，了解核心蛋白的入核机制。方法2％二甲亚砜或（和）1μmol／LBay414109处理HepG2．2．15细胞4d；荧光共聚焦显微镜观察HBsAg和HBcAg在细胞内的定位；Westernblot检测胞质和胞核中的HBcAg水平；选择性PCR检测胞核内HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）水平。结果二甲亚砜处理提高了胞质和胞核内的HBcAg表达及核内的cccDNA水平；Bay414109处理后胞质中HBcAg水平下降但胞核中HBcAg水平上升，cccDNA水平下降；联合应用二甲亚砜和Bay41—4109处理后HBsAg在胞质内呈条索状分布，胞质中HBcAg水平下降，但胞核内HBcAg明显上升，cccDNA水平下降。结论HepG2．2．15细胞中存在HBV核心颗粒入核障碍，游离核心蛋白易于通过核孔，二甲亚砜可促进核心蛋白进入细胞核，并有助于cccDNA的形成。     

HepG2与HepG2．2．15细胞中P53表达及细胞生物学活性的差异

目的观察HBV对肝癌细胞生物学活性的影响，探讨HBV导致原发性肝癌发生的机制。方法用Western blot方法检测HepG2细胞以及稳定转染了HBV质粒的HepG2．2．15细胞中P53蛋白的表达情况，观察二种细胞某些生物学活性，如细胞周期、细胞凋亡的差异及细胞生长曲线以及裸鼠成瘤情况。结果HepG2．2．15细胞中P53蛋白表达水平及细胞凋亡率均高于HepG2细胞，细胞周期检测发现处于“S”期的细胞HepG2．2．15多于HepG2，细胞生长曲线显示其生长速度快于HepG2细胞，并且具有成瘤性。结论HBV在细胞内复制对细胞的凋亡与增殖均具有增强作用，其对细胞凋亡的促进作用可能通过使P53稳定性增强，进而使其活性增强。HBV感染的细胞存在凋亡与增殖的抗衡，当细胞增殖占优势时，则易于生成肿瘤。     

商陆抗病毒蛋白体外对HepG2.2.15细胞HBV复制的影响

目的　探讨商陆抗病毒蛋白 (pokeweedantiviralprotein ,PAP)体外抗乙型肝炎病毒 (HBV)的活性。方法　以不同浓度的PAP S作用于培养的HepG2 .2 .15细胞 ,采用ELISA、荧光定量PCR法分别检测细胞上清液中的HBsAg、HBeAg及HBVDNA水平的变化 ,并用MTT比色法检测细胞成活率。结果　随着PAP S浓度的增加 ,对HBsAg、HBVDNA的抑制作用亦逐渐增强 ,不同药物剂量组之间差异十分显著 (P <0 .0 1)。PAP S处理后 96h ,PAP S对HBsAg和HBeAg的半数抑制浓度 (ID50 )分别为 6.9μg/ml和 3 .2 μg/ml ,半数中毒浓度 (CD50 )为 2 9.3 μg/ml,治疗指数 (TI) =ID50 /CD50 分别为 4.3和9.3。MTT试验结果显示 ,药物的细胞毒性也呈剂量依赖型 ,倒置显微镜下观察在 5 0 μg/ml～ 10 0 μg/ml剂量组出现部分细胞脱壁和死亡现象。结论　PAP S在体外有直接的抗HBV作用。。     

QSG-7701和HepG2细胞支持不同乙型肝炎病毒复制模式及其机制

目的研究QSG-7701及HepG2细胞支持HBV复制模式的差异及其内在机制。方法质粒PUC18-HBV1.2转染QSG-7701与HepG2细胞后定量检测细胞上清液中HBV DNA和HBsAg;采用基因芯片技术比较分析二者基因表达差异并用实时定量PCR验证。结果HepG2细胞在转染后6 d内培养上清液可检出HBV DNA及HBsAg,QSG-7701细胞转染后2周内均可检出HBV DNA及HBsAg,且HBV DNA在10 d内保持相对稳定的高水平复制(1×107～3×107拷贝/ml);基因芯片检测结果示QSG-7701细胞中与HBV生活周期相关的因予如HLF、RXRα、IL-6高表达,而HBxIP、SPIK1为低表达,MMP3不表达。结论QSG-7701支持高水平的HBV复制,并可维持cccDNA池的相对稳定,基因差异表达可能为二者支持不同HBV复制模式提供解释。     

乙型肝炎病毒核心蛋白突变体干扰HBV包装的实验研究

目的：构建乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白突变体基因的真核表达载体，转染HepG2细胞，观察其表达及干扰HBV颗粒包装的显性负调节作用。方法：采用PCR从质粒pHBVadrl-A1中扩增HBVadr1-A1中扩增HBV C基因和S基因，分别克隆到pGEM-T载体上，构建成pGEM-T-C和pGEM-T-S，进而构建成pGEM-T-CS载体，用HindⅢ切出克隆基因片段与pcDNA3.1连接，经PCR鉴定后构建成真核表达载体pcDNA3.1^ -CS,DNA测序显示基因融合正确，表达载体转染HepG2细胞，经G418筛选得到高拷贝转化子，逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）检测重组蛋白体外表达，用HBV阳性血清感染HepG2细胞，72h后提提细胞内HBV DNA，斑点杂交法分析各组DNA，结果：核心蛋白突变体在HepG2细胞内得到表达，且表达了该重组蛋白的HepG2细胞内HBV DNA量不同程度地低于对照组，表明重组蛋白具有抗HBV包装的DN突变体作用，结论：HBV核心蛋白与表面蛋白融合基因的真核表达载体pcDNA3.1-CS能够体外表达核心蛋白突变体，该突变体具有干扰HBV颗粒包装的显性负调节作用。