日本血吸虫8k CaBP基因启动子区的克隆与分析

目的 克隆日本血吸虫8kCaBP(Sj8CaBP)基因启动子区并对该序列进行分析。方法 提取日本血吸虫基因组DNA,并按Clontech Universal Genome Walker^TM Kit的操作手册说明,建立日本血吸虫基因组DNA文库。根据手册要求及Sj8CaBP基因的cDNA序列,设计合成该基因染色体步移的特异性引物与试剂盒提供的端子引物进行巢式PCR。将得到的PCR产物克隆测序,测序结果用启动子区的分析软件及与其cDNA序列比对进行分析。结果 得到的Sj8CaBP基因长度为1079bp(GenBank登录号AY262018),该基因包含Sj8CaBP基因完整的开放阅读框(ORF),包括1个内含子及2个外显子,在其5’端UTR区具有明显的启动子区,包括TATA盒及CAAT盒,没有发现GC盒及一些血吸虫基因启动子区所常见的AP-1(Activeprotein1)结合位点。结论 从日本血吸虫基因组文库中获得一个长1079bp的Sj8CaBP基因片段(GenBank登录号为AY262018),经分析证明,该片段包含一个启动子区,具有TATA盒及CAAT盒的结构及1个内含子2个外显子.     

日本血吸虫8k CaBP基因启动子区的克隆与分析

目的克隆日本血吸虫8k CaBP(Sj8CaBP)基因启动子区并对该序列进行分析。方法提取日本血吸虫基因组DNA，并按Clontech Universal Genome Walker^TMKit的操作手册说明，建立日本血吸虫基因组DNA文库。根据手册要求及Sj8CaBP基因的cDNA序列，设计合成该基因染色体步移的特异性引物与试剂盒提供的端子引物进行巢式PCR。将得到的PCR产物克隆测序，测序结果用启动子区的分析软件及与其cDNA序列比对进行分析。结果得到的Sj8CaBP基因长度为1079bp(GenBank登录号AY262018)，该基因包含Sj8CaBP基因完整的开放阅读框(ORF)，包括1个内含子及2个外显子，在其5′端UTR区具有明显的启动子区，包括TATA盒及CAAT盒，没有发现GC盒及一些血吸虫基因启动子区所常见的AP—1(Active protein 1)结合位点。结论从日本血吸虫基因组文库中获得一个长1079bp的Sj8CaBP基因片段(GenBank登录号为AY262018)，经分析证明，该片段包含一个启动子区，具有TATA盒及CAAT盒的结构及1个内含子2个外显子．     

紧密连接蛋白claudin-10基因5′调控区序列的生物信息学分析

目的:研究紧密连接蛋白对claudin-10基因转录调控机制,并对潜在的转录因子结合位点进行分析。方法:利用BLAST比对分析TATA-box、GC-box和CAAT-box;利用在线分析软件Neural NetworkPromoter Prediction、PROMOTERSCAN和PROMOTER2.0分析claudin-10基因5′调控区序列中启动子;利用在线分析软件EMBOSS和CpGIsland Searcher分析claudin-10基因5′调控区序列中CpG岛位置;利用在线分析软件TFSEARCH分析claudin-10基因5′调控区序列中潜在的转录因子结合位点。结果:claudin-10基因5′调控区序列中存在1个CAAT-box和3个GC-box,没有TATA-box;claudin-10基因可能存在4个启动子位点;CpG岛为444bp区间(1700bp-2143bp)或834bp区间(1367bp-2200bp);评分在85分以上时,该区域具有159个潜在的转录因子结合位点;评分在90分以上时,该区域具有48个潜在的转录因子结合位点;评分在95分以上时,该区域具有9个潜在的转录因子结合位点。结论:通过生物信息学的方法对于claudin-10基因转录起始位点、启动子区域和潜在的转录因子结合位点进行预测,对于科研具有十分重要的指导意义,但最终的结论还需要实验来证实。     

紧密连接蛋白claudin-10基因5′调控区序列的生物信息学分析

目的:拟对claudin-10基因转录起始位点和启动子区域进行预测,并对潜在的转录因子结合位点进行分析。方法:利用BLAST比对分析TATA-box、GC-box和CAAT-box;利用在线分析软件Neural Network Promoter Prediction、PROMOTER SCAN和PROMOTER 2.0分析claudin-10基因5′调控区序列中启动子;利用在线分析软件EMBOSS和CpG Island Searcher分析claudin-10基因5′调控区序列中CpG岛位置;利用在线分析软件TFSEARCH分析claudin-10基因5′调控区序列中潜在的转录因子结合位点。结果:claudin-10基因5′调控区序列中存在1个CAAT-box和3个GC-box,没有TATA-box;claudin-10基因可能存在4个启动子位点;CpG岛为444bp区间(1 700～2 143bp)或834bp区间(1 367～2 200bp);评分在85分以上时,该区域具有159个潜在的转录因子结合位点;评分在90分以上时,该区域具有48个潜在的转录因子结合位点;评分在95分以上时,该区域具有9个潜在的转录因子结合位点。结论:通过生物信息学的方法对于claudin-10基因转录起始位点、启动子区域和潜在的转录因子结合位点进行预测,对于科研具有十分重要的指导意义,但最终的结论还需要实验来证实。     

紧密连接蛋白claudin-14基因5'调控区序列的生物信息学分析

目的研究紧密连接蛋白claudin-14基因转录调控机制,并对潜在的转录因子结合位点进行分析。方法利用局部序列比对基本检索工具(BLAST)比对获得claudin-14基因5'调控区序列;利用模序识别分析TATA-box、GC-box和CAAT-box;利用在线分析软件Neural Network Promoter Prediction和PROMOTER 2.0分析claudin-14基因5'调控区序列中启动子;利用在线分析软件EMBOSS和CpG Island Searcher分析claudin-14基因5'调控区序列中CpG岛位置;利用在线分析软件TFSEARCH分析claudin-14基因5'调控区序列中潜在的转录因子结合位点。结果 Claudin-14基因5'调控区序列中存在1个CAAT-box、1个TATA-box和1个GC-box;claudin-14基因可能存在5个启动子位点;CpG岛位于62 bp区间(229～290 bp)、99 bp区间(417～515 bp)、76 bp区间(523～598 bp)、89 bp区间(836～924 bp)、69 bp区间(1 216～1 284 bp)和194 bp区间(1 235～1 428 bp)。评分在85分以上时,该区域有432个潜在的转录因子结合位点;评分在90分以上时,该区域有156个潜在的转录因子结合位点;评分在95分以上时,该区域有66个潜在的转录因子结合位点;评分在100分时,该区域有24个潜在的转录因子结合位点。结论 Claudin-14基因可能存在不同的转录起始位点;claudin-14基因的转录受DNA甲基化和多种转录因子的调控。     

紧密连接蛋白Claudin-15基因5′调控区序列的生物信息学分析

目的:研究紧密连接蛋白Claudin-15基因转录调控机制,并对潜在的转录因子结合位点进行分析。方法:利用BLAST比对获得Claudin-15基因5′调控区序列;利用模序识别分析TATA-box、GC-box和CAAT-box;利用在线分析软件Neural Network Promoter Prediction和PROMOTER 2.0分析Claudin-15基因5′调控区序列中启动子;利用在线分析软件EMBOSS和CpG Island Searcher分析Claudin-15基因5′调控区序列中CpG岛位置;利用在线分析软件TFSEARCH分析Claudin-15基因5′调控区序列中潜在的转录因子结合位点。结果:Claudin-15基因5′调控区序列中存在1个CAAT-box和1个GC-box,没有TATA-box;Caudin-15基因可能存在4个启动子位点;CpG岛为70bp区间(51～120bp)、77bp区间(312～388bp)、72bp区间(2 029～2 100bp)、204bp区间(1 745～1 948bp);结果显示评分在85分以上(Score Threshold:85.0)时,该区域具有470个潜在的转录因子结合位点;评分在90分以上(Score Threshold:90.0)时,该区域具有162个潜在的转录因子结合位点;评分在95分以上(Score Threshold:95.0)时,该区域具有59个潜在的转录因子结合位点;评分在100分(ScoreThreshold:99.0)时,该区域具有14个潜在的转录因子结合位点。结论:通过生物信息学的方法对于Claudin-15基因转录起始位点、启动子区域和潜在的转录因子结合位点进行预测,对于科研具有十分重要的指导意义。     

突触分化诱导基因SynDIG1的5′调控区序列的生物信息学分析

目的:研究突触分化诱导基因SynDIG1转录调控机制,并对潜在的转录因子结合位点进行分析。方法:利用BLAST比对获得SynDIG1基因5′调控区序列;利用模序识别分析TATA-box、GC-box和CAAT-box;利用在线分析软件Neural Network Promoter Prediction和PROMOTER 2.0分析SynDIG1基因5′调控区序列中启动子;利用在线分析软件CpG Island Searcher分析SynDIG1基因5′调控区序列中CpG岛位置;利用在线分析软件TFSEARCH分析SynDIG1基因5′调控区序列中潜在的转录因子结合位点。结果:SynDIG1基因5′调控区序列中存在1个CAAT-box,没有GC-box和TATA-box;SynDIG1基因可能存在5个启动子位点;CpG岛为516bp区间(1 686～2 201bp);结果显示评分在85分以上(Score Threshold:85.0)时,该区域具有406个潜在的转录因子结合位点;评分在90分以上(Score Threshold:90.0)时,该区域具有168个潜在的转录因子结合位点;评分在95分以上(Score Threshold:95.0)时,该区域具有72个潜在的转录因子结合位点;评分在99分以上(ScoreThreshold:99.0)时,该区域具有28个潜在的转录因子结合位点。结论:通过生物信息学的方法对于SynDIG1基因转录起始位点、启动子区域和潜在的转录因子结合位点进行预测,对于科研具有十分重要的指导意义。     

肺癌全细胞高、低转移株中uPA基因启动子的序列和活性

目的　分析人肺巨细胞癌高、低转移株中uPA基因启动子序列差异和这种差异对启动子活性的影响。方法　用PCR分段扩增人肺巨细胞癌高 (95D)和低 (95C)转移细胞株中uPA基因启动子序列 ,将uPA启动子亚克隆到荧光素酶为报告基因的 pGL3 Basic载体上 ,转染 95D或 95C细胞 ,分析启动子活性。 结果　 95D与 95C细胞uPA基因启动子序列中有 3个位点碱基的差别 ,95D分别是 - 1933bp为“T” ,- 4 2 4bp为“C” ,- 96bp为“G” ,而 95C分别为“C”、“T”、“T”。这些不同对启动子活性的影响未见差别。在 - 2 14 3/ - 182 4之间存在uPA基因启动子的增强子序列 ,在 - 182 4 / - 4 0 8之间存在uPA启动子的负性调控序列。结论　uPA在 95D与 95C细胞中表达的差别不是直接由于启动子序列差别引起的 ,而可能是由于两种细胞中存在转录因子量的差别     

含uPA裂解位点的人sTrail融合基因的构建及其原核蛋白表达与纯化

目的构建含尿激酶纤溶酶原激活剂(urokinase plasminogen activator,uPA)裂解位点的人可溶性凋亡诱导配体(soluble related apoptosis inducing ligand,sTrail)基因的原核载体,表达并纯化其融合蛋白sTrail-uPA.方法 RT-PCR法克隆sTrail基因后,经引物延伸法构建his-uPA-sTrail融合基因并亚克隆至原核表达载体pET-32a中,诱导其表达蛋白并将其纯化,肠肽酶(enterokinase,EK)切与再次纯化回收该蛋白,Western blot检测其抗原性.结果表达载体经诱导成功获约38×103含载体表达标签(Trx)的融合蛋白,EK酶切该蛋白获约19.5 ×103的目的蛋白uPA-sTrail.检测表明,该目的蛋白具人Trail抗原性.结论成功克隆uPA-sTrail融合基因并构建至原核表达载体,并获约19.5×103的融合蛋白,且该蛋白具人Trail抗原性.     

uPA/PAI-1在乳腺癌中的表达及其临床意义的研究进展

 恶性肿瘤的侵袭及转移需要细胞外基质（extracellular matrix, ECM)的降解,涉及到很多蛋白水解酶类,其中包括尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase type plasminogen,uPA)系统。uPA系统不仅促进肿瘤的侵袭及转移,还参与癌细胞增殖与肿瘤血管形成。目前,一些研究已证明uPA系统对乳腺癌患者有重要的临床意义,特别是对腋窝淋巴结阴性的患者。本文对uPA/纤溶酶原激活物抑制因子 1(plasminogen inhibitor 1,PAI 1)在乳腺癌中的表达及其临床意义的研究进展作一综述。     

EXPRESSION AND ROLE OF PLASMINOGEN SYSTEM IN PROCESS OF RESTENOSIS

Objective To study the expression and role of plasminogen system in the process of restenosis. Methods We established a double-injury model of atherosclerotic restenosis in rabbit iliac artery mimicking human arterial restenosis. The time course of tissue plaminogen activator （ tPA ）, urokinase plasminogen activator （ uPA ）, urokinase plasminogen activator receptor （uPAR） and plasminogen activator inhibitor-1 （ PAI-1 ） was investigated by immunohistochemistry. The mRNA expression of uPA and uPAR were detected after vascular procedures by in situ hybridization. Results In uninjured arteries, the weak expression of tPA and PAI-1 was detected in intimal and endothelial cells. The expression of tPA, uPA, uPAR and PAI-1 was significantly induced after double-injury, but after double-injury 14d, the expression of tPA restore to preinjury levels. The expression of uPA and uPAR in intimal was higher than that of media and maintain high levels in intimal within 42d and 56d. Conclusion Whereas t-PA is primarily involved in clot dissolution and play a limited role in the process of restenosis, in plasminogen system, uPA and uPAR play a prominent role in the process of restenosis.     

Gene expression of fibrinolytic factors urokinase plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor-1 in rabbit temporo-mandibular joint cartilage with disc displacement

Background The urokinase plasminogen activator system is believed to play an important role in degradation of the extracellular matrix associated with cartilage and bone destruction; however its precise roles in temporomandibular disorders have not yet been clarified. The aims of this study were to investigate the gene expression of fibrinolytic factors urokinase plasminogen activator (uPA) and plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1) in the articular cartilage of rabbit temporomandibular joint (TMJ) with disc displacement (DD) and to probe the relationship between fibrinolytic activity and cartilage remodeling.Methods Disc displacement of right joints was performed in 36 of 78 rabbits under investigation. The animals were sacrificed at 4 days and 1, 2, 4, 8 and 12 weeks after surgery, respectively. The right joints of these animals were harvested and processed for the examination of mRNA expression of uPA and PAI-1 in articular cartilage using in situ hybridization techniques.Results The expression of uPA and PAI-1 was co-expressed weakly in the chondrocytes from transitive zone to hypertrophic zone and mineralized zone, while no hybridizing signals were shown in proliferative zone and superficial zone in control rabbits. The most striking was the up-regulation of uPA and PAI-1 mRNA in 4-day rabbits postoperatively at the onset of cartilage degeneration. The strongest hybridizing signals for uPA and PAI-1 were seen in 2-week rabbits postoperatively. After 2 weeks, the expression of uPA and PAI-1 began to decrease and reached nearly normal level at 12 weeks.Conclusions The expression of the uPA/PAI-1 system coincides with the pathological changes in condylar cartilage after DD. The uPA/PAI-1 system may be one of the essential mediators in articular cartilage remodeling.     

腺病毒介导人uPA感染大鼠间充质干细胞的体外研究

目的体外分选与鉴定大鼠骨髓间充质于细胞（MSCs）,并用腺病毒介导的人尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）体外感染原代MSCs,观察病毒的转导效率及对MSCs增殖的影响。方法通过黏附培养分离纯化MSCs,并采用免疫组化DAB显色法鉴定;荧光显微镜检测uPA的转染效率;Western blotting检测uPA在MSCs中的表达;MTT法检测病毒对MSCs增殖的影响。结果分选培养的MSCs呈典型的间充质干细胞生长形态,细胞表面标记物CD29和CD90阳性,CD34和CD45阴性;随着病毒感染滴度增高,绿色荧光蛋白（GFP）的表达率亦呈增高趋势。当感染复数（MOI）=80且病毒转导72h后,GFP阳性细胞数占细胞总数的比例达（94．0±1．5）％,可稳定表达7d以上,且对MSCs的增殖无明显影响。结论MSCs是一种理想的基因过表达载体,稳定分泌uPA蛋白,可用于肝纤维化的研究。     

组蛋白去乙酰化酶1基因沉默对人卵巢癌SKOV3细胞迁移及侵袭能力的影响

目的：观察组蛋白去乙酰化酶1（HDACl）基因沉默对人卵巢癌SKOV3细胞迁移及侵袭能力的影响.方法：体外合成针对HDAC1的小干扰RNA （siRNA）,利用脂质体转染入人卵巢癌SKOV3细胞;通过Western blot方法检测细胞内HDAC1蛋白和乙酰化组蛋白H4（Ac-H4）的表达,利用荧光定量PCR方法检测HDAC1、尿激酶型纤溶酶原激活因子（uPA）和尿激酶型纤溶酶原激活因子受体（uPAR）基因的mRNA表达;通过划痕实验检测细胞迁移能力,利用Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力.结果：经转染HDAC1基因siRNA后,卵巢癌SKOV3细胞HDAC1基因mRNA和蛋白表达水平均下调,细胞内组蛋白H4乙酰化水平增加;SKOV3细胞迁移速度降低,穿过Transwell滤膜的细胞数量减少;SKOV3细胞内uPA和uPAR基因mRNA表达也降低.结论：HDAC1基因沉默能够抑制人卵巢癌SKOV3细胞迁移和侵袭能力,机制可能与增加组蛋白乙酰化水平、抑制uPA和uPAR基因表达有关.     

血浆uPA、PAI-1和其4G/5G多态性与鼻咽癌临床分期关系

目的 探讨尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）、纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1）的血浆浓度和PAI-1基因启动子区4G/5G多态性与鼻咽癌临床分期的相关性。方法 收集86例鼻咽癌患者血液标本,35例健康人血液标本作对照。所有标本均采用用酶联免疫吸附法（ELISA法）检测uPA和PAI-1的血浆浓度,微量法提取DNA,采用等位基因特异性引物PCR分析PAI-1基因启动子4G/5G多态性。结果 与正常对照组相比,鼻咽癌组血浆uPA浓度明显升高（P<0.05）,而血浆PAI-1浓度显著降低（P<0.05）,上述效应和临床分期具有显著相关性;PAI-1启动子区4G和5G基因频率与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。结论 鼻咽癌的临床分期和恶性程度和血浆uPA浓度呈正相关,与PAI-1浓度呈负相关;PAI-1基因4G/5G多态性与鼻咽癌没有相关性。     

迟发性阿尔茨海默病患者血清尿激酶型纤溶酶原激活因子浓度的测定及其意义

目的探讨血清尿激酶型纤溶酶原激活因子(urokinase-type plasminogen activator,uPA)浓度与迟发型阿尔茨海默病(late-onset Alzheimer's disease,LOAD)的关系。方法采用酶联免疫吸附法测定55例LOAD患者和61例正常对照者外周血清uPA的浓度,并通过聚合酶链反应限制性片段长度多态性方法对所有病例进行plau基因P141L多态性基因分型,进一步对不同基因型的uPA浓度进行分层分析。结果病例组与对照组,血清uPA浓度差异无统计学意义(P>0.05),轻度、中-重度LOAD组及对照组3组血清uPA的浓度比较差异也无统计学意义(P>0.05);基因型C/C组与C/T组血清uPA浓度显著高于T/T组,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 LOAD患者外周血清uPA的浓度不能作为AD诊断的标志物,也不能反映患者痴呆的程度;plau基因第6外显子上的错义C→T突变可减少血清uPA的浓度,对探讨AD的发病机制提供新思路。     

uPA和PAI-1基因克隆及真核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆人卵巢上皮癌组织uPA和PAI-1基因cDNA全长,构建表达uPA和PAI-1基因的真核表达载体。方法：采用RT-PCR技术从人卵巢上皮癌组织总RNA中逆转录uPA和PAI-1基因的cDNA全长,克隆到pGEM-TEasy Vector上,通过酶切和测序进行鉴定;酶切后与真核表达载体pcDNA3.1/myc-his（-）B连接,酶切及测序再次鉴定;采用脂质体法将重组质粒DNA转染至卵巢癌上皮细胞SKOV3细胞;采用有限稀释法和G418分别加压筛选并培养SKOV3-uPA和SKOV3-PAI-1细胞及对照细胞;Western blot法检测转染前后SKOV3细胞uPA和PAI-1基因的表达。结果：成功扩增出uPA和PAI-1基因的cDNA的全长,并克隆入T载体,DNA测序证实序列正确,通过连接成功构建含正确目的基因的表达载体pcDNA3.1-uPA和pcDNA3.1-PAI-1,Western blot能检测到uPA和PAI-1基因蛋白分别在SKOV3-uPA和SKOV3-PAI-1细胞中的表达。结论：成功构建了uPA和PAI-1表达基因的真核表达载体,为进一步研究uPA和PAI-1基因在卵巢癌侵袭转移中的作用提供了实验基础。     

uPA及其受体激活与血管重建后再狭窄

尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及其受体(uPAR)在血管壁中是一类多功能物质,在血管重建再狭窄中uPA与uPAR可以促进血管平滑肌细胞VSMC黏附和迁移,增强VSMC增殖和血管内膜增生,并可调控血管重建后血管收缩性重塑。因此,针对其在血管重建后血管内膜中的过度表达进行干预,将可能成为一个有前途的治疗手段。     

针对尿激酶型纤溶酶原激活剂的siRNA的载体构建与表达

目的:构建针对尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)mRNA的siRNA的表达载体,并观察其对转染细胞中的uPA表达的抑制作用. 方法:化学合成用于产生针对uPA的发卡状RNA的寡核苷酸,各64个碱基,退火后插入线性化的pSUPER载体的H1启动子下游. 重组载体经限制性酶切和测序. 把构建的载体转染乳腺癌细胞系MDA-MB 231,观察其对uPA的干扰作用. 结果:限制性酶切和序列测定表明成功构建了可以表达针对uPA的发卡状RNA表达载体,该载体表达的发卡状RNA能够有效的下调uPA的表达. 结论:成功的构建了针对uPA的发卡状RNA表达载体,为进一步研究uPA的功能和肿瘤的基因治疗打下基础.